猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化条件的优化

为了提高pW425et-Vp4基因工程乳酸菌的转化效率,对影响电转化效率的主要因素进行研究,以得到最佳的电转化条件。试验结果表明,猪轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌电转化的最佳条件为:当感受态细胞的D_{600 nm}值为0.4时,在MRS培养基中加入1%甘氨酸＋0.3 mol/L蔗糖,电场强度为11 kV/cm,脉冲时间为3.8 ms,电击后细胞复苏3~4 h等条件时,得到较高的转化效率,最高可达3.8×10⁴ CFU/μg DNA。     

猪源A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌的制备及其免疫原性分析

为了解猪轮状病毒(RV)Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠是否能产生有效的免疫保护作用,本研究应用电转化技术将猪源A组RV重组质粒pW425et-Vp4转化至嗜酸乳杆菌中,重组菌经SDS-PAGE分析可见约87 ku的重组蛋白.Western blot分析表明该蛋白能与猪RV多克隆抗体反应.大量培养pW425et-Vp4乳酸菌,经离心加入灭菌脱脂乳液给BALB/c小鼠灌服;应用ELISA方法检测血清抗体水平,试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,最后进行小鼠免疫保护性试验.结果表明pW425et-Vp4乳酸菌能增强小鼠的黏膜免疫反应,对猪PV强毒株的攻击具有一定的保护作用,为下一步在猪体内进行试验奠定基础.     

猪A组轮状病毒Vp7基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

轮状病毒（Rotavirus，RV）属于呼肠孤病毒科（Reoviridae）、轮状病毒属（Rotaviras），作为婴幼儿和动物腹泻的主要病原，在世界范围内广泛流行，每年造成巨大损失。鉴于其危害严重且无有效治疗手段，世界卫生组织将RV疫苗列为最优先发展的疫苗项目之一，尤其是它的基因工程疫苗的研制更为重要。     

猪轮状病毒Vp4全基因与乳酸菌非抗性表达载体的重组及在大肠杆菌中的表达

以猪A组轮状病毒mRNA为模板，应用优化的反转录聚合酶链式反应（RT—PCR）技术，扩增了2331 bp的Vp4全长基因，通过T-A克隆技术，将PCR产物克隆至克隆载体pGEM-T中，构建质粒pGEM-T-Vp4。以SalⅠ和KpnⅠ双酶切pGEM—T—Vp4．和以胸苷酸合成酶基因（thymidylate synthase，thyA）为选择压力的非抗生素抗性的穿梭表达载体pW425t，并将纯化的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425t中，构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425t-Vp4。将pW425t-Vp4转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E．coli X13中，通过生长功能弥补筛选阳性克隆，SDS-PAGE分析，可见约87.67Ku融合蛋白。Western blot分析表明，该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性，研究结果为pW425t-Vp4在乳酸菌受体菌株中表达提供科学依据。     

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thymidylate synthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸菌与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-VpC,并将pW425et-Vp4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

猪A组轮状病毒Vp4基因与乳酸菌双标记表达载体的重组及其原核表达

用Sal I和Kpn I双酶切克隆质粒pGEM-T-Vp4和(以胸苷酸合成酶基因(thvmidvlatesynthase,thyA)及红霉素基因(Erythromycin)为选择压力的双标记的可以在乳酸茵与大肠杆菌之间穿梭表达的)质粒载体pW425et,并将纯化回收的Vp4基因亚克隆至表达载体pW425et中,构建出可以在乳酸茵与大肠杆菌之间穿梭表达的原核表达重组质粒pW425et-Vp4,并将pW425et-VP4分别转化至thyA基因缺陷型的大肠杆菌感受态E.coli X13和乳酸杆菌感受态中,经生长功能弥补筛选阳性克隆,SDS-PAGE分析,可见约87 ku的融合蛋白.Western-blot分析结果表明,该蛋白具有与轮状病毒多克隆抗体的反应原性.     

