表达绿色荧光蛋白的MVA重组毒株的构建及筛选

为了构建及筛选表达绿色荧光蛋白（GFP）的改良型痘苗病毒安卡拉（MVA）重组毒株,并对其进行鉴定,本研究基于同源重组原理设计引物,通过PCR扩增获取含有MVA两侧同源臂的外源基因GFP片段,将GFP基因片段转染到感染了MVA的CEF细胞中使之同源重组到MVA ORF086-087位点（基因组中70303-70304 bp之间）,利用倒置荧光显微镜观察并标记表达GFP的单个噬斑,筛选获取重组毒株,应用倒置荧光技术、PCR及Western blotting对该重组毒株进行鉴定。结果显示,经过3轮噬斑筛选,在倒置荧光显微镜下可观察到大量表达GFP的单个噬斑,PCR扩增检测结果表明目的基因已成功整合到重组毒株MVA-GFP中。Western blotting结果表明,GFP在感染的细胞内成功表达。本研究利用基因工程技术成功获得表达GFP的重组毒株MVA-GFP,可为进一步将其他抗原基因插入GFP位点中筛选无标记的重组毒株及疫苗研究提供材料。     

融合标记基因NPTⅡ∷GFP在柑橘遗传转化中筛选效率的研究

绿色荧光蛋白（GFP）基因和新霉素磷酸转移酶（NPTⅡ）基因被广泛应用于植物的遗传转化中。为了研究融合标记基因NPTⅡ::GFP在柑橘遗传转化中的筛选效率,本实验将CaMV35S组成型启动子驱动的nptⅡ∷GFP融合标记基因表达载体pNGM和由CaMV35S启动子分别驱动NPTⅡ、GFP两个基因的表达载体pNPTII-GF经农杆菌介导法转化锦橙上胚轴。GFP绿色荧光检测结果显示,GFP在转NPTⅡ∷GFP融合基因植株中强烈表达,荧光强度与非融合GFP转基因植株的表达水平相当。NPTⅡ∷GFP融合标记基因对锦橙的转化效率为10.8%,与非融合NPTⅡ基因的转化效率（11.0%）没有明显差异。研究结果表明,NPTⅡ∷GFP融合标记基因是一个有效的柑桔遗传转化筛选标记基因。     

表达绿色荧光蛋白的MVA重组毒株的构建及筛选

为了构建及筛选表达绿色荧光蛋白(GFP)的改良型痘苗病毒安卡拉(MVA)重组毒株,并对其进行鉴定,本研究基于同源重组原理设计引物,通过PCR扩增获取含有MVA两侧同源臂的外源基因GFP片段,将GFP基因片段转染到感染了MVA的CEF细胞中使之同源重组到MVA ORF086-087位点(基因组中70303-70304 bp之间),利用倒置荧光显微镜观察并标记表达GFP的单个噬斑,筛选获取重组毒株,应用倒置荧光技术、PCR及Western blotting对该重组毒株进行鉴定。结果显示,经过3轮噬斑筛选,在倒置荧光显微镜下可观察到大量表达GFP的单个噬斑,PCR扩增检测结果表明目的基因已成功整合到重组毒株MVA-GFP中。Western blotting结果表明,GFP在感染的细胞内成功表达。本研究利用基因工程技术成功获得表达GFP的重组毒株MVA-GFP,可为进一步将其他抗原基因插入GFP位点中筛选无标记的重组毒株及疫苗研究提供材料。     

绿色荧光蛋白研究进展

来源于海洋多管水母属的绿色荧光蛋白(GFP)基因是目前惟一在细胞内稳定表达,在蓝光或长紫外光的激发下,不需要任何反应底物及其他辅助因子就能发出绿色荧光的新型报告基因,无种属、组织和位置特异性,且能监测基因表达、信号转导、共转染、蛋白运输与定位,以及细胞系谱分类等。GFP对细胞无毒性,且检测方法简单,结果真实可靠,目前在多种原核和真核生物研究中得到广泛的应用。文章就GFP的生化特性、GFP的改进及其在分子生物学研究中的应用潜力进行简要阐述。     

