猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌的制备及其免疫原性分析

为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87 ku的重组蛋白.Western blot分析表明该蛋白能与猪RV多克隆抗体反应.大量培养pW425et-Vp4乳酸菌,经离心加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服;应用ELISA方法检测血清抗体水平,试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,最后进行小鼠免疫保护性试验.结果表明pW425et-Vp4乳酸菌能增强小鼠的黏膜免疫反应,对猪PV强毒株的攻击具有一定的保护作用,为下一步在猪体内进行试验奠定基础.     

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化条件的优化

为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D_{600 nm}值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸＋0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3~4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×10⁴ CFU/μg DNA。     

乳酸菌Nisin诱导表达载体的构建和鉴定

为构建乳酸菌Nisin诱导表达载体,实现外源目的基因在乳酸菌中的可控表达,本研究以产Nisin乳酸乳球菌染色体DNA为模板,采用PCR技术扩增双组份调控元件nisRK基因和诱导型启动子nisA基因,并克隆至乳酸菌-大肠杆菌穿梭质粒pW425et中,以nisA基因替换原组成型启动子P32,构建乳酸菌Nisin诱导表达载体pW425N。为检测载体的诱导表达功能,以gfp基因作为报告基因,构建重组表达载体pW425N-gfp,以分离自仔猪肠道内嗜酸乳杆菌为受体菌,电转化法制备重组乳酸菌pW425N-gfp/L.acidophilus。结果表明,重组载体能够在Nisin诱导下表达目的荧光蛋白,并且最佳Nisin有效浓度为30 ng/mL,最佳诱导时间为3 h。该表达载体的构建为外源功能性蛋白在乳酸菌中的诱导表达奠定基础。     

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-VpC,并将pW425et-Vp4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

口服猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌对BALB/c小鼠的免疫保护作用

将轮状病毒pW425et-Vp4乳酸菌重组质粒口服免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间眼球采血脱臼处死,收集小鼠血清、脾细胞及肠道内容物,用ELISA方法检测血清IgG水平,用试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,以流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群和CD19+B细胞亚群的变化情况,最后进行攻毒试验。结果显示,pW425et-Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠血清IgG及肠黏膜SIgA水平较对照组有明显差异,且S/N2.0,CD4+/CD8+比值显著高于对照组,且比值大于2:1;表明猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌重组表达质粒可以增强小鼠机体免疫保护能力。     

猪轮状病毒Vp4全基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以猪A组轮状病毒mRNA为模板，应用优化的反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）技术，扩增了2331 bp的Vp4全长基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T中，构建质粒pGEM-T-Vp4。以SalⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM—T—Vp4．和以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase，thyA）为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t，并将纯化的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425t中，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp4。将pW425t-Vp4转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E．coli X13中，通过生长功能弥补筛选阳性克隆，SDS-PAGE分析，可见约87.67Ku融合蛋白。Western blot分析表明，该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性，研究结果为pW425t-Vp4在乳酸菌受体菌株中表达提供科学依据。     

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用Sal I和Kpn I双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thvmidvlatesynthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸茵与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸茵与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp4,并将pW425et-VP4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

绿色荧光蛋白穿梭载体的构建及其在嗜酸乳杆菌中的应用

为深入研究嗜酸乳杆菌的作用机理,以温敏型穿梭载体pSET4s为基本骨架,将绿色荧光蛋白(GFP)和嗜酸乳杆菌上、下游同源臂插入该载体,构建GFP标记的穿梭表达载体pSET4s-P1-GFP-P2。利用电转化方法将穿梭表达载体pSET4s-P1-GFP-P2转化入嗜酸乳杆菌,通过抗性和温度双重筛选获得能稳定表达GFP的重组嗜酸乳杆菌,将Western blotting和荧光显微镜观察验证的重组菌命名为ΔMG6243(GFP)。利用荧光显微镜观察和平板计数的方法对重组菌进行遗传稳定性和生物学特性研究。结果显示,重组菌在蓝光激发下可见明显绿色荧光,连传10代仍可见明显荧光,与野生菌相比,其生长特性、酸碱盐耐受性均无显著差别。结果表明,本试验已成功构建稳定表达GFP基因的重组嗜酸乳杆菌,利用温敏型穿梭载体pSET4s实现了外源基因在嗜酸乳杆菌中非抗性、整合型表达,为嗜酸乳杆菌基因重组菌的构建奠定了基础,同时GFP的标记作用也为嗜酸乳杆菌在动物体内分布、定植规律和作用机理创造了可行的条件。     

应用RT-PCR技术定量检测发酵物料中嗜酸乳杆菌菌体数

根据发酵物料中常见乳酸菌种的16S rRNA基因序列设计嗜酸乳杆菌的种属特异性引物,以单独嗜酸乳杆菌发酵样品中的细菌基因组DNA为模板,应用实时荧光定量PCR(RT-PCR)技术对发酵物料中嗜酸乳杆菌进行定量检测。通过RT-PCR图谱分析,准确地检测出样品中嗜酸乳杆菌菌体数的含量为15亿CFU/g。结果表明:该方法能够对发酵物料中嗜酸乳杆菌菌体数进行准确定量,是较好的检测发酵物料中嗜酸乳杆菌菌体数的方法。     

