猪圆环病毒2型原位杂交检测技术的建立与应用

参照GenBank发表的猪圆环病毒2型（PCV2）ORF2基因序列设计引物，利用PCR扩增得到PCV2BF株341bp的核酸片段，用随机引物法制备出地高辛标记的核酸探针。制备的探针与PCV1、PRRSV、PPV、PRV等不发生反应，可检测的最低PCV2DNA含量为1．78Pg。对30份临床组织样本进行了检测，并与PCR比较，结果表明，阴性符合率为100％，阳性符合率为88．9％。应用原位杂交技术分析了PCV2在人工感染仔猪主要组织中的分布，结果表明，感染后3d，从仔猪的淋巴结、胸腺、肺脏、脾脏、鼻黏膜可检测到阳性信号，感染后21d，肝脏、肾脏、胰腺和回肠可检出阳性信号，至感染后42d，可从心脏、胃、脑检出阳性信号。在整个试验过程中会厌软骨、膀胱、皮肤、肌肉等组织均为阴性。本研究结果表明，建立的PCV2原位杂交技术具有良好的敏感性和特异性，可用于PCV2的实验室诊断和感染靶细胞的定位分析。     

猪圆环病毒3型与猪圆环病毒2型二重PCR检测方法的建立

为建立同时检测PCV3和PCV2的二重PCR方法,分别以PCV3和PCV2基因组的保守区域设计2对特异性引物,片段大小分别为649,295 bp。将反应条件进行优化,构建PCV3和PCV2的二重PCR检测方法。检测结果表明该方法能特异性扩增PCV3和PCV2,且无法扩增其他猪常见病毒;PCV3和PCV2的最低检出限分别为508,412 copies/μL。临床样品检测结果显示,PCV3和PCV2阳性率分别为2.1%(3/145),62.1%(90/145),PCR产物经测序证实为PCV3。本研究建立的二重PCR方法具有速度快、特异性强和灵敏度等优点,可以用于PCV3和PCV2的检测和流行病学调查。     

猪2型圆环病毒PCR检测方法的建立及应用

设计1对猪2型圆环病毒ORF2基因的引物,对甘肃地区的断奶仔猪多系统衰竭综合症疑似病例进行了PCR检测,并优化了PCR反应条件,进行了敏感性、特异性及重复性的测定试验,对其扩增序列进行了测序比较。结果表明,PCR扩增获得了预期大小的片断,将测序结果与GenBank收录的PCV2序列进行比较,发现同源性均在91.2%以上。对甘肃地区的69份病料的检测结果为感染率59%,表明甘肃地区的感染已经比较严重。     

猪圆环病毒2型和3型检测方法建立及初步应用

为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示：该方法特异性好,可鉴别 PCV2、PCV3与其他猪病病毒;PCV2最低检测下限为1.00×10¹ copies/μL,PCV3最低检测下限为1.00×10⁰ copies/μL;重复性高,批内、批间的变异系数分别为0.01%～0.02%和0.02%～0.05%;本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份,PCV2样品符合率为97.47%,PCV3样品符合率为96.85%;测序结果显示,PCV2均为2d亚型,PCV3均为3c亚型。结果表明,建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确,节约成本,可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。     

猪圆环病毒3型PCR-ELISA检测方法的研究与应用

为建立一种检测猪圆环病毒3型(porcine circovirus type 3,PCV3)的PCR-ELSIA方法,根据GenBank上报道的PCV3全基因组序列,针对其高度保守区域设计1对特异性引物,上、下游引物的5′端分别标记生物素和地高辛。经PCR扩增获得大量带有标记的目的基因,依靠生物素-链霉亲和素的非共价结合作用固定目的基因于载体上,再通过羊抗DIG-HRP的显色反应,建立PCR-ELISA检测方法。结果表明,该方法与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒、猪细小病毒和猪圆环病毒2型无交叉反应,特异性良好。PCR-ELISA方法最低检测限为5.58×10² copies/μL,敏感性比常规PCR高100倍(常规PCR的检测限为5.58×10⁴ copies/μL)。PCR-ELISA方法批内和批间重复性检测的变异系数分别为1.90%～5.20%和3.89%～9.03%。对132份临床样品进行PCV3检测,PCR-ELSIA检出率为9.10%(12/132),高于常规PCR的检出率(4.55%,6/132)。综上,该方法具有特异、灵敏、安...     

