苏云金芽胞杆菌GS8菌株的生物学特性及其cry基因型鉴定

采用桑叶浸渍法和饲料表面覆盖法测定发现,从土壤中分离的一株苏云金芽胞杆菌菌株GS8对家蚕Bombyx mori、甜菜夜蛾Spodoptera exigua和棉铃虫Helicoverpa armigera初孵幼虫均表现出较高的杀虫活性,经形态学和生理生化反应鉴定该菌株为东北亚种(Bacillus thuringiensis subsp.tohokuensis)。聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析结果表明,GS8菌株的杀虫蛋白晶体主要由分子质量为130、81和60 kDa的蛋白组成。聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定结果显示,GS8菌株含有 cry1Aa、cry1Ab、cry1Ib、cry2Ab和cry9Ba 等基因。     

对甜菜夜蛾具有高毒力的Bt菌株筛选

依据对夜蛾科具有高毒力cry基因的序列,设计特异性引物对实验室保存的对鳞翅目害虫高效的菌株资源进行筛选。通过比较质粒图谱,对其多样性进行了研究。进一步测定Bt菌株对甜菜夜蛾的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株。从192株菌株中筛选出15株对夜蛾科害虫具有高活性的菌株,包含的基因类型有:cry1A、cry1C、cry2A、cry9和vip3A类基因,晶体形态包含:双锥体形、方形、球形;其中2株菌表达130ku和60ku的蛋白,1株菌表达130ku和70ku的蛋白,其余菌株均表达约130ku的蛋白;这15株菌通过质粒图谱分析分为8种类型;3株菌对甜菜夜蛾幼虫具有高毒力,其中菌株PS3-C2对甜菜夜蛾LC50为1.87μg/mL。本研究成功筛选出对甜菜夜蛾具有高毒力的菌株3株,其中PS3-C2菌株与对照菌株KN11活性相当,为新型杀虫基因分离克隆与制剂的研发奠定了基础。     

北京植物园苏云金芽胞杆菌菌株的分离鉴定

[目的]从北京植物园采集的土壤样品中分离高毒力的苏云金芽胞杆菌.[方法]采用温度法筛选Bt菌株,比对大质粒DNA图谱,区分不同类型的Bt菌株,PCR-RFLP方法对cry1～cry40类基因型进行鉴定,SDS-PAGE分析杀虫晶体蛋白,测定Bt分离株对大猿叶甲、小菜蛾幼虫的杀虫活性,筛选出高毒力的菌株.[结果]从149份土壤样品中分离出147株Bt,分为12种类型,含有菱形、方形、球形和不规则等晶体类型;6株菌中分别含有fry1Aa、cry1Ab、cry1Ac、cy1Ah、cry1Ba、cry1Be、cry1Ia、cry1La、cry2Ab和cry7Aa等基因类型,其余6株中不含有已知基因.有9株表达约130 ku蛋白,1株表达约70 ku蛋白,2株表达约150 ku蛋白,有3株既表达130 ku蛋白又表达60 ku蛋白;发现一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株ZWY-7,1株对小菜蛾有高毒力的菌株ZWY-9,2株菌都没有检测到已知基因型.[结论]北京植物园中Bt分布广泛,类型多样,其中发现两株高毒力的菌株,有望获得新的杀虫基因.     

小菜蛾Btk抗性品系对四种Bt杀虫晶体蛋白抗性发展的研究

使用苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种（Btk）可湿性粉剂对小菜蛾进行继代汰选获得F80代和F100代抗性品系。通过分别测定Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah和Cry1Ca四种杀虫晶体蛋白对小菜蛾Btk抗性品系F80代和F100代的室内毒力,明确了小菜蛾Btk抗性品系对四种Bt杀虫晶体蛋白抗性发展规律。研究结果表明,汰选至F80代时,Cry1Ca对小菜蛾的毒力最高,LC50约12.1mg/L,其次为Cry1Ac,LC50约47.7mg/L;而汰选至F100代时,仍以Cry1Ca对小菜蛾的毒力最高,LC50约21.4 mg/L,其次为Cry1Ab,LC50约72.2 mg/L。与相对敏感品系相比,小菜蛾抗性品系对Cry1Ac的抗性发展较快（抗性倍数高达67.3～106.8倍）,对Cry1Ab的次之（抗性倍数高达60.0～66.1倍）,而对Cry1Ca和Cry1Ah的抗性发展较慢（抗性倍数分别为3.4～6.0倍和1.6～2.5倍）。以上结果说明,在主效杀虫基因为Cry1Ac的Btk药剂选择压力下,小菜蛾对四种Bt杀虫晶体蛋白的抗性发展速度差异较大,且Cry1Ac和Cry1Ab存在交互抗性风险...     

