修饰的B.t.K—δ—内毒素基因在大肠杆菌及烟草中表达的抗虫性

利用合成的寡型核苷酸引物ＰＣＲ扩增技术对Ｂ．ｔ．ｋδ－内毒素基因进行了克隆和修。大肠杆菌中表达的抗虫试验表明该修饰过的Ｂ．ｔ．ｋδ－内毒素基因对鳞翅目昆虫如烟青虫和棉铃虫有较强的毒杀作用，随后，通过农杆菌介导将该基因转入烟草，ＲＮＡ点杂交及抗虫试验表明Ｂdisplay status     

CrylA杀虫基因的人工合成

苏云金芽孢杆菌(B.t.)杀虫蛋白,不仅专一性地杀死昆虫,而且对人、畜无毒无害。80年代中期,将酶切修饰后的B.t杀虫基因导入植物,获得了具有抗虫作用的转基因烟草及番茄植株,受到国内外科学家的高度重视。但导入棉花等植物后,由于表达量低,无抗虫效果。为了使原核B.t.杀虫基因能在真核植物体内有效地表达,使转抗虫基因植株获得抗虫能力,我们按照植物基因组优化密码子,在不改变B.t.杀虫蛋白氨基酸序列的前提下,完全人工合成了B.t.CryIA杀虫基因,经定性杀虫试验,具有生物杀虫活性。     

苏云金芽孢杆菌δ-内毒素基因导入水稻原生质体后获得转基因植株

本实验将苏云金芽孢杆菌的δ-内毒素基因导入水稻原生质体并得到了具有这种基因的转化水稻植株。所用的重组质粒Pgy61和Pgyck63带有一个由35S启动子,δ-内毒素蛋白基因,β-葡萄糖苷酸酶（GUS）报告基因和NOS终止子组成的嵌合基因。δ-内毒素基因与GUS基因是融合基因,而且GUS基因在δ-内毒素基因的下游。水稻原生质体是从细胞悬浮系中分离出来,用聚乙二醇（PEG）方法将带有δ-内毒素基因的质粒导入水稻原生质体。经荧光法测定,由这些原生质体产生的愈伤组织具有很高的β-葡萄糖苷酸酶活性,说明β-葡萄糖苷酸酶基因在水稻愈伤组织中得到表达,表明δ-内毒素基因在水稻愈伤组织中已被翻译（表达）。另外,从这些转化的愈伤组织中得到正常的绿色植株,经分子杂交（Southern Blot）证明δ-内毒素基因已整合进水稻基因组中。     

抗虫基因及其在植物上的应用

苏云金芽孢杆菌δ－内毒素基因和蛋白酶抑制剂基因是目前在植物抗虫基因工程研究领域广泛应用的两类抗虫基因。本文参考了３０余篇文献，对它们的抗虫机理及应用现状作了评述。     

转双基因烟草抗虫931的选育与应用

利用现代生物技术培育出转双基因高抗虫烤烟品系抗虫９３１。研究表明：抗虫９３１对烟青虫具有高效杀虫作用，烟青虫幼虫取食其烟叶后，在２．５～３．５天内可１００％的死亡，并对各龄期幼虫的抗性表现一致。在烟草整个生育期内不使用农药即可保证烟田无烟青虫的危害。转双基因烟草抗虫９３１的农艺性状、品质性状基本上保持了ＮＣ８９品种的特征特性     

基于GR79 EPSPS筛选标记的抗虫抗除草剂表达载体构建及抗性鉴定

虫害和草害是农业生产中两大主要危害。目前,尽管转基因抗虫和抗除草剂作物相继报道和应用,然而我国抗虫抗除草剂复合性状作物培育仍然明显滞后,而且多依靠传统杂交选育的手段,费事费力、周期长。根据苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis, Bt）Cry1Ac蛋白结合结构域和毒性结构域特征,人工合成杀虫基因cry1Ac-2.5。同时,利用抗除草剂基因GR79 EPSPS替换卡那霉素筛选标记,构建基于草甘膦除草剂筛选标记的复合抗虫抗除草剂植物表达载体,并转化烟草。qRT-PCR结果表明转基因烟草cry1Ac-2.5和GR79 EPSPS基因转录水平均成功表达,经Bt和GR79试纸条检测表明上述基因在蛋白水平正确翻译。抗性实验表明,转基因烟草愈伤经草甘膦筛选,阳性率达到80%,且转基因烟草耐受100 mg/L草甘膦处理。抗虫实验表明,饲喂cry1Ac-2.5转基因烟草4 d后,棉铃虫幼虫死亡率为90%左右,表明人工基因cry1Ac-2.5具有显著的的抗虫效果。以上结果表明,构建的抗虫抗除草剂植物表达载体（Cry1Ac-2.5+GR79 EPSPS）将抗虫基因和抗除草剂基因有效合并,对于快速培育抗虫抗除草剂作物具有指导意义。     

抗虫转基因作物研究进展

简要介绍了转基因作物 (GMO)的发展概况 ,对近年来国内外抗虫 GMO在转 B.t.毒素蛋白GMO;转蛋白酶抑制剂 GMO;转植物凝集素 GMO;其他类型抗虫 GMO;抗虫的基因沉默与失活现象等 5个方面的研究进展进行了论述。最后 ,对抗虫 GMO的发展前景进行了展望。     

转Bt基因抗虫红麻福红952后代的分子杂交验证

利用花粉管通道法将抗虫质粒DNA导入受体红麻品种福红952,在受体品种中获得Bt抗虫目的基因的表达.分别用PCR和Southern杂交技术,对所转化的红麻转基因4个世代的株系进行分子验证,结果表明:4个世代中都检测到B t抗虫目的基因片段,说明外源基因已经整合到红麻的基因组中并获得了稳定遗传.     

