修饰的B.t.K—δ—内毒素基因在大肠杆菌及烟草中表达的抗虫性

利用合成的寡型核苷酸引物ＰＣＲ扩增技术对Ｂ．ｔ．ｋδ－内毒素基因进行了克隆和修。大肠杆菌中表达的抗虫试验表明该修饰过的Ｂ．ｔ．ｋδ－内毒素基因对鳞翅目昆虫如烟青虫和棉铃虫有较强的毒杀作用，随后，通过农杆菌介导将该基因转入烟草，ＲＮＡ点杂交及抗虫试验表明Ｂdisplay status     

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因导入水稻原生质体后获得转基因植株

本实验将苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素基因导入水稻原生质体并得到了具有这种基因的转化水稻植株。所用的重组质粒Pgy61和Pgyck63带有一个由35S启动子,δ-内毒素蛋白基因,β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因和NOS终止子组成的嵌合基因。δ-内毒素基因与GUS基因是融合基因,而且GUS基因在δ-内毒素基因的下游。水稻原生质体是从细胞悬浮系中分离出来,用聚乙二醇（PEG）方法将带有δ-内毒素基因的质粒导入水稻原生质体。经荧光法测定,由这些原生质体产生的愈伤组织具有很高的β-葡萄糖苷酸酶活性,说明β-葡萄糖苷酸酶基因在水稻愈伤组织中得到表达,表明δ-内毒素基因在水稻愈伤组织中已被翻译（表达）。另外,从这些转化的愈伤组织中得到正常的绿色植株,经分子杂交（Southern Blot）证明δ-内毒素基因已整合进水稻基因组中。     

转δ-内毒素基因棉与药剂对斜纹夜蛾活性的协同作用

[目的]为斜纹夜蛾的综合治理提供科学依据。[方法]以转δ-内毒素基因棉(苏抗103)和普通棉花(苏棉12)为材料,比较了两种棉花与4种药剂配合饲喂对斜纹夜蛾生长发育及其对化学药剂敏感性的影响。[结果]连续饲养3代后的斜纹夜蛾3龄幼虫对氰戊菊酯、灭多威、敌百虫、Bt可湿粉的敏感性,用苏抗103饲喂的是用苏棉12的0.54、0.610、.80、0.48倍,幼虫用苏抗103浸渍药剂饲喂及用苏棉12浸渍药剂饲喂,前者比后者对药剂的敏感性增强。与取食苏棉12相比,取食苏抗103的斜纹夜蛾幼虫。存活率降低了30%,幼虫期延长了9.6 d,龄数由6龄增加到8龄,且体内乙酰胆碱酯酶及羧酸酯酶的比活力明显提高。[结论]苏抗103与化学药剂配合使用后使得斜纹夜蛾的敏感性增强。     

B.t杀虫剂预处理缓解棉铃虫对化学农药抗性及机理的研究

 B.t杀虫剂亚致死剂量处理24h后,敏感品系和田间抗性品系的棉铃虫二龄幼虫生长、发育受到抑制，对氰戊菊酯的敏感性分别提高到12.9和34.4倍。B.t杀虫剂预处理和未处理对照之间的棉铃虫二龄幼虫体内α-乙酸萘酯酶和乙酰胆碱酯酶活力无显著差异,谷胱甘肽-S-转移酶活力差异显著。与未处理对照相比较,B.t杀虫剂预处理田间抗性棉铃虫二幼虫的α-乙酸萘酯酶动力学值降低,对乙酰胆碱酯酶特异性抑制剂亲和力增高。聚丙烯酰胺凝胶电泳测定显示，试虫酯酶同工酶活力预处理组均低于未处理对照组。田间抗性品系中，B.t杀虫剂预处理后棉铃虫二龄幼虫E#-6酯酶同工酶带(乙酰胆碱酯酶同工酶带)消失。这一结果为深入研究生物杀虫剂和化学农药的联合使用提供了理论基础。     

纳豆激酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

利用PCR方法以分泌纳豆激酶的纳豆杆菌染色体DNA为模板扩增纳豆激酶基因,将该基因克隆到质粒载体PUC19上,筛选重组子,通过限制性内切酶和PCR技术分析初步确定该重组子所携外源基因为纳豆激酶基因。利用基因重组技术构建了纳豆激酶基因的表达载体,并在大肠杆菌中进行了表达,凝块溶解时间法（CLT）测出表达产物具有溶解血栓活性。在确定了最佳培养时间与诱导时间后,SDS-PAGE分析结果表明基因表达产物为分泌型,蛋白表达量占菌体蛋白的12%左右。     

水稻组蛋白H2B.7基因的分离和表达模式研究

选取水稻组蛋白H2B的H2B.7基因进行了表达模式分析,发现其在水稻根、茎、叶和穗等组织中为组成型表达,但在激素和胁迫处理时表达模式发生变化,如在2,4-D、α-萘乙酸(NAA)、乙烯以及热激处理时表达水平上调,在激动素(KT)和多效唑处理时表达水平下调,说明水稻组蛋白H2B.7基因的表达在植物内外环境变化时也会相应发...     