对半翅目害虫具有活性的Bt杀虫蛋白研究进展

半翅目害虫寄主范围广、危害时间长, 给我国农林业生产带来了严重的经济损失。应用有效的绿色防控手段替代化学杀虫剂防治半翅目害虫, 对于保障粮食安全生产、保护动物及人类生命健康、维护生态平衡具有重要意义。苏云金芽胞杆菌Bacillus thuringiensis产生的杀虫蛋白对多种害虫展现出高效特异的杀虫活性, 对非靶标生物安全, 为全球农业、林业和卫生害虫的绿色防控做出了突出贡献。本文综述了我国农林业中重要的半翅目害虫种类、危害特点及主要防治手段, 重点归纳了Bt杀虫蛋白对半翅目害虫的杀虫活性研究进展以及挖掘具有半翅目杀虫活性的Bt杀虫蛋白基础, 并针对Bt杀虫蛋白在半翅目害虫绿色防控方面的应用提出了建议。     

对甜菜夜蛾具有杀虫活性的Bt菌株cry1Ca基因研究

根据已报道的14个cry1Ca基因,设计能够扩增cry1Ca全长基因的简并引物。利用该引物对本实验室分离的472株Bt菌株进行筛选。PCR扩增发现22株菌含有cry1Ca基因。对22株菌株进行cry基因多样性分析,结果获得5种类型酶切图谱,表明这些菌株分为5种类型。SDS-PAGE结果显示22株菌均表达约130ku的蛋白。Western Blotting结果证实这些株菌中cry1Ca基因均正常表达。提取菌株的晶体蛋白,经胰蛋白酶活化,对甜菜夜蛾[Spodoptera exigua(Hübner)]进行初步生测,结果表明22株菌中活化的Cry蛋白对甜菜夜蛾均表现出很强的毒杀作用。进一步从5个类型的菌中各挑选一株毒力较高的菌株进行LC_(50)的测定,结果证实它们均具有很高毒力,其中,T1-E12(0.087μg/g)、B16-C8(0.103μg/g)、T1-B8(0.202μg/g)的活性与阳性对照菌株G03(0.090μg/g)相当,具有生产应用潜力。本研究为新型高效Bt菌株的挖掘奠定了基础。     

对黏虫具有杀虫活性的Bt蛋白筛选及分析

为筛选对黏虫[Mythimna separata(Walker)]具有毒杀作用的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白,本研究提取Cry1类、Cry2类、Cry9类及Vip3A类等11种蛋白,通过人工饲料喂毒方法对黏虫进行生物活性测定。结果表明,Cry1Ac、Cry1Ab、Cry2Ab、Cry1Be及Cry1Bb蛋白对黏虫具有杀虫活性,其致死中浓度依次为5.09、17.71、26.75、27.42及43.93μg/g;Cry9Aa、Cry9Eb、Cry9Ee蛋白对黏虫生长具有抑制作用,其浓度为10μg/g时的体重抑制率分别为78.4%、79.0%、86.9%,浓度为100μg/g时的体重抑制率分别为92.8%、95.7%、96.7%;Cry1Ba、Cry1Ca和Vip3Aa蛋白对黏虫无显著活性。本研究为黏虫的生物防治奠定了基础,并为抗虫转基因作物的研究提供优良的候选基因。     

Bt营养期杀虫蛋白Vip3及其作用受体的研究进展

营养期杀虫蛋白Vip3是苏云金芽胞杆菌在对数生长中期开始分泌表达的一类对鳞翅目害虫具有广谱杀虫活性的蛋白质,它与已知的杀虫晶体蛋白相似性很低。本文主要从Vip3基因的挖掘,Vip3蛋白的特性、作用受体及其应用等方面作简要综述。     

对葱黄寡毛跳甲高毒力Bt菌株的鉴定及效果评价

本研究筛选到一株对葱黄寡毛跳甲具有较高杀虫活性的菌株DK49,利用菌株DK49 gyrB基因序列和phoR基因序列分别在GenBank中进行同源性比较,两种基因序列均与苏云金芽胞杆菌的相应基因序列同源性最高,达到99%;同时分别构建系统发育树,发现菌株DK49均与苏云金芽胞杆菌聚合在一起,说明菌株DK49属于苏云金芽胞杆菌。Biolog表型分析结果显示菌株DK49可有效利用14种碳源,对二甲胺四环素等10种化学物质敏感,对利福霉素等11种化学物质不敏感。通过室内生物活性评价,明确菌株DK49对葱黄寡毛跳甲成虫3 d的LC₅₀为0.8161×10⁷ cfu/mL。田间小区结果显示,菌株DK49在1×10⁷ cfu/mL浓度下,连续施药3次后对葱黄寡毛跳甲的虫口减退率达到92.31%,防治效果达到96.81%。可见,菌株DK49能有效地控制葱黄寡毛跳甲的发生为害,具有良好的应用前景。     