转Bt基因抗虫红麻福红952后代的分子杂交验证

利用花粉管通道法将抗虫质粒DNA导入受体红麻品种福红952,在受体品种中获得Bt抗虫目的基因的表达.分别用PCR和Southern杂交技术,对所转化的红麻转基因4个世代的株系进行分子验证,结果表明：4个世代中都检测到B t抗虫目的基因片段,说明外源基因已经整合到红麻的基因组中并获得了稳定遗传.     

蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析

 【目的】克隆蜡梅凝集素基因并研究其抗蚜虫和抗蛞蝓活性,为植物抗虫基因工程提供理论依据和试验材料。【方法】通过随机挑选克隆测序的方法,从蜡梅花cDNA文库中克隆蜡梅凝集素基因,并构建植物表达载体,用农杆菌介导的叶盘法转化烟草,并对转基因植株进行抗蚜和抗蛞蝓试验。【结果】从蜡梅花cDNA文库中克隆到了一个凝集素基因CpLEC(GenBank登录号：DQ352145),该基因全长871 bp, ORF框长558 bp, 编码185个氨基酸。该基因DNA分析表明其不含内含子。具有单子叶植物甘露糖凝集素基因家族的特征,有2个典型的甘露糖结合位点(QXDXNXVXY),和1个变异的可能结合位点(HXGXNXVXY)。Southern杂交表明,该基因在蜡梅基因组中为多拷贝。构建了35S启动子控制下的CpLEC基因的植物表达载体pBI121-CpLEC,利用根癌农杆菌介导法转化烟草获得抗卡那霉素的植株。PCR和半定量RT-PCR分析表明,CpLEC基因已经整合到植物基因组中并在转录水平上得到了有效表达。抗蚜虫鉴定表明,转基因植株及其离体叶片有效地抑制了蚜虫的群体增长率,平均抑制率分别为60%和68%。抗蛞蝓试验结果表明转基因植株有明显的抗蛞蝓活性,转基因烟草虫害指数为0.17,远低于非转基因烟草的虫害指数0.96。【结论】克隆获得了蜡梅凝集素基因CpLEC,通过转基因手段分析其抗蚜和抗蛞蝓活性,结果表明该基因对抗虫基因工程有重要的应用价值。     

基因工程在作物抗虫育种中的应用

目前在农作物上已能通过椤癌农杆菌、发根农杆菌、花椰菜花叶病毒(CaMV)、ANA病毒等为中介的基因工程方法,将一些抗虫基因如苏云金杆菌(Bacillus thurin、giensis)抗虫毒素基因(B. t毒素基因)、菜豆抗虫蛋白基因(胰蛋白酶抑制蛋白CpTI基因)、蓼草抗虫基因等导入水稻、玉米、棉花、马铃薯、烟草、番茄等的植物细胞,     

苏云金芽胞杆菌cry1Ia32基因克隆和原核表达的研究

根据GenBank中cry1I类基因序列设计特异性引物,以Bt SC-13菌总DNA为模板PCR扩增得到2 151bp的cry1Ia全长基因。该基因编码蛋白由717个氨基酸组成,相对分子量为80.9kDa,等电点为6.57,编码蛋白与Cry1Ia1(CAA44633)亲缘关系最高达99.03%的序列同源性,该蛋白被Btδ-内毒素国际命名委员会正式命名为Cry1Ia32(登录号为JX944039)。cry1Ia32基因通过表达载体pET-21b在大肠杆菌中高效表达分子量为81kDa的蛋白,诱导表达的Cry1Ia32蛋白对棉铃虫和甜菜夜蛾的2龄幼虫具有较高杀虫活性,LC50值分别为0.025mg/mL和0.011mg/mL,为抗虫转基因植物研究提供了新的基因。     

双价抗虫基因共转化烟草叶绿体的研究

 分别构建苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因 [BtCryIA(C) ]和水稻巯基蛋白酶基因 (Oryzacystatin ,OC)叶绿体转化载体 ,其中Bt基因叶绿体转化载体以烟草叶绿体基因trnH psbA trnK为同源片段 ,以水稻 (OryzasativaL .)叶绿体 psbA基因启动子和终止子为调控基因 ;OC基因叶绿体表达载体以烟草叶绿体基因片段 psbA ORF5 12为同源片段 ,以烟草叶绿体 16S启动子和终止子为调控基因 ;两载体均以壮观霉素抗性基因 (aadA)为筛选基因。利用基因枪方法 ,共转化烟草叶片 ,获得壮观霉素抗性植株。经Southern、Western检测、表达蛋白活性测定证明 ,双价抗虫基因己整合到烟草叶绿体中并得到表达。转基因植株抗棉铃虫试验表明 ,转基因植株具有显著杀虫活性     