胆固醇氧化酶基因的克隆及其在大肠杆菌中的表达

采用PCR方法从来源于蒙古野驴的马红球菌(Rhodococcus equi)4-2G2菌株中分离出编码胆固醇氧化酶的新基因(choEW),其与已知的胆固醇氧化酶基因choE和choB同源性均达99％;按其推断的氨基酸序列与choE和choB相比在485位缺少一个氨基酸,分析认为choEW与choB和choE属于同一基因家族。将choEW插入到原核表达载体pET-His中,构建出重组质粒pETW,并转化Escherichia coli BL21(DE3)plysS获得工程菌。经IPTG诱导后表达出分子量约为56 kD的蛋白质,与核苷酸序列推断的蛋白大小相符。目的蛋白表达量约占细胞总蛋白的11.9％。     

β-甘露聚糖酶基因克隆与在大肠杆菌中表达

为了通过基因工程方法在大肠杆菌中发酵生产β-甘露聚糖酶,采用多重比较几种来源的β-甘露聚糖酶氨基酸序列,获得了该酶的保守结构域,并按此设计简并引物．以能水解魔芋葡甘聚糖的枯草杆菌属野生筛选菌种A33为材料,通过简并引物PCR法从A33基因组中扩增出β-甘露聚糖酶基因核心区段．经过克隆、测序及BLASTN比对分析,证实该DNA区段推导的编码蛋白具有β-甘露聚糖酶的保守结构域,属于该酶家族中的一员．将该片段构建到大肠杆菌表达载体pRsET-A并转入大肠杆菌表达系统BL21 DE3（pLysS）,经过诱导获得了此酶的高效表达．     

大肠杆菌甘露醇-1-磷酸脱氢酶基因的克隆与表达

以大肠杆菌(Escherichia coli)W3350菌株总DNA为模板,根据已报道的几种生物的甘露醇-1-磷酸脱氢酶(mannitol-1-phosphate dehydrogenase)基因(mtlD)序列设计引物,通过PCR扩增到1条长约1.15 kb的特异片断,把该片断连接到pUCm-T载体上进行测序。序列分析结果表明,该基因编码区全长1149 bp,共编码382个氨基酸,与报道的mtlD基因修正序列完全一致。将该基因插入到原核表达载体pET28a(+),IPTG诱导表达后经SDS-PAGE分析,发现在约45 kD处明显比对照多出1条带,凝胶扫描后经Bandscan 5.0软件分析表明,该特异条带的蛋白含量占菌体可溶性总蛋白的72.9%。Western blot检测其为带组氨酸标签的融合蛋白,而质谱分析证实其为甘露醇-1-磷酸脱氢酶。转化子的耐盐能力比对照提高了约20%。该基因提交到GeneBank数据库,返回的接受号为DQ660889。     

小麦种子过氧化物酶基因wp1的克隆及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆小麦种子过氧化物酶基因wp1,并利用原核系统表达纯化。【方法】通过RT-PCR从小麦未成熟种子中扩增wp1基因cDNA,构建His-tag和MBP融合表达载体,并在大肠杆菌中进行表达。使用直链淀粉亲和层析获得MBP-WP1融合蛋白,并以ABTS为底物检测酶活性。【结果】获得的wp1基因cDNA编码一种358个氨基酸残基的蛋白产物,其序列与大麦BP1相似性高达89%;空间结构预测结果表明,小麦WP1属于第三类过氧化物酶,具有该家族成员典型的血红素和钙离子结合位点;His-Tag融合的WP1主要以包涵体形式存在,而MBP融合的WP1主要以可溶形式存在,表达量分别达到总蛋白的18.2%和34.6%;纯化获得的MBP-WP1融合蛋白可检测到过氧化物酶活性。【结论】使用原核系统可高效表达出可溶性的、具有部分活性的WP1蛋白。     

苏云金芽孢杆菌新分离株S_(18-4) δ-内毒素基因在Btk·BE_(20)中的克隆和表达

选用土壤新分离株Ｓ１８－４为供体菌,以ＰＨＴ３１０１穿梭质粒为载体,载体和供体ＤＮＡ用Ｐｓｔｌ酶切后进行连接,用电激法将重组质粒转入苏云金芽孢杆菌无晶体突变株Ｂｔｋ·ＢＥ２０中。经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白电泳及扫描电镜观察,证明δ－内毒素基因得到了表达,并具有很高的表达量。生物测定结果显示,重组株对夜蛾科幼虫具有比野生株Ｓ１８－４更强的杀虫毒性。     

