基于16S rDNA基因文库的黄河三角洲盐生植被土壤细菌群落多样性研究

[目的]研究黄河三角洲光板地及2种盐生植被(獐茅和罗布麻)下土壤细菌群落结构多样性,探究其与植被演替的关系.[方法]采用细菌16S rDNA基因文库方法,各文库挑选200个阳性克隆子进行测定.[结果]光板地、獐茅和罗布麻3个文库中分别得到121、150、155条有效序列.獐茅土壤细菌的Shannon指数和ACE指数最高.土壤中检测到变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacte-roidetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)等共8门.变形菌门在光板地、獐茅土壤和罗布麻土壤中的相对丰度分别为37.45％、51.09％、37.11％,拟杆菌门分别为33.02％、3.03％、4.47％,其他细菌相对丰度均较低.[结论]3种覆被类型下土壤细菌在种群组成与分布上差异明显,变形菌为优势菌群.当盐生植被处于不同演替阶段时,土壤细菌群落结构差别较大.     

土壤宏基因组的提取及基于免培养技术分析细菌16S rDNA

采用CTAB—SDS-冻融法和玻璃粉吸附法提取土壤宏基因组（metagenome），经琼脂糖凝胶电泳后用回收试剂盒对其进行纯化。以细菌16S rDNA通用引物从宏基因组中扩增出V8和V9两个高变区，回收纯化后与克隆载体pMD18-T连接，转化大肠杆菌DH5a，随机挑取一个阳性克隆菌进行序列测定，经BLAST分析表明该序列所代表的是一个不动杆菌属（Acinetobacter）细菌。本研究结果为分析土壤微生物种群结构和直接从土壤中分离功能基因奠定了基础。     

传统分离培养结合PCR-DGGE法分析盐水鸭中的细菌多样性

采用传统分离培养和PCR-DGGE方法,对盐水鸭贮藏初期的细菌多样性进行了分析。结果表明,由传统分离与分子鉴定方法获得3个属的细菌类群,其中Staphylococci saprophyticus、Macrococcus caseolyticus、Weissella pa-ramesenteroides和Weissella confusa为优势菌群。对通过PCR-DGGE方法得到的条带序列进行测序和序列分析,发现Staphylococci saprophyticus、Macrococcus caseolyticus、Weissella sp.、Halomonas sp.或Cobetia sp.是盐水鸭中的优势菌群。传统分离培养与PCR-DGGE方法获得的结果相互结合,从而更有效地确定了盐水鸭贮藏初期的细菌组成,为盐水鸭的生物保鲜提供了理论基础。     

松嫩草地土壤细菌群落 16S rDNA V3 片段 PCR 产物的 DGGE 分析

从松嫩草地9种植物群落覆盖下的土壤中抽提细菌总DNA,直接扩增16SrDNAV3可变区,应用变性梯度凝胶电泳（DGGE）分析16SrDNAV3可变区的多态性,发现不同种类植物群落地下土壤细菌的种类以及生物量都有所不同,并且地上植被的盖度影响了地下土壤微生物的物种多样性。     

烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响

为了进一步验证烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响,利用Mi Seq平台对烟草秸秆未还田(no Tobacco Stalk Returning,n TSR)、1倍烟草秸秆还田(TSR1)和2倍烟草秸秆还田(TSR2)土壤的16S r DNA V3+V4区进行了测序分析。n TSR、TSR1和TSR2的Total Tags数目分别为41949、54761和60063,其OTUs(Operational Taxonomic Units)数目分别为1193、1275和1298。TSR1、TSR2丰度排名前35个属的物种丰度和丰度排名前10个属的OTUs丰度聚在一起,与n TSR有较为明显的区别。TSR1、TSR2的OTU(97%)、OTU(95%)、Chao1(97%)、Chao1(95%)、Shannon(97%)和Shannon(95%)指数均高于n TSR的。另外,n TSR与TSR1、TSR2之间的基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类有明显差别。因此,TSR1、TSR2土壤细菌多样性高于n TSR的,而TSR1和TSR2土壤细菌多样性无明显差异。     