植酸酶基因在嗜酸乳杆菌中的表达

植酸酶和嗜酸乳杆菌是重要的饲料添加剂,为获得产植酸酶的嗜酸乳杆菌菌株,克隆了大肠杆菌植酸酶基因,构建表达载体并转化嗜酸乳杆菌,对重组嗜酸乳杆菌进行发酵产酶并测定所产酶液的酶学性质,进一步研究重组嗜酸乳杆菌的耐酸性及植酸酶液的抗蛋白酶活性。结果表明：重组嗜酸乳杆菌发酵24 h植酸酶活性为984 U/mL,植酸酶的最适催化pH为4.5,最适催化温度为60℃。重组嗜酸乳杆菌在pH 2.0～4.5有一定的耐酸性,在pH 2.0条件下2 h的存活率为76.4%。植酸酶液用胃蛋白酶处理160 min后植酸酶液剩余85%的相对酶活,用胰蛋白酶处理160 min后剩余29%的相对酶活。上述研究结果为重组嗜酸乳杆菌后续应用研究提供了重要依据。     

猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属（Rotaviras），作为婴幼儿和动物腹泻的主要病原，在世界范围内广泛流行，每年造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。     

降钙素基因在乳酸杆菌中的克隆

根据鲑鱼降钙素基因的序列,合成了鲑降钙素基因。首先将该基因连接到以ThyA基因为选择压力的非抗性表达载体pW425t中,转化ThyA基因缺陷的大肠杆菌X51。用SacI和KpnI双酶切法和PCR法筛选出阳性重组质粒,然后采用电穿孔法将阳性重组质粒pWCT转化到ThyA基因缺陷的乳酸杆菌中。用PCR法筛选阳性重组质粒,并进行序列测定。结果表明,目的基因所编码的氨基酸序列与天然鲑降钙素的氨基酸序列完全一致。我们得到了含降钙素基因的重组乳酸杆菌。     

Construction and Immunogenicity Analysis of Recombinant Lactobacillus plantarum Expressing ORF2 Gene of Porcine Circovirus Type 2

To develop an effective vaccine against porcine circovirus type 2 (PCV2), ORF2 gene was cloned into a Lactobacillus plantarum (L.plantarum) pSCPSP under the control of a SCP promoter to construct recombinant plasmid pSCPSP-Cap that was transformed into LP1 by electroporation. Extracellular expression of the Cap protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blotting analysis. Afterwards, 8-week-old SPF BALB/c mice were randomly divided into control group, carrier group, lavage group, group of drinking water and inactived vaccine group. After 14,28,42 and 56 d, mice serums were collected to evaluate the level of specific antibody by SDS-PAGE and Western blotting. Eventually, SDS-PAGE and Western blotting results indicated that the Cap protein of PCV2 could be efficiently expressed in L. plantarum, expression of protein molecular weight was 28 ku and with good immunogenicity. In addition, higher levels of specific antibody in the serum of mice was observed by oral administration with L. plantarum expressing the PCV2 Cap antigen (P<0.05). In conclusion, the ORF2 gene of PCV2 could be successfully expressed in recombinant L. plantarum and expressed protein with good biological activity, which would lay the foundation for the development of PCV2 oral vaccination.     

猪圆环病毒2型ORF2基因重组植物乳杆菌的构建及其免疫原性分析

为研制一种能有效控制猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）的新型疫苗,本试验将PCV2的ORF2基因克隆至植物乳杆菌表达载体pSCPSP超强启动子SCP的下游,构建重组表达质粒pSCPSP-Cap,用电击转化法转化克隆至表达宿主菌植物乳杆菌,获得一株重组植物乳杆菌。以SDS-PAGE和Western blotting法检测24 h上清液中表达的蛋白;将8周龄的SPF级BALB/c小鼠随机分组,每组8只,分别设置对照组、空载体组、灌胃组、饮水组、灭活疫苗组,试验14、28、42和56 d后对小鼠采血,分离血清,利用PCV2 ELISA抗体检测试剂盒检测小鼠血清中PCV2的抗体水平。SDS-PAGE、Western blotting结果显示,PCV2衣壳蛋白在植物乳杆菌中成功分泌表达,表达的蛋白分子质量为28 ku,且具有良好的反应原性,重组植物乳杆菌免疫小鼠诱导机体产生PCV2特异性抗体显著高于其他组（P<0.05）。结果表明,PCV2的ORF2基因在植物乳杆菌中成功表达,且具有良好的生物活性,可为PCV2口服疫苗的开发研究提供理论参考。     