PuGV-Ps对甜菜夜蛾中肠液酶解δ-内毒素的影响

粘虫颗粒体病毒(PuGV-Ps)总蛋白酶活力测定表明,PuGV-Ps在pH 7.38～10.38范围内均具有蛋白酶活性,且酶活力随pH的升高而显著提高.4种蛋白酶抑制剂均能抑制PuGV-Ps的蛋白酶活力,以大豆胰蛋白酶抑制剂的抑制作用最强,表明PuGV-Ps的蛋白酶活性是以胰蛋白酶为主要活力的多种蛋白酶的活性特征.PuGV-Ps对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)中肠酶液离体蛋白酶活力及取食PuGV-Ps后总蛋白酶活力的影响测定表明,在中肠液酶适宜pH(9.38～10.38)范围内,PuGV-Ps在一定程度上抑制了中肠酶液的总蛋白酶活力.SDS-PAGE试验表明,PuGV-Ps影响甜菜夜蛾中肠酶液对苏云金杆菌(Bacillus thuringiensis) δ-内毒素的降解活化作用,表现在对130 ku的δ-内毒素酶解活化成60～87 ku的活性多肽影响不大,但对其进一步降解具有抑制作用.不同缓冲液同样影响甜菜夜蛾中肠酶液对δ-内毒素的降解,Na2CO3是影响降解程度的重要因子.     

芽孢杆菌SP A3β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌中的表达

将含β-葡聚糖酶基因的重组克隆载体进行亚克隆,用BamHⅠ和 XhoⅠ双酶切后,与相同酶切的表达载体pET-30a相连接,构建重组表达载体,在大肠杆菌BL21中表达,蛋白质电泳结果表明在25.0 KD处有表达带,酶活力达85.9U/mL,为出发菌的31多倍.     

桃PGIP蛋白基因片段的克隆、序列分析及在大肠杆菌中的表达

【目的】克隆桃（Prunus persica）多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白（polygalacturonase-inhibiting protein,PGIP）基因,并进行原核表达研究。【方法】根据李属植物pgip保守区域设计1对特异引物,以桃叶片总RNA为模板,通过RT-PCR获得了约1 kb的cDNA片段,T/A克隆后进行序列测定,并对该序列进行分析。随后将该蛋白成熟肽cDNA片段克隆到原核表达载体pET-32a(+)中,构建融合表达质粒,转化到Escherichia coli Rosetta-gami（DE3）pLysS中进行表达。【结果】测序结果显示,桃多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白cDNA编码区长993 bp,编码330个氨基酸残基,命名为Pppgip。PpPGIP分子量为36.4 kD,等电点为7.42,信号肽为N端24个氨基酸残基,具有7个潜在的N-糖基化位点。Pppgip与李属其它pgip核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为93.2%～94.6%和89.7%～92.7%。同源树分析表明,该基因明显区别于其它pgip,与马哈利樱桃pgip的关系较近,与寿星桃、桃栽培品种‘久保’等pgip的关系都较远。该基因所编码的蛋白质的三维结构含11个α-螺旋和21个β-折叠,中心LRR结构域由10个串联的LRRs基序组成。原核表达产物经SDS-PAGE分析表明,重组蛋白主要以包涵体形式出现。【结论】克隆了桃PGIP基因,并可在大肠杆菌中表达。     

棉铃虫对苏云金杆菌(B.t)的抗性监测及延缓抗性策略

室内采用Ｂ．ｔ连续多代汰选的棉铃虫,对Ｂ．ｔ能产生较强的抗药性,抗性倍数为２４．１３。采用浸叶法测定宿县、蒙城、安庆棉区棉铃虫对Ｂ．ｔ的抗性,结果表明：宿县、蒙城淮北棉区,棉铃虫对Ｂ．ｔ已产生早期低度抗性,抗性倍数分别为３．４１和２．５２。安庆棉区棉铃虫对Ｂ．ｔ尚未产生抗性,抗性倍数为１．３７。讨论了治理抗性的对策。     

薹菜CYP79B5基因的克隆及原核表达

以薹菜品种京研薹菜叶片cDNA为模板,采用RT-PCR技术,获得了编码薹菜CYP79B5基因全序列1 847 bp,包含有1 620 bp的开放阅读框,编码540个氨基酸.以薹菜基因组DNA为模板,获得了2 112 bp的目的片段.经比对发现其氨基酸序列与油菜、白芥、拟南芥等CYP79B5编码的氨基酸序列具有较高同源性,与油菜同源性达100%.经过生物信息学分析,发现所推导的氨基酸序列具有明显的CYP蛋白信号域,且可以在SWISS-MODEL数据库中搜索到与之相近的三维结构.扩增CYP79B5完整的编码区序列,构建pET-24α(+)重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导融合蛋白高效表达,SDS-PAGE电泳检测发现在相对分子质量64 000处有一特异条带,与预期的目的产物蛋白带大小一致.     