杀线虫苏云金芽胞杆菌菌株YC-10的分离鉴定及活性测定

自烟草中分离获得对南方根结线虫Meloidogyneincognita具有较高杀线活性的拮抗细菌菌株YC-10。研究发现该菌株有伴胞晶体产生,菌体、芽胞形态及生理生化特性与苏云金芽胞杆菌库斯塔克亚种B．thuringiensissubsp．kurstaki相似,16srDNA序列分析表明其与苏云金芽胞杆菌相似性最高,初步确定该菌株为苏云金芽胞杆菌。菌株发酵液及伴胞晶体蛋白对南方根结线虫J2有很强的杀线活性,发酵液处理南方根结线虫,24h线虫死亡率为100％;伴胞晶体蛋白处理南方根结线虫,24h的LC50为5．86μg．mL^-1。研究结果显示该菌株在线虫生物防治上有较大的应用潜力。     

苏云金杆菌高毒力菌株4．0718的快速选育

从湖南省不同生态区域的旱作地，果园和稻园采集的858份土样中，分离筛选出苏云金杆菌30株。选取一株具典型苏云金杆菌菌落特征和较高杀虫毒力的菌株701^2c为出发菌株，经紫外线和两次亚硝基胍的交替复合诱变，显微涂片染色镜检，发现菌体的伴孢晶体的形状、大小、数量及芽孢与伴孢晶体的比例与杀虫菌株4．0718。该突变株杀虫毒力与原始菌株相比提高了7．5倍，在6、12和24h内供试小菜蛾三龄幼虫死亡率分别高达20％、97％和100％。此菌株的高效速效杀虫毒力经连续10代培养能稳定遗传。     

苏云金芽孢杆菌cry基因在大肠杆菌中表达产物和生物活性

研究了几种Bt cry基因于大肠杆菌(Escherichia coli)中表达产物在pH 10.0的50mmol/L碳酸钠和20mmol/L乙醇胺溶解液中的溶解性 ,发现同样的Cry蛋白在碳酸钠中的溶解度大于乙醇胺。通过胰蛋白酶消化 ,明确Cry1Ca7、Cry1Ia8酶解产物为 38kD多肽 ;Cry1Ie1、Cry1Cb2、Cry2Ab4酶解产物为 41kD多肽 ;Cry1Ac酶解产物为60kD多肽。采用FPLC层析方法对 6种原毒素及其酶解后得到的毒素多肽进行了分离纯化 ,比较了原毒素和毒素的杀虫活性的差异。其结果表明 ,Cry1Ac的原毒素和毒素对棉铃虫初孵幼虫的校正死亡率均为 100% ,Cry2Ab4的原毒素的毒力高于其酶解毒素。     

苏云金芽孢杆菌Cry1Ie1蛋白末端缺失的研究

通过PCR扩增法 ,以cry1Ie1全长基因为模板 ,分别得到不同末端缺失的基因片段 ,转化大肠杆菌BL21(DE3)中诱导表达 ,得到 6种末端缺失蛋白。对小菜蛾生物测定结果表明 ,缺失蛋白IE659、IE656分别缺失了C末端60个和63个氨基酸残基 ,对小菜蛾的杀虫活性与Cry1Ie1全长蛋白相当 ;IE648、IE045分别缺失了C末端 71个氨基酸残基和N末端缺失44个、C末端缺失63个氨基酸残基 ,对小菜蛾的活性提高了50% ;IE633、IE105分别缺失了C末端 86个氨基酸残基和N末端缺失 104个、C末端63个氨基酸残基 ,丧失了对小菜蛾的活性。试验明确Cry1Ie1蛋白的最小活性区N端在45～104氨基酸位点之间 ,C端在633～648氨基酸位点之间。     