韩国“孵”出能发光的鸡——可从鸡蛋中分离转基因蛋白质

韩国研究机构全球首次培育成功转基因荧光鸡,使转基因鸡蛋在食品、制药等领域的大规模应用更近了一步。大邱基督教大学医学院教授金泰完7月12日宣布了这一成果。转基因荧光鸡的体内植入了水母的绿色荧光蛋白(GFP),在普通光线下与其他鸡无异,在紫外线照射下,喙和羽毛发出明亮的绿色荧光。金教授表示,GFP在鸡的孵化过程中表现出某种毒性,影响胚胎的发育,此次培育成功的转基因荧光鸡属于全球首例。GFP基因是一种标志基因,带有该基因的物种会发生荧光反应。GFP往往与其他物种的功能基因一起植入试验物种的细胞,转基因得到的新物种如果出现…     

绿色荧光蛋白(GFP）在分子遗传学上的研究进展

作为一种新型、方便的报告基因，来自多管水母属的绿色荧光蛋白（GFP）具有很多理想特性。如当受到蓝光或紫外光照射时，能够发出明亮的绿色荧光，且这种荧光不需要外源底物和辅因子，因此，它的表达可用于监测活的生物体中的基因表达和蛋白质定位，在分子生物学中有着广泛的应用前景。     

伪狂犬病病毒上海株gE基因克隆及其含GFP基因质粒载体的构建

根据已发表的伪狂犬病病毒（PRV）gE基因序列设计1对引物，用PCR法扩增了PRV上海株（PRV-SH）的gE基因，并克隆入pUC18中。利用gE基因中限制性酶切位点，把绿色荧光蛋白（GFP）的基因表达盒插入gE基因中，构建了含GFP的载体pUCgE-GFP。     

携带绿色荧光蛋白基因重组猫泛白细胞减少症病毒的拯救

本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的重组猫泛白细胞减少症病毒(feline panleukopenia virus,FPV),以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的GFP基因,并对pFPV质粒进行定点突变,从而获得AgeⅠ和NheⅠ酶切位点,然后用AgeⅠ和NheⅠ同时双酶切pFPV和GFP基因,经4℃过夜连接、转化,成功构建携带GFP基因的重组猫泛白细胞减少症病毒质粒pFPV-GFP,应用脂质体转染法将重组质粒pFPV-GFP导入猫肾细胞(F81),利用GFP独特的发光机制可在荧光显微镜下对标记的重组病毒rFPV-GFP进行细胞内活体观察,利用Western blotting鉴定重组病毒rFPV-GFP中GFP的表达情况。结果显示,重组质粒pFPV-GFP转染F81细胞24 h时可观察到绿色荧光蛋白,且随着转染时间的延长观察到的绿色荧光蛋白数量增多,说明重组质粒pFPV-GFP成功转染到F81细胞中,Western blotting鉴定出GFP在重组病毒rFPV-GFP中稳定表达。本研究通过在pFPV上成功插入GFP并拯救出病毒,说明pFPV上可以插入外源基因,为其他外源基因在pFPV上的插入奠定基础,同时GFP的插入为FPV的研究提供了更加有利的研究工具,为FPV的基础研究以及中和抗体的快速检测奠定基础。     

携带绿色荧光蛋白基因重组猫泛白细胞减少症病毒的拯救

本研究旨在构建携带绿色荧光蛋白（green fluorescent protein,GFP）的重组猫泛白细胞减少症病毒（feline panleukopenia virus,FPV）,以便更快速有效的检测中和抗体。参照GenBank中GFP基因序列设计特异性引物,应用PCR技术扩增获得携带AgeⅠ和NheⅠ酶切位点的GFP基因,并对pFPV质粒进行定点突变,从而获得AgeⅠ和Nhe Ⅰ酶切位点,然后用AgeⅠ和Nhe Ⅰ同时双酶切pFPV和GFP基因,经4 ℃过夜连接、转化,成功构建携带GFP基因的重组猫泛白细胞减少症病毒质粒pFPV-GFP,应用脂质体转染法将重组质粒pFPV-GFP导入猫肾细胞（F81）,利用GFP独特的发光机制可在荧光显微镜下对标记的重组病毒rFPV-GFP进行细胞内活体观察,利用Western blotting鉴定重组病毒rFPV-GFP中GFP的表达情况。结果显示,重组质粒pFPV-GFP转染F81细胞24 h时可观察到绿色荧光蛋白,且随着转染时间的延长观察到的绿色荧光蛋白数量增多,说明重组质粒pFPV-GFP成功转染到F81细胞中,Western blotting鉴定出GFP在重组病毒rFPV-GFP中稳定表达。本研究通过在pFPV上成功插入GFP并拯救出病毒,说明pFPV上可以插入外源基因,为其他外源基因在pFPV上的插入奠定基础,同时GFP的插入为FPV的研究提供了更加有利的研究工具,为FPV的基础研究以及中和抗体的快速检测奠定基础。     