大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位在毕赤酵母中的表达及鉴定

为了在毕赤酵母中高效表达大肠杆菌不耐热肠毒素B亚单位(LTB)及研制具有粘膜免疫佐剂活性的无毒重组LTB,采用PCR方法从产毒型大肠杆菌H44815菌株扩增获得LTB完整编码区DNA,将其克隆到酵母表达载体pPIC9K的分泌信号肽基因下游,构建真核表达载体pPIC9K-LTB;重组质粒经核苷酸测序确认并线性化后电转化毕赤酵母菌株KM71,PCR筛选转化子,并以小量诱导表达筛选高效表达工程菌株,最后Western blotting分析甲醇诱导上清中的LTB及采用亲和层析和HiTrap Desalting预装柱脱盐纯化蛋白。结果表明,PCR克隆获得的LTB编码DNA序列与GenBank登录DNA序列完全一致,定向插入pPIC9K载体,可获得表达LTB的酵母分泌表达载体pPIC9K-LTB;电转化后的重组酵母菌KM71诱导表达产物经SDS-PAGE和Western blotting分析,发现甲醇诱导的培养基上清中含LTB,且具有较好的免疫原性。     

AtDREB2B基因的克隆及植物表达载体的构建

[目的]获得耐旱转录因子的植物表达载体,进而转化植物获得耐旱性提高的新植物株系。[方法]提取脱水处理的拟南芥总RNA,利用AtDREB2B特异引物通过RT-PCR扩增出1.2kb片段,并将其克隆至pBS-T上,测序。[结果]序列分析表明,该克隆序列与GenBank上登录AtDREB2B基因序列的一致性为100%。进一步通过片段的亚克隆,将其构建至植物表达载体pCAMBIA1301和pBin438上,分别由rd29A启动子和重复35S启动子调控基因表达。[结论]成功构建了2种AtDREB2B的植物表达载体,并通过冻融法转化根癌农杆菌GV3101,为农杆菌介导的AtDREB2B基因对植物的遗传转化奠定基础。     

棉铃虫α-微管蛋白基因的克隆、序列分析及表达模式检测

【目的】克隆及序列分析棉铃虫（Helicoverpa armigera）α-微管蛋白基因的cDNA序列,并检测棉铃虫α、β两种微管蛋白基因的表达情况。【方法】以棉铃虫3龄幼虫为试验材料,采用RT-PCR及RACE技术克隆棉铃虫α-微管蛋白基因（HeTubA）,采用荧光定量PCR（QRT-PCR）技术分析棉铃虫α、β-微管蛋白基因在不同生长发育阶段及成虫器官中的表达模式。【结果】克隆得到棉铃虫α-微管蛋白基因（GenBank登录号为JQ069957）。序列分析表明,HeTubA开放阅读框1 353 bp,编码450个氨基酸组成的多肽,氨基酸序列包含多个α-微管蛋白保守区。与其它一些昆虫的一致性分析表明,HeTubA与八字地老虎（Xestia c-nigrum）、柑橘凤蝶（Papilio xuthus）及家蚕（Bombyx mori）的α-微管蛋白氨基酸序列同源性最高,α-微管蛋白基因在长期进化中非常保守。荧光定量PCR表明,棉铃虫α、β-微管蛋白基因不具有生长发育阶段及成虫器官特异性,且二者均在复眼表达高,腹部表达低;HeTubA在末龄幼虫期和蛹期高水平表达,HeTubB在末龄幼虫期和成虫期高水平表达。【结论】成功克隆了棉铃虫α-微管蛋白基因,对2种微管蛋白基因的表达模式进行了检测,进一步进行了蛋白质3D结构的构建,可用于深入研究2种微管蛋白基因的功能及开发新型杀虫剂。     

牛白细胞介素15基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

根据GenBankTM中发表的牛IL-15基因序列设计并合成了特异性引物,以经LPS和ConA刺激的牛外周血单个核细胞提取的总RNA为模板,用RT-PCR方法扩增出长度约500 bp的目的基因片段,并将该基因克隆到pMD18-T载体上.酶切、PCR及序列测定结果表明,获得了牛IL-15全长基因的克隆.进一步通过PCR方法得到缺失其N端48个氨基酸的信号肽序列的牛IL-15成熟蛋白基因,将其亚克隆到原核表达载体pET-32a上,构建重组表达质粒pET-IL-15,转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导,该菌表达以包涵体形式存在的相对分子质量约为33 000的融合蛋白.用Ni螯合层析方法纯化表达的蛋白.Western-blot试验显示表达的重组融合蛋白能与抗6×His的单克隆抗体发生反应,同时也能与鼠抗猪IL-15的多克隆抗体发生明显交叉反应.