椰子织蛾幼虫致病Bt菌的鉴定与杀虫活性测定

从海南省五指山采集的椰子织蛾僵虫上分离得到一株对椰子织蛾幼虫具有毒杀作用的菌株WZS171并对其生物防治潜力进行评测。通过形态学、cry基因的鉴定明确了该菌株为苏云金芽胞杆菌(Bt)。基因鉴定结果表明该菌株含有cry1Aa13、cry1Gb1、cry1D、cry1Ia、cry2Af共5种新型cry基因,NCBI Blast与GenBank中已知基因序列最大相似性分别为98%、99%、90%、92%、99%;生测结果表明72 h后该菌株菌悬液对椰子织蛾幼虫的LC₅₀为9.08 μg/mL,95%置信区间6.72~12.26 μg/mL。该菌株含有5种新型的杀虫编码基因,并且对椰子织蛾幼虫具有较高毒力,生物防治潜力大。     

桂林喀斯特地貌分布区苏云金芽孢杆菌菌株的分离鉴定

从桂林喀斯特地貌分布区采集了165份天然土壤样品,从中分离出10株苏云金芽孢杆菌。光学显微镜观察发现有菱形、球形、不规则等晶体类型。通过核酸电泳比对其大质粒DNA的图谱来区分菌株的类型,发现该批菌株有良好的多样性。对这10株菌进行cry1、cry11、cry2、cry3、cry4、cry5、cry6、cry7、cry8、cry9、cry10类基因的PCR-RFLP鉴定,在8株菌中分别发现含有cry1、cry11、cry2、cry3等基因类型,而G4、G6菌株中不含有已知基因。SDS-PAGE分析了10株野生菌株的杀虫晶体蛋白表达谱,发现有10株表达约130kD蛋白,有3株既表达130kD蛋白又表达60kD蛋白。对大猿叶甲、小菜蛾进行了杀虫活性测定,发现了一株对大猿叶甲具有较高毒力的菌株G8,其LC50为48.2μg/ml,置信区间为9.6～1.4ml;有6株菌株对小菜蛾有高活性。     

50000 IU/mg苏云金芽胞杆菌NBIV-330可湿性粉剂的研究与应用

湖北省生物农药工程研究中心针对抗性小菜蛾筛选获得高毒力菌株苏云金芽胞杆菌（NBIV-330）,制备出50000 IU/mg苏云金芽胞杆菌NBIV-330可湿性粉剂。该产品用于防治抗性小菜蛾,每亩用量30～50 g,药后3 d防治效果达到85%以上。     

云南小菜蛾对Bt的抗药性及盆栽药效评价

2008-2012年, 采用浸叶法连续5年测定了云南省2个主要蔬菜种植区通海县和弥渡县的小菜蛾田间种群对Bt制剂的抗药性,并进行了盆栽药效评价。结果表明,两地区小菜蛾对Bt制剂均表现为低抗或无抗性,抗药性无明显上升趋势。比较了在光照培养箱和自然条件下3种不同Bt制剂对通海和弥渡县小菜蛾盆栽药效,药后第5天通海和弥渡小菜蛾种群在恒温（25±1 ℃,RH65%~70%）和自然条件下(12~28 ℃,RH50%~75%)的校正死亡率分别为88.3%~95.5%和80.2%~90.6%、78.8%~89.1%和73.4%~85.7%,两者差异不显著。云南小菜蛾种群对Bt制剂均有较高的敏感性,可在十字花科蔬菜生产中有选择地使用。     

苏云金芽胞杆菌杀虫晶体蛋白Cry1D新基因的克隆与特性

为扩充鳞翅目害虫杀虫基因资源,本研究从苏云金芽胞杆菌BN23-5中克隆得到一个新的cry基因,并对其进行鉴定和分析。该基因为一个完整的cry1D基因,全长3501 bp,编码1166个氨基酸残基。该氨基酸序列是一个新的Cry氨基酸序列,与Cry1Db1的同源性最高,为86%,命名为Cry1Dd1（登录号为KJ728844）。将该基因插入穿梭表达载体pSTK中,转入BT无晶体突变株HD73^-中进行表达。结果表明,cry1Dd1基因能在BT无晶体突变株中表达,并形成菱形伴孢晶体。SDS-PAGE验证其分子量为132.2 kD,与预测的大小相符。生物活性测定表明,Cry1Dd1晶体蛋白对小菜蛾的幼虫具有杀虫活性,LC₅₀为13.1 μg/mL;能明显抑制甜菜夜蛾幼虫的生长;但对棉铃虫幼虫没有杀虫活性。对cry1Dd1基因序列进行分析,cry1Dd1包含8个block保守区域,这和目前其他的cry基因相似;Cry1Dd1蛋白的活性区域为N端的37~593位氨基酸残基。