绿色荧光蛋白及在生物技术研究中的应用

本文阐述了绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的结构、性质、特点和在生物技术研究中的应用等，以及野生GFP存在的问题和改进GFP的应用前景．     

猪miR-23a靶向调控Smad3基因表达的研究

为了确定miR-23a是否靶向调控Smad3基因,试验利用NotⅠ和XhoⅠ酶构建包含Smad3-3′-UTR的野生型(psiCHECKTM-2-W-Smad3-3′-UTR)和突变型双荧光酶报告载体(psiCHECKTM-2-M-Smad3-3′-UTR),并在PK-15细胞中转染miR-23amimics、miR-23ainhibitor及其阴性对照,采用双荧光酶检测试剂盒检测荧光素酶活性,用实时荧光定量PCR和Western blotting法分别检测Smad3基因的mRNA和蛋白表达水平。结果表明,将含Smad3-3′-UTR的野生型和突变型双荧光酶报告载体与miR-23amimic共转染PK-15细胞,野生型报告质粒表达的荧光素酶活性显著低于其阴性对照组(P<0.05);转染miR-23amimics能显著下调Smad3基因mRNA及其蛋白表达水平(P<0.05);而转染miR-23ainhibitor组与miR-23ainhibitor阴性对照组相比,Smad3基因蛋白表达差异不显著(P>0.05)。综合上述结果可知,猪miR-23a可靶向作用于Smad3基因。     

KLF3基因3'-UTR区双荧光素酶报告载体及其突变载体的构建与活性鉴定

试验旨在构建锌指蛋白3（KLF3）基因3'-UTR区双荧光素酶基因报告载体及其突变载体,初步分析可能调控KLF3基因表达的miRNAs。首先通过PCR方法扩增KLF3基因的3'-UTR序列,将其克隆到经Xho Ⅰ、Not Ⅰ双酶切的双荧光素酶报告载体中;运用Targetscan软件预测可能与KLF3基因3'-UTR相互作用的miRNA;使用脂质体2000转染试剂将miRNAs mimics与构建好的KLF3基因3'-UTR段双荧光素酶报告载体或突变载体共转染于常规培养的293T细胞中,检测荧光素酶活性。结果表明,KLF3基因3'-UTR可能是miR-21的作用靶位点;双荧光报告显示,miR-21 mimics组（0.6900±0.0144）比突变组（1.000±0.0688）和空白对照组（1.000±0.0159）KLF3基因3'-UTR双荧光素酶基因报告载体和突变载体的活性降低了31%（P<0.01）。本试验成功构建了含有KLF3基因3'-UTR段双荧光素酶基因报告载体与突变载体,初步证实miR-21对KLF3基因有调控作用。     

Usage of putative chicken U6 promoters for vector-based RNA interference

Gene silencing with short interfering RNA (siRNA) expression vectors is a powerful method for the analysis of gene functions. For the expression of siRNA in mammalian cells, mammalian U6 small nuclear RNA (snRNA) promoters are widely used. However, the mammalian U6 promoter might not function well in other species. In this study, we cloned four putative chicken U6 promoters by PCR and analyzed their functions. First, we screened the chicken genomic database using the human U6 snRNA gene and identified four candidate sequences. The sequences contained some control elements in their promoter regions, but as we could not rule out that they were pseudogenes, we amplified these sequences and used them as promoters for short hairpin RNA (shRNA) expression. Using the firefly luciferase (Luc) gene as a target, transient expression assays were performed with chicken ovary-derived cells. All four putative chicken U6 promoters exhibited suppressive activity toward Luc, and so could act as a promoter for expression of the snRNA gene in the chicken genome. The promoter activity was not as strong as that of a commercially available siRNA expression vector. This probably reflects artificial sequences between the promoters and synthetic DNA encoding shRNA.     

荧光素酶基因在转化烟草中的表达

来源于萤火虫的荧光素酶结构基因与花椰菜花叶病毒35SRNA启动子以及胭脂碱合成酶DNA3’末端结构相拼接,构成一融合基因.通过叶盘感染法将该融合基因引入烟草叶盘,把选择诱导培养基上形成的愈伤组织转到选择分化培养基后能很快分化出芽点,继而长成完整的再生植株.对再生植株提取物发光试验表明,外源基因已整合到烟草细胞的核基因组上,并能在烟草中表达.带有这种融合基因的重组质粒pBC341具有KpnI、SstI等单一的酶切位点,因而也可作为常规的基因载体.     