农杆菌介导BtCry1Ac、NTHK1双价基因转化烟草植株的研究

为探讨多基因植物转化载体p096899中外源基因BtCry1Ac和NTHK1在转基因植株中的表达情况,通过根癌农杆菌介导的叶盘转化法转化野生烟草,经卡那霉素筛选,初步获得了10株转基因烟草植株.经PCR鉴定,证明目的基因已被整合到烟草基因组中.利用荧光定量PCR和ELISA分析目的基因在转录水平和翻译水平的表达量,并对转基因烟草株系进行了抗虫试验和耐盐性试验.结果表明,目的基因在转录水平和翻译水平分别得到表达,但表达量存在差异,其中2号转基因株系毒蛋白表达量最高,其含量达可溶性总蛋白的0.028 5％;饲虫试验中,部分转基因烟草株系对斜纹夜蛾的毒杀作用明显高于未转化烟草,其中2号转基因株系的抗虫性最高,饲喂第6天斜纹夜蛾幼虫死亡率达到75.56％,与Bt毒蛋白表达量相一致;在盐胁迫下,转基因烟草的叶片生长状况均好于对照(非转基因)烟草的生长.证明BtCry1Ac基因和NTHK1基因的转入在一定程度上提高了烟草的抗虫性和耐盐能力.     

转Bt基因抗虫青菜的苗期性状评价

以B t转基因抗虫青菜株系T2、T4及原亲本上海青为材料,对种子与苗期性状进行考察与分析。结果发现转基因株系的种子远远小于对照,发芽速度却快于对照,后期生长明显比对照慢。由此表明,Bt基因的插入对萌芽和苗期性状相关基因的表达有较大影响。     

水稻组蛋白H2B.7基因的分离和表达模式研究

选取水稻组蛋白H2B的H2B.7基因进行了表达模式分析,发现其在水稻根、茎、叶和穗等组织中为组成型表达,但在激素和胁迫处理时表达模式发生变化,如在2,4-D、α-萘乙酸(NAA)、乙烯以及热激处理时表达水平上调,在激动素(KT)和多效唑处理时表达水平下调,说明水稻组蛋白H2B.7基因的表达在植物内外环境变化时也会相应发...     

激健助剂农药减施技术防治烟草烟青虫效果研究

试验表明, 激健助剂农药减施技术防治烟草烟青虫效果较好,农药加激健助剂15毫升/亩,农药减少用量50%,与农药常量的防效差异不明显。供试药剂在试验剂量范围内对作物安全,且激激健助剂可减少农药对烟草的伤害,提高烟草免疫力,促进烟草生长,降低烟草农药残留,提高烟草品质、产量,是防治烟草烟青虫理想的新技术。     

利用遗传工程植物控制植物害虫

本世纪,植物害虫控制的主要手段是使用化学杀虫剂,由于其种种的毒副作用和环境污染,要求限制化学杀虫剂使用的呼声越来越高.因而,以苏云金芽孢杆菌(B.t.)为代表的生物杀虫剂越来越受到重视.从杀虫微生物中分离出编码杀虫蛋白质的基因,转移到植物基因组中,将使得植物建立起内源抗虫机制.此方法比传统的害虫控制方法有许多优点,如在土壤和水体中无残留,对非靶昆虫无毒害,对难以或不能喷洒到的植物部分如组织内部和根也能起作用,等等.因此,自从1987年首次将B.t.杀虫基因导入烟草以来,培育抗虫转基因作物已成为作物改良的重要研究领域.     

白肋烟转基因育种研究

利用农杆菌介导法将具有广谱抗病的葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GO)基因及抗虫半夏凝集素(Pinella Ternata Agglutinin,PTA)基因转化到烟草中,并研究了影响转化和抗性植株再生的一些因素。结果表明,基因型是影响转化和抗性植株再生的关键因素,试验所用的3个品种KY14、KY8959、TN90中,KY14转化效率最高。用于烟草转化的侵染时间以15min为宜,共培养时间以2d最佳。PCR分子检测表明,外源GO基因及PTA基因已转入到烟草KY14中。淀粉-碘化钾显色反应检测到了转基因植株产生的过氧化氢,证实GO基因已经在烟草中发挥功能。     

融合杀虫基因植物表达载体的构建及转基因烟草的获得

 构建了人工合成的 GFM Cry IA杀虫基因和经过修饰的 Cp T 基因的融合杀虫基因高效植物表达载体p GBIF4 ABC。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草 ,获得 4 2株卡那霉素抗性植株 ,经棉铃虫杀虫试验表明 ,3株表现高抗 ,14株表现中抗 ,2 5株感虫。对其中 7株烟草植株进行 PCR和 Southern印迹 ,4株烟草基因组中有融合杀虫基因的整合 ,为转基因植株。其中 2株的抗虫性为高抗 ,1株中抗 ,1株不抗