干酪乳杆菌胸苷酸合成酶基因的分子克隆与序列测定

本研究的目的是以干酪乳杆菌 Ｌ． ｃａｓｅｉ ３４１０３染色体 ＤＮＡ为模板,利用 ＰＣＲ技术扩增出胸苷酸合成酶（Ｔｈｙｍｉｄｙｌａｔｅｓｙｎｔｈａｓｅ,　ｔｈｙＡ）基因,利用玻璃奶回收纯化试剂盒回收纯化ｔｈｙＡ基因,并将其克隆入以红霉素抗性为选择压力的可以在大肠杆菌和乳酸菌中穿梭表达的质粒ｐＷ４２５ｅ,再转化Ｘ５１感受态细胞,筛选阳性克隆,提取质粒,进行酶切鉴定、ＰＣＲ扩增鉴定,并对ｔｈｙＡ基因片段进行测序,与已知序列进行同源性比较,结果表明成功克隆了 ｔｈｙＡ基因,全长约 １．１ｋｂ,与国外报道的 ｔｈｙＡ基因同源性达９９％。这为构建以ｔｈｙＡ基因为选择压力的非抗生素抗性穿梭表达载体奠定了基础。     

牛朊蛋白27-30基因的克隆与表达

利用PCR技术，从含有牛朊蛋白（Prion protein，PrP）基因Prnp的开放阅读框的克隆质粒BoPrnp—T中扩增出约420bp的目的基因（PrP猢基因）。将PrP^27-30基因和载体pPIC9K分别用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，T4DNA连接酶作用后，转化至E．coli JM109中，构建重组表达载体pPIC9K-boPrP^27-30。pPIC9K-boPrP^27-30经限制性核酸内切酶SalⅠ线性化后电转至毕赤酵母GS115中，经G418筛选后得到高拷贝的重组菌株GS115／pPIC9K-boPrP^27-30。GS115／pPIC9K-boPrP^27-30经1．0％甲醇诱导后，表达产物用SDS-PAGE和Western blot分析，结果表明牛PrP^27-30基因在毕赤酵母细胞中获得表达，表达产物的分子量约为27Ku，能够被单克隆抗体SAF-70识别。     

Molecular characterization of Theileria orientalis piroplasm protein encoded by an open reading frame (To ORF2) in a genomic fragment

In the present study, a novel antigenic protein expressed in the piroplasm stage of Theileria orientalis was characterized. A 4,707 bp genomic fragment amplified by PCR contained two open reading frames (ORFs). The deduced amino acid sequence of the first ORF showed significantly high similarlity to the ubiquitin carboxy terminal hydrolases/proteases while the second ORF (To ORF2) showed homology to several surface antigens of plasmodia. To ORF2 was expressed to determine whether the protein product is expressed by the parasite. In western blot analysis, bovine antiserum from a T. orientalis-infected calf recognized the recombinant protein containing a C-terminal part of the ORF expressed by baculovirus system. Western blot analysis with the anti-To ORF2 mouse serum recognized a 48 kDa protein in T. orientalis piroplasm lysates. Indirect immunofluorescence antibody test by confocal scanning laser microscopic analysis showed that antisera against the recombinant protein recognized T. orientalis piroplasm in the infected erythrocyte. The results from this study indicate that To ORF2 protein is expressed at the piroplasm stage and is immunogenic. This novel antigenic To ORF2 protein could be exploited for vaccine development against bovine piroplasmosis.     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

猪附红细胞体eno基因重组蛋白的制备及免疫效果研究

为了研究猪附红细胞体eno基因重组蛋白的免疫效果,本试验将猪附红细胞体eno基因与pET-15b载体进行连接,转化大肠杆菌BL21感受态细胞。对表达菌株进行诱导表达、纯化,利用纯化后的猪附红细胞体eno重组蛋白（命名为rMseno）对小鼠进行免疫,从而评价该重组蛋白在小鼠体内产生的免疫应答水平。试验将20只4周龄的雄性昆明小鼠随机分为A、B、C、D 4个组。免疫A组接种纯化后的重组蛋白rMseno;免疫B组接种经IPTG诱导表达后的重组菌E.coli-Mseno;对照C组接种等量PBS;对照D组接种未经过诱导表达的重组菌E.coli-Mseno。通过ELISA检测方法分别测定血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平及γ干扰素（IFN-γ）和白细胞介素4（IL-4）细胞因子水平,最后通过脾脏淋巴细胞增殖试验来反映小鼠体内T淋巴细胞的增殖情况。结果显示,构建的重组pET-15b-eno质粒目的基因片段大小为1 632 bp,与预期大小相同;纯化的重组蛋白rMseno大小为61 ku,并能够被鼠抗猪附红细胞体血清所识别;免疫A组和免疫B组小鼠血清中抗猪附红细胞体特异抗体水平,IFN-γ、IL-4细胞因子水平以及T淋巴细胞增殖指数均显著或极显著高于对照组（P<0.05;P<0.01）。结果表明,猪附红细胞体eno基因重组蛋白能够诱导小鼠产生较高的体液免疫水平以及细胞免疫应答水平。