应用变性梯度凝胶电泳和16S rDNA序列分析对山羊瘤胃细菌多样性的研究

 以取自3头安装有永久性瘤胃瘘管的土种山羊的瘤胃内容物为材料, 经过DNA抽提和PCR扩增, 扩增产物利用变性梯度凝胶电泳技术(DGGE，一种DNA指纹技术)分析瘤胃细菌在两种日粮条件下的多样性。同时利用基因序列分析技术，分析了16个在DGGE胶上有匹配带的克隆的16S rDNA序列，并与现有的数据库进行了比较。结果表明，饲喂基础日粮时3头山羊瘤胃内容物的DGGE图谱有一定的相似性(43%～55%)；饲料中添加大豆黄酮一定程度上影响了瘤胃细菌的组成，DGGE谱带变化程度分别为1号36%、2号46%、3号30%。基因序列分析表明，DGGE图谱中优势条带的16S rDNA基因序列中有5个基因序列与基因数据库登录的相关序列的相似性大于97%，8个基因序列的相似性在90%～96%，余下的低于90%。相似性大于97%的5个克隆中，只有1个被鉴定为Prevotella sp.，其余4个都属于未被鉴定的瘤胃细菌。     

烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响

为了进一步验证烟草秸秆还田对土壤细菌多样性的影响,利用Mi Seq平台对烟草秸秆未还田(no Tobacco Stalk Returning,n TSR)、1倍烟草秸秆还田(TSR1)和2倍烟草秸秆还田(TSR2)土壤的16S r DNA V3+V4区进行了测序分析。n TSR、TSR1和TSR2的Total Tags数目分别为41949、54761和60063,其OTUs(Operational Taxonomic Units)数目分别为1193、1275和1298。TSR1、TSR2丰度排名前35个属的物种丰度和丰度排名前10个属的OTUs丰度聚在一起,与n TSR有较为明显的区别。TSR1、TSR2的OTU(97%)、OTU(95%)、Chao1(97%)、Chao1(95%)、Shannon(97%)和Shannon(95%)指数均高于n TSR的。另外,n TSR与TSR1、TSR2之间的基于Weighted Unifrac距离和Unweighted Unifrac距离的UPGMA聚类有明显差别。因此,TSR1、TSR2土壤细菌多样性高于n TSR的,而TSR1和TSR2土壤细菌多样性无明显差异。     

基于PCR-DGGE的中江丹参轮作期间土壤细菌遗传多样性变化特征

为了解四川中江丹参轮作期间土壤细菌遗传多样性变化特征,分离提取土壤微生物DNA,以细菌通用引物PCR扩增,DGGE分离,切割条带、回收并测序,在GenBank中查得菌种。结果表明,中江丹参轮作期间,土壤细菌主要群落包括:Alpha proteobacterium,Sphingomonas sp.,Uncultured bacterium isolate LH2-12,Uncultured bacterium isolate DGGE gel band h,Uncultured Arthrobacter sp.,Uncultured bacterium isolate DGGE gel band a1-11,Uncultured Sphingomonas sp.。休种1年与当年种植丹参土壤细菌多样性相似,而与休种3年土壤细菌种群结构有明显差异;休种第2年属于过渡。说明中江丹参轮作期休种为其土壤细菌群落遗传多样性逐渐恢复平衡过程;且休地第2年是关键时期,与笔者前期采用培养法及土壤真菌群落结构相关的研究结果一致。     

不同蔬菜连作对土壤细菌DNA分子水平多态性影响的研究

 采用从土壤中直接提取微生物总DNA，并用细菌16S rDNA特异性引物进行PCR扩增、变性梯度凝胶电泳（DGGE）、克隆和测序等一系列分子生物学手段，研究了不同蔬菜连作对土壤中细菌群落结构的影响。结果表明,采自同一地区的土壤样品，其DGGE图谱的相似性很高；同时蔬菜连作对土壤中细菌的群落组成产生影响，这种影响同蔬菜作物种类和连作年限有关。研究结果还表明，所取土样中的细菌大多数为Proteobacteria 类细菌，另外Acidobacteria、Sphingobacteria和Actinobacteria 类细菌只占少量比例。     

烟草内生细菌多样性研究

为了揭示烟草内生细菌多样性,选择K326、云85 和红花大金元3 个烤烟品种进行内生细菌的 分离和16S rDNA 序列分析鉴定,获得不同品种烟草内生细菌的多样性特征。结果显示,27 株内生细菌分 别属于枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis（33%）、蕈状芽孢杆菌Bacillus mycoides（4%）、芽孢杆菌属Bacillus sp.（11%）、肠杆菌属Enterobacter sp.（4%）、寡养单胞菌Stenotrophomonas sp.（4%）、热带根瘤菌Rhizobium tropici（4%）、假单胞菌属Pseudomonas sp.（4%）、土地芽孢杆菌属Terribacillus sp.（4%）,芽孢杆菌属 Bacillus sp. 为优势细菌类群。3 个品种的 Shannon index（H′）以K326 最高、为2.02,其次是云85、为1.48,红 花大金元最低、为1.3。     