口服猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌对BALB/c小鼠的免疫保护作用

将轮状病毒pW425et-Vp4乳酸菌重组质粒口服免疫BALB/c小鼠,免疫后不同时间眼球采血脱臼处死,收集小鼠血清、脾细胞及肠道内容物,用ELISA方法检测血清IgG水平,用试剂盒检测肠黏膜SIgA水平,以流式细胞仪检测CD3+、CD4+、CD8+T细胞亚群和CD19+B细胞亚群的变化情况,最后进行攻毒试验。结果显示,pW425et-Vp4基因工程乳酸菌口服免疫小鼠血清IgG及肠黏膜SIgA水平较对照组有明显差异,且S/N2.0,CD4+/CD8+比值显著高于对照组,且比值大于2:1;表明猪A组轮状病毒Vp4基因工程乳酸菌重组表达质粒可以增强小鼠机体免疫保护能力。     

猪A组轮状病毒Vp4全基因在MA-104细胞中的表达与DNA疫苗的研究

本研究采用Lipofectamine^TM2000将真核重组表达质粒pVAXI-Vp4染至MA-104细胞中，得到了表达。以荧光抗体检测法和RT-PcR法双重检测了真核重组表达质粒pVAXI-Vp4在MA-104细胞中的表达情况。并将pVAXI-Vp4免疫BALB／c鼠，检测其血清抗体和脾脏中的淋巴细胞增殖情况及CD4^＋，CD8^＋T细胞的数量变化情况。结果表明，猪A组轮状病毒Vp4全基因不但在哺乳动物细胞中获得了表达，而且将真核重组表达质粒pVAXI-Vp4给动物免疫后，获得了免疫效果。这为pVAXI-Vp4 DNA核酸疫苗的进一步推广应用提供了科学依据。     

猪A组轮状病毒VP4全基因在大肠杆菌中的表达与检测

以猪轮状病毒mRNA为模板,应用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术,扩增了2331bp的VP4全基因,通过T-A克隆技术,将PCR产物克隆至pGEM-T Vector中,成功地构建出克隆质粒pGEM-T-VP4.以BamHⅠ和SalⅠ双酶切pGEM-T-VP4和pGEX-6P-1,并将纯化的VP4基因亚克隆至融合型表达载体pGEX-6P-1中,构建出原核表达质粒pGEX-6P-VP4.将pGEX-6P-VP4转化至感受态E.coli BL21(DE3)中,经IPTG诱导和SDS-PAGE分析,可见约111.47 ku融合蛋白带.Western blot分析发现,该蛋白具有轮状病毒抗原性,从而为进一步研究轮状病毒的亚单位疫苗及DNA疫苗奠定基础.     

猪A组轮状病毒VP7基因的克隆及生物信息学分析

为了研究猪A组轮状病毒VP7基因功能,根据GenBank中猪轮状病毒VP7基因DNA序列设计引物,以实验室轮状病毒上海分离株SH-1为模板,进行PCR扩增,将VP7基因克隆到pMD-18T载体后,进行序列测定及分析。结果表明:此序列编码326个氨基酸,其相对分子量为37.38 Ku,理论等电点(PI)为4.77。VP7蛋白以α螺旋为主,主要有13个抗原表位区域。系统进化树分析显示分离株SH-1与KM230930.1株亲缘关系最近,基因型分析结果是G10型,属于人兽共患病毒株。     

猪轮状病毒OSU强毒株vp7基因的克隆及其抗原表位原核表达和免疫学活性分析

参照GenBank中所收录的猪轮状病毒OSU株序列设计了一对特异性引物,RT—PCR扩增出1062bp的vp7全长基因,与参考OSU序列的核苷酸同源性达99．8％,克隆到pMD18-T载体中,获得pMD18-T—vp7阳性质粒。以阳性质粒为模板,利用引入BamH Ⅰ和XhoⅠ酶切位点的引物进行PCR扩增得到含有vP7中和抗原表位区域639bp的基因片段,定向克隆到表达载体pGEX-6P—1中,经酶切PCR鉴定的阳性质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,经IPTG（终浓度为1．0mmol／mL）37℃诱导4h后,SDS—PAGE电泳显示表达了大小约50ku带GST标签的融合蛋白,薄层扫描显示蛋白表达融合量占菌体总蛋白的33．2％。Westernblot分析表明该VP7重组蛋白可与PRV阳性血清特异性反应。     