2型猪圆环病毒研究进展

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)是一种基因组较小,但有较高进化速率的DNA病毒,其是影响养猪业经济发展的重要病原体。到目前为止,PCV2具有5种基因型-PCV2a到PCV2e,但对PCV2流行株的基因序列的检测发现,PCV2的基因型仍在持续的发展。自2012年以来,PCV2d基因型的圆环病毒在北美取代了以前主导的PCV2b基因型感染,同时在中国和韩国也有了类似的趋势。圆环病毒的新兴基因型,其毒力存在增强的可能性,基于PCV2a基因型制备的疫苗,是否对PCV2d基因型圆环病毒的感染具有保护作用,已引起各国学者的重视。本文通过对PCV2的生物学特性、抗体变异情况以及其基因进化情况进行综合的分析总结,从而为PCV2疫苗的开发与研制奠定理论基础。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白琼脂扩散试验检测方法的建立

为便于快速、准确检测猪圆环病毒2型(PCV2),减少其对我国养猪业的威胁,建立了PCV2 Cap蛋白琼脂扩散试验(AGP)检测方法。应用表达制备好的PCV2 Cap蛋白,与弗氏佐剂乳化后免疫家兔,制备多克隆抗体并进行抗体效价测定。确定AGP最佳工作条件,并进行抗体特异性、稳定性及符合率试验。结果显示:制备的多克隆抗体ELISA效价可达1:12 800,AGP效价可达1:32,表明其具有良好的特异性、稳定性;对20份PCV2 Cap蛋白抗原进行检测,发现其结果与应用标准猪血清抗体检测结果符合率为100%。结果表明,制备的抗PCV2 Cap蛋白多克隆抗体可替代标准抗体,用于PCV2 Cap蛋白的AGP试验检测。本研究为PCV2检测以及后续的免疫学特性研究提供了技术支撑。     

猪圆环病毒2型荧光定量PCR检测方法的建立

通过条件优化,以定量的10倍系列稀释质粒pMD-ORF2(含PCV2-ORF2全基因)为标准品,进行荧光定量PCR扩增并制作标准曲线,建立了猪圆环病毒2型(PCV2)的荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达1.0×100拷贝/μL,线性范围为109~100,达10个数量级;对起始浓度为1.0×106、1.0×105、1.0×104拷贝/μL的标准品的最终实际测得值分别为1.000×106、0.935×105、0.987×104拷贝/μL,变异系数分别为2.527%、2.067%、2.092%。该方法的检测灵敏度与套式PCR(nPCR)相当,甚而高于常规PCR。     

猪圆环病毒2型及3型快速二重PCR检测方法的建立及其应用

针对猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)基因的保守序列设计了2对扩增PCV2和PCV3的特异性引物,通过优化各反应条件,建立同时检测PCV2和PCV3的二重PCR检测方法。敏感性和特异性结果显示,1.08×10~(-8)μg/μL是对PCV2和PCV3的最低检测限具有较好的灵敏度;而对猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)、大肠杆菌、链球菌、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌的检测结果均无条带,表明所建立的方法具有较好的特异性。应用该方法检测了2017年9月—2018年8月从广西14个地市猪场采集的533份病猪死猪内脏组织,结果显示:PCV2阳性率为23.8%,PCV3阳性率为14.8%, PCV2和PCV3混合感染率为2.8%。广西14个地市中有12个地市的猪场送检样品检测出PCV2,有10个地市的猪场送检样品检测出PCV3,表明PCV2和PCV3在广西受检猪群中普遍存在,要重视和做好PCV2和PCV3感染的防控工作。     

猪繁殖与呼吸综合征、猪2型圆环病毒病二联基因疫苗的构建

将猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)长春分离株的ORF5基因克隆至真核表达载体pIRES的CMV的启动子下游,并用猪二型圆环病毒的内蒙古分离株的ORF2基因替代pIRES的neo基因,构建真核表达质粒。通过West-ernblot以及IFA检测方法鉴定,所构建的重组质粒能在BHK细胞内进行有效的转录,并表达了目的蛋白。     

猪圆环病毒2型胶体金抗体检测方法的建立

为建立检测猪圆环病毒2型(PCV2)胶体金检测方法,本研究对SPA蛋白进行胶体金标记,并喷涂于玻璃纤维上制备金标垫,分别以重组PCV2 ORF2蛋白和猪IgG作为检测线和质控线,制作PCV2抗体检测胶体金免疫层析试纸条。检测结果表明,试纸条操作简单,肉眼于10 min内可以判定结果,对PCV2免疫血清具有高度特异性,与猪其它病毒免疫血清无交叉反应,检测灵敏度与ELISA相近。试纸条在室温保存6个月,其特异性及灵敏度无明显变化。对临床采集的324份血清样品进行检测,结果与ELISA试剂盒总符合率为98.77%。表明本研究建立的PCV2抗体免疫层析检测方法具有特异、敏感、稳定、操作简单快捷等特点,适合于PCV2抗体的现场检测。     

猪圆环病毒2型免疫过氧化物酶单层细胞试验抗体检测试剂盒的研制及应用

本研究建立了一种免疫过氧化物酶单层细胞试验（Immunoperoxidase monolayer assay,IPMA）,用于猪圆环病毒2型血清抗体检测,通过对IPMA反应条件的优化,组装了诊断试剂盒。研究结果表明,用IPMA检测猪圆环病毒2型人工感染猪血清,于感染后3周抗体阳转,第3周～10周抗体阳性检出率为92.8%（52/56）,对照组猪血清抗体检测均为阴性（33/33）。试剂盒在-20℃稳定保存18个月与其他几种猪病毒参考血清无交叉反应,与用重组蛋白抗原建立的rcELISA符合率为89.2%。对来自黑龙江、吉林、河北、上海、内蒙古、云南、江西等地猪场健康成年猪血清480份和发病猪血清424份进行了检测,抗体检出率分别为91.7%和79.2%,表明我国猪群中猪圆环病毒2型污染相当严重。该试剂盒的研制为我国PCV2流行病学调查和疫苗免疫效果的评价提供了技术手段。     