应用PCR—DGGE技术研究四角蛤蜊的细菌多样性

应用PCR—DGGE技术对盘锦某滩涂四角蛤蜊Mactra venerformis体内的细菌多样性进行了分析。使用SDS裂解法提取样品的总DNA,采用大多数细菌通用引物F338GC／RS18从总DNA中成功扩增出16SrDNA片段,然后对PCR产物进行DGGE分析,并将DGGE图谱上部分条带回收、再扩增、克隆和测序：将所测序列在GenBank核酸数据库中进行检索,用BLASTN分析DNA序列获得相似性最近的细菌。DGGE图谱显示,四角蛤蜊体内的细菌种类比较丰富,且不同时间样品细菌的优势菌群结构有一定的差异。将所测条带序列进行比对,结果表明,细菌种群中包括支原体属Mycoplasma、假单胞菌属Pseudomonas、弧菌属Vibrio、红球菌属Rhodococcus和鞘氨醇单胞菌属Sphingomonas及不可培养的细菌。     

用16S rDNA序列分析方法鉴定4个拮抗细菌

用1对16SrDNA通用引物，对4个拮抗细菌96-38、96-41、96-79和9682的基因组DNA进行扩增，PCR产物经克隆、测序、同源性分析表明，这4个菌株的16SrDNA全长均为1513bp，同源性达99．79％，仅在13个碱基位点存在差异。Blast分析发现，这些菌株与Genbank收录的芽孢杆菌属5个菌株16SrDNA序列的同源性为99．1％～99．9％，由此推断这4个拮抗细菌为芽孢杆菌属细菌。     

三株田间分离大豆根瘤菌16S rDNA基因鉴定及序列比较

文章采用16S rDNA技术,对分离自黑龙江省的3株大豆根瘤菌进行了序列测定及分析,通过与模式菌株的比较确定其在系统发育中的地位。结果表明,3个菌株与慢生根瘤菌亲源最近,利用分析根瘤菌16S rDNA的方法来鉴定根瘤菌的准确性较高,可行性较好。     

广东茄科雷尔氏菌16S rDNA序列分析

应用PCR方法,获得了分离自广东番茄、茄子、辣椒、烟草、空心菜、沙姜、姜、马铃薯、花生、菊花、桑树和藿香共12种作物21个茄科雷尔氏菌菌株的16S rDNA.序列测定及比较结果表明,21个广东茄科雷尔氏菌菌株16S rDNA近全长序列均为1 528 bp,序列间同源率99.2%～100%;各菌株的16S rDNA序列间只有1～12个不等的碱基差异,其中20个菌株的458～460位及474位的碱基是ACT和T,而菌株HZ-1则是TTC和A,说明广东茄科雷尔氏菌的16S rDNA序列十分保守.系统进化分析结果显示,仅菌株HZ-1聚类于茄科雷尔氏菌2a亚组中,其余20个菌株均聚类于茄科雷尔氏菌区组1中.     

16SrDNA对四种常见细菌中的鉴定与应用

本实验利用16SrDNA序列分析技术,对来自犊牛腹泻粪便中的四株菌（A菌,B菌,C菌,D菌）进行菌种鉴定。使用16SrDNA通用引物,通过PCR扩增分别得到1500bp,与GenBank中序列进行比对。结果表明：A菌与肠杆菌属、B菌与短小芽孢杆菌、C菌与大肠杆菌、D菌与变形杆菌的同源性最高,相似率均达到了99％,初步确定A菌为肠杆菌属、B菌为短小芽孢杆菌、C菌为大肠杆菌、D菌为变形杆菌。本试验的目的是为16SrDNA在临床细菌的鉴定提供客观理论依据。     

黄喉拟水龟松鼠葡萄球菌16S rDNA的序列测定和系统进化分析

从患病的黄喉拟水龟肝脏、肾脏分离到1株葡萄球菌（YLD81101）,经人工感染实验证实其为该病的病原菌。为了从分子水平上对其进行分类学鉴定,采用扩增细菌16S rDNA的通用引物对该菌的16S rDNA进行PCR扩增、克隆及序列分析。结果扩增出长约1．5kp的目的片段,测序得到1条长度为1515bp的核苷酸序列（GenBank登录号GQ261178）。核苷酸相似性分析表明,所得序列与GenBank公布的松鼠葡萄球菌（Staphylococcus sciud,S．sciuri）CTSP9菌株16S rDNA核苷酸序列相似性最高（99．9％）。同时,用与该序列相关性较高的S．sciuri及常造成动物葡萄球菌病的S．aureus S、saufeuss．bsp．anaerobius、S.gallinarum、S.hyicus代表菌株构建的系统发育进化树显示,菌株YL081101与S.sciuri代表株聚为一簇。上述研究证实,分离菌株YL081101为松鼠葡萄球菌。     