抑制剂T0070907对鸡PPARγ基因表达影响的研究

为了验证过氧化物酶体增殖物激活受体(PPAR)γ选择性抑制剂T0070907对鸡PPARγ基因表达的促进作用,本研究利用荧光定量PCR检测了不同浓度T0070907对鸡成纤维细胞(DF-1细胞)中PPARγ基因mRNA转录水平的影响,结果显示,随着T0070907浓度的增加,鸡PPARγ基因的表达量逐渐升高,并且在T0070907浓度为5μmol/L时极显著高于对照组(p<0.01);利用western blot检测了T0070907对PPARγ蛋白表达的影响,结果显示,5μmol/L的T0070907对DF-1细胞中PPARγ2蛋白的表达有一定的促进作用;利用双荧光素酶报告基因技术检测了不同浓度T0070907对PPRE报告基因活性的影响,结果显示,随着T0070907浓度的增加,DF-1细胞中PPRE报告基因活性逐渐增强,并且在T0070907浓度为0.5μmol/L时该报告基因活性显著高于对照组(p<0.05),当T0070907浓度为2μmol/L、5μmol/L时,与对照组之间的差异达到极显著水平(p<0.01);利用双荧光素酶报告基因技术检测了T0070907和罗格列酮(Rosi)对PPRE报告基因活性的影响,结果显示,单独添加T0070907或Rosi均可显著增强PPRE报告基因活性(p<0.05),同时,添加T0070907并不能降低Rosi对PPRE报告基因活性的促进作用。本研究结果表明,作为PPARγ抑制剂的T0070907对鸡PPARγ基因的mRNA的转录水平、蛋白表达及其蛋白活性均具有促进作用,推测与哺乳动物不同,鸡PPARγ可能具有其独特的表达方式和调控机制。本研究结果对完善PPARγ抑制剂在生理学及药理学上的研究、为PPARγ功能研究选择准确的拮抗剂、预防和治疗炎症相关疾病等方面具有重要意义。     

猪SEPW1基因的转录调控分析

本研究旨在对猪SEPW1基因的潜在启动子区进行克隆及转录活性分析，获得其核心启动子区域，并进一步分析转录因子SP1对SEPW1基因转录活性的影响，为探索SEPW1基因在猪肉质性状方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR检测SEPW1基因在大白猪各组织中的表达量，构建空间表达谱；通过PCR技术克隆得到6个逐级缺失的SEPW1基因启动子片段，构建6个双荧光素酶报告载体，通过检测各载体的双荧光素酶活性获得SEPW1基因的核心启动子区域；对核心启动子区进行生物信息学分析，发现潜在的SP1转录因子结合位点；通过过表达、抑制表达、定点突变及凝胶迁移试验（EMSA）确认SP1转录因子结合位点的存在及其对SEPW1基因转录活性的影响。结果显示，SEPW1基因在所检测的4月龄大白猪12个组织中均有表达，其中在腓肠肌及心脏中的表达量较高。双荧光素酶活性显示，猪SEPW1基因5'侧翼区-443~-231 bp为其核心启动子区，且-378~-306 bp存在1个潜在的SP1结合位点。过表达和抑制表达SP1基因结果显示，转录因子SP1能够促进SEPW1基因的转录；定点突变及EMSA试验确认，转录因子SP1可直接与SEPW1基因启动子区的SP1结合位点（-348~-339 bp）相结合。综合以上结果表明，转录因子SP1可直接靶向SEPW1基因的启动子区并促进SEPW1基因的转录。     

不同截短的丝素重链基因启动子驱动报告基因在家蚕组织中的表达

应用重组苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)为基因转移载体,以绿色荧光蛋白基因(EGFP)为报告基因,研究不同截短的丝素重链基因启动子(-2127/+23、-925/+23和-238/+23)驱动报告基因在家蚕5龄幼虫组织中的表达情况。结果发现,通过病毒感染介导,3种长度丝素重链基因启动子驱动的报告基因在脂肪体和血细胞中存在异位表达,从个体体表可直接观察到明显的绿色荧光;3种长度的启动子都能在后部丝腺中高效起始EGFP的转录,产生绿色荧光;长度为0.9kb和0.2kb的启动子0.9KH、0.2KH在中部丝腺能起始EGFP转录产生绿色荧光,而2.1kb的启动子(2.1KH)能起始EGFP转录,但未能检测到绿色荧光;3种长度的启动子也能在Sf9培养细胞中起始EGFP基因表达。上述结果表明,丝素重链基因启动子没有严格的组织特异性。