猪圆环病毒1型和2型核酸定性标准样品的研制

为了研制猪圆环病毒1型(PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)核酸定性标准样品,分别将PCV1和PCV2病毒全序列克隆至pMD18-T载体中并进行稀释分装。制备后进行均匀性评估、稳定性评估、定值和临床试用。结果:制备的标准样品的参考值分别为:1.33×10⁴ copies/μL(PCV1)和1.11×10⁴ copies/μL(PCV2);样品均匀;-20℃可稳定保存24个月以上,4℃可稳定2个月以上。经国家标准化管理委员会组织的专家评审,达到了国家标准样品的要求,可作为核酸扩增检测的猪圆环病毒核酸标准样品。     

猪圆环病毒2型的分离与鉴定

利用PCR方法,从疑似断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)的自然病例的淋巴结和脾脏中扩增出了预期长度的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)的DNA片段,并用限制性内切酶对PCR产物进行了酶切鉴定。将经PCR扩增和酶切鉴定为PCV2阳性的组织样品匀浆液接种到无PCV污染的PK15细胞中传代,经间接免疫荧光检查,在接毒细胞内观察到了特异性免疫荧光;用接毒细胞制备超薄切片,在电镜下观察到了直径大约为17nm的圆形病毒样粒子和大量不同形态的胞浆内包涵体。由此表明分离出的病毒为猪圆环病毒2型。     

Coincidental detection of genomes of porcine parvoviruses and porcine circovirus type 2 infecting pigs in Japan

The infection status of 15 viruses in 120 pigs aged about 6 months was investigated based on tonsil specimens collected from a slaughterhouse. Only 5 species of porcine parvoviruses and porcine circovirus type 2 (PCV2) were detected at high frequencies; 67% for porcine parvovirus (PPV) (PPV-Kr or -NADL2 as the new abbreviation), 58% for PPV2 (CnP-PARV4), 39% for PPV3 (P-PARV4), 33% for PPV4 (PPV4), 55% for PBo-likeV (PBoV7) and 80% for PCV2. A phylogenetic analysis of PPV3 suggested that Japanese PPV3s showed a slight variation, and possibly, there were farms harboring homogeneous or heterogeneous PPV3s. Statistical analyses indicated that the detection of PCV2 was significantly coincidental with each detection of PPV, PPV2 and PPV3, and PPV and PPV4 were also coincidentally detected. The concurrent infection with PCV2 and porcine parvoviruses in the subclinically infected pigs may resemble the infection status of pigs with the clinical manifestations of porcine circovirus associated disease which occurs in 3–5 months old pigs and is thought to be primarily caused by the PCV2 infection.     

猪圆环病毒2型诊断技术研究进展

猪圆环病毒2型(PCV2)是新发现的迄今为止最小的动物病毒,是猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的病原.PMWS给世界养猪业造成了巨大的经济损失.本文综述了猪圆环病毒2型的诊断技术,包括抗原和抗体的检测技术.     

猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫佐剂的比较试验

以猪圆环病毒2型(PCV2)遗传标记毒株为毒种,经细胞培养传代,优化了病毒增殖条件,获得较高滴度的病毒培养物用于PCV2灭活疫苗的研制。为了比较不同免疫佐剂的效果,本试验对国产矿物质白油和铝胶两种佐剂以及赛比克公司提供的MONTANIDETMISA206、ISA15VG、IMS1315VG3种佐剂配制的灭活疫苗进行了猪体免疫试验。通过临床观察、血清抗体效价测定,确认ISA15VG佐剂配制的疫苗在增强免疫效果方面优于其它佐剂。按5种佐剂免疫效果排序为ISA15VG、IMS1315VG、铝胶、ISA206、国产白油。ISA15VG佐剂属于水包油剂型,可刺激接种动物产生快速免疫应答反应,抗体产生效价高、持续时间长,有可能成为新型PCV2灭活疫苗佐剂的候选。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化，采用PCR技术，对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型（PCV2）感染发病猪场的197份组织病料（脾、肺、淋巴结）进行了PCV2检测；同时，对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流感病毒（SIV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）的检测，另外，对6个地（市）11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品（脾、肺、淋巴结）进行了PCV2检测。结果显示，在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份，平均阳性率为54．82％（108／197），阳性猪场62个，平均阳性率为63．92％（62／97）。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42．13％（83／197），混合感染的猪场总阳性率为57．73%（56／97）。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2，阳性率为7．10％。由此可见，PCV2感染在广西猪群中已普遍存在，混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。