16S rDNA文库法分析草鱼肝胰脏和胆汁细菌群落组成

利用16S rDNA文库随机测序法分析了草鱼肝胰脏和胆汁细菌菌落组成,结果表明,在肝胰脏中共鉴定出19种共生细菌,分别隶属于气单胞菌属、假单胞菌属、摩根菌属、不动杆菌属、弧菌属和变形杆菌属。气单胞菌属和假单胞菌属为优势属,气单胞菌属的丰度为36.17%,假单胞菌属为31.91%。其中,气单胞菌属的GZ16和假单胞菌属的GZ9菌株丰度最高,均为12.77%。在胆汁中共鉴定出10种共生细菌,分别隶属于气单胞菌属、假单胞菌属、摩根菌属和变形杆菌属。气单胞菌属和假单胞菌属为优势属,气单胞菌属的丰度为35%,假单胞菌属为27.5%。其中,变形杆菌属的DN1菌株丰度最高,为25%。肝胰脏中只有10.5%的细菌群落与胆汁的细菌群落相似,胆汁中只有20%的细菌群落与肝胰脏相似,表明草鱼肝胰脏和胆汁有各自特有的共生细菌群落。本研究结果,为进一步探讨肝胰脏和胆汁共生细菌的生理功能,以及细菌与宿主草鱼之间的协同进化提供了基础。     

用PCR-DGGE和16S rDNA测序解析吐温对绵羊瘤胃细菌多样性的影响

选取装置永久性瘤胃瘘管的中国美利奴绵羊,采用5×5拉丁方试验设计,在绵羊日粮中分别添加5或10 g/d Tween 20,3或6 g/d Tween 80,以空白为对照,采用PCR-DGGE技术研究不同水平的非离子表面活性剂Tween 20和Tween 80对绵羊瘤胃中细菌多样性的影响;对DGGE指纹图谱中的12个优势DNA条带的16S rDNA进行测序和序列分析,在线寻找其相似的细菌分类。结果显示,5个组之间DGGE指纹图谱的相似性在65.4%～75.4%。与对照组相比,除10 g/d吐温20组外,其他各组的细菌丰度均有不同程度的下降。DNA序列分析表明,DGGE图谱中优势条带的16S rDNA序列中有8个条带序列与GenBank中已知序列的相似性大于97%。受吐温20影响的细菌与Microbacteriumoxydans、Schlegelella aquatica、Brevundi monas sp.、Lachnospir-aceae和Methylobacillus sp.有较高的相似性;而受吐温80影响的细菌与Schlegelella aquatica、Acinetobacter soli和Microbacteriumoxydans有较高的相似性。日粮中添加吐温20和吐温80后,高剂量的吐温20使绵羊瘤胃中的优势菌种类增加,吐温80和低剂量的吐温20使优势菌种类下降。在绵羊瘤胃细菌中,受吐温20和吐温80影响的种类不同。     

嗜水气单胞菌的分离与16S rDNA鉴定

[目的]分离并鉴定鱼嗜水气单胞菌,并构建系统发育分析.[方法]从云南某鱼场采集发病鱼的病变组织进行细菌分离与培养,并对分离菌株进行初步鉴定、16S rDNA鉴定和系统发育分析.[结果]分离培养到1株细菌,命名为Ah1305.经表型鉴定、生化试验及16S rDNA系统发育分析,鉴定为嗜水气单胞菌.[结论]该研究可为快捷、准确检测鱼嗜水气单胞引起的疾病提供参考.     

拮抗放线菌111A202的种类鉴定及其16S rDNA序列分析

对分离自药用植物假橐吾的一株拮抗放线菌菌株111A202进行了形态特征、培养特征、生理生化特征、细胞壁组分分析及16 S rDNA序列分析.结果表明该菌基内菌丝无横隔、不断裂,气生菌丝分枝、孢子丝波曲,孢子椭圆形,表面光滑.细胞壁化学组分Ⅰ型.以16 S rDNA序列为基础构建了包括7株相关种属菌在内的系统发育树,111A202与变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)、微白黄链霉菌(S.albidoflavus)的16 SrDNA序列的相似性达到99.5%和99.6%.根据以上多相分类结果,放线菌111A202的形态培养特征及其细胞组分与链霉菌一致,且与微白黄链霉菌近似性很高,因此,可以将放线菌111A202定名为微白黄链霉菌111A202(S.albidoflavus 111A202).