猪轮状病毒地方株JL94株VP4基因的克隆与序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP4基因保守序列,利用Oligo4.1软件设计一对引物扩增猪轮状病毒地方株JL94株VP4全基因序列;并将扩增产物与pMD-18T载体连接,经鉴定后将重组质粒进行测序并与国外分离株CRW-8株、BEN-307株进行核苷酸和氨基酸序列同源性比较分析.结果表明:JL94株和CRW-8株、BEN-307株VP4全基因片段核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型.本研究为进一步研制诊断性抗原和病毒重组活载体疫苗奠定了基础.     

猪白细胞介素-4基因的克隆与表达

利用RT-PCR技术,从被刺激诱导的PBMC中克隆IL-4基因,序列分析表明:克隆的猪IL-4基因序列与GenBank上登录的IL-4基因的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为99%和97.8%.然后用表达型引物从T载体上扩增IL-4基因,双酶切PCR产物后与表达载体pGEX连接,构建重组表达质粒pGEX-IL-4,用IPTG诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析表明,表达出38 ku融合蛋白,占菌体总蛋白的30%以上,并且以包涵体的形式存在,这为猪重组IL-4规模化生产和疫苗佐剂的研制奠定了基础.     

猪轮状病毒的分离鉴定及部分特性研究

从吉林省某猪场发生腹泻的猪群粪便中,用MA-104细胞培养,分离到一株猪轮状病毒,盲传至4代,感染细胞出现明显病变,经电镜观察,见有典型的轮状病毒颗粒.其RNA电泳型为4:2:3:2型,属A群轮状病毒,同时对其蚀斑特性和血凝特性进行了初步研究,这株病毒被命名为JL94株.     

转移猪轮状病毒VP4基因玉米植株的获得

根据GenBank中猪轮状病毒VP4基因序列设计引物,从重组克隆载体pMD18-T-VP4中PCR扩增VP4基因,将其插入到植物表达载体pCAMBIA3301中CaMV35S启动子下游,构建成高效植物表达载体pCAMBIA3301－VP4;然后利用农杆菌介导法,以玉米自交系H99茎尖来源的玉米愈伤组织为材料,将pCAMBIA3301－VP4导入其中,分化诱导获得再生苗后,对其进行PCR、Southern杂交和RT-PCR检测。结果表明,外源目的基因VP4已成功地转入玉米基因组中,并且目的基因能在转基因玉米植株中获得转录。     

猪轮状病毒L1株VP7基因克隆及序列分析

根据GenBank已发表的猪轮状病毒VP7基因保守序列,设计特异性引物扩增猪轮状病毒L1株VP 7全基因序列并进行序列测定及分析。结果显示, L1株猪轮状病毒VP 7基因全长为1062 bp,包含一个982 bp的开放阅读框,编码326个氨基酸,与G5型参考毒株核苷酸同源性和推导的氨基酸同源性分别为88．8％～93．7％和93．3％～94．2％,系统进化树分析结果亦显示L1株与G5型参考毒株处于同一个群,由此确定L1株为G5型。与我国近几年流行的G9型毒株NMTL进行抗原表位分析结果显示,两个毒株在 aa25～aa29、aa86～aa102、aa142～aa152、aa211～aa226、aa263～aa286等区域存在明显差异,可能对其免疫保护性存在一定的影响。     

猪轮状病毒的分离与鉴定

将疑似感染猪轮状病毒的内蒙古某猪场的腹泻仔猪粪便样品在MA104细胞上分离培养,得到一株能产生明显细胞病变的毒株(命名为PRV L1株).经纯净性检测,该毒株无菌生长、无支原体污染及外源病毒污染.特异性检测结果显示该PRV L1株能被猪轮状病毒单特异性血清中和,并可被猪轮状病毒单克隆抗体识别,其VP7基因序列与G5型猪轮状病毒VP7基因序列同源性为99％.动物回归试验结果表明,该毒株口服攻击3日龄仔猪,可引起典型的猪轮状病毒病发病症状,并能在发病仔猪小肠内容物中检测到猪轮状病毒.