芜菁Br14-3-3的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆了‘津田芜菁’（Brassica rapa subsp. rapifera‘Tsuda’）通用调节因子14-3-3基因cDNA序列,命名为Br14-3-3（GenBank登录号为MK896872）。该基因全长1 113 bp,开放阅读框全长774 bp,编码含有257个氨基酸的多肽。荧光定量PCR分析Br14-3-3在‘津田芜菁’不同组织中及其在温度、脱水、渗透、ABA和无机盐等非生物胁迫下幼苗中的表达,结果表明该基因在‘津田芜菁’的花中表达量最高,幼苗中次之;低温抑制了Br14-3-3的表达,其他非生物胁迫可诱导该基因表达,暗示Br14-3-3在非生物胁迫应答中发挥功能。     

津田芜菁BrPIP1的克隆及其在非生物胁迫下的表达分析

克隆得到津田芜菁(Brassica rapa ssp.rapifera‘Tsuda’)质膜内在蛋白(plasma membrane intrinsic proteins,PIPs)基因全长cDNA序列,命名为BrPIP1(GenBank登录号为KJ173685),全长为1 056 bp,开放阅读框为861 bp,编码286个氨基酸。荧光定量PCR分析BrPIP1在不同组织以及其在温度、脱水、渗透、ABA和盐等非生物胁迫条件下幼苗中的表达表明,该基因表达具有组织特异性,在花瓣中表达量最高,花蕾中次之;在上述非生物胁迫下表达量都有不同程度增加,暗示BrPIP1在非生物胁迫应答中发挥作用。     

芜菁二氢黄酮醇4–还原酶基因的克隆与功能鉴定

二氢黄酮醇4–还原酶（dihydroflavonol 4-reductase,DFR）是花青素生物合成晚期阶段的关键酶,属于NAD/NADP依赖型还原酶家族,催化从二氢黄酮醇转变成无色花色素苷的反应。利用UV-A处理‘津田’芜菁（‘Tsuda’turnip）和‘赤丸’芜菁（‘Yurugi Akamaru’turnip）块根24 h后提取总RNA,通过RT-PCR方法分别克隆了‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因。BrDFR1和BrDFR2的开放读码框分别为1 158 bp和999 bp,分别编码385和332个氨基酸。氨基酸序列分析显示,BrDFR1和BrDFR2与大白菜DFR具有高度同源性,从第8到第302位氨基酸的肽段具有FR_SDR_e结构域。BrDFR1和BrDFR2基因组全长序列均含有5个位置与序列完全相同的内含子。Southern杂交结果显示,‘津田’芜菁BrDFR1和‘赤丸’芜菁BrDFR2基因均为单一拷贝。UV-A可以诱导BrDFR1基因表达,对BrDFR2基因表达的诱导效果不明显。BrDFR1和BrDFR2基因在大肠杆菌细胞中可以表达并纯化出分子量约为42.8 kD的BrDFR1蛋白和37.5 kD的BrDFR2蛋白。过量表达BrDFR1和BrDFR2基因的烟草花色加深。芜菁DFR基因的RNAi载体遗传转化烟草后,转基因植株的花色变浅。这些工作将为阐明依光型和非依光型花青素生物合成机理奠定研究基础。     

紫山药花青素调控基因DaF3H的克隆及表达分析

 以富含花青素的紫山药‘蓣引紫006’为材料,克隆得到花青素生物合成途径中关键酶基因DaF3H（KF561995）,其序列全长为1 325 bp,最大开放阅读框为1 089 bp,编码362个氨基酸。DaF3H蛋白属于水溶性的胞质不稳定蛋白,无跨膜区和信号肽结构,为α–酮戊二酸和二价铁离子依赖型的加氧酶家族[2OG-Fe（Ⅱ）Oxygenase superfamily]。氨基酸序列与胡桃（ACR47976）、琴叶拟南芥（CAC26921）相似性最高,达到80%。DaF3H在山药幼叶中表达量最高,在成熟叶片和茎中几乎不表达。茎叶和块茎中花青素积累量增速与DaF3H表达密切相关。运用接头PCR法对DaF3H的启动子序列进行了克隆,元件预测显示该序列中存在GT-1光调控元件以及生长素、金属离子、MYB-bZIP-MYC等元件的结合位点,叶片遮光处理试验表明,DaF3H受光调节。     

芜菁NAC转录因子BcNAC2基因的分离及其表达

 根据拟南芥NAC2的全长序列设计引物,从芜菁中成功分离了NAC转录因子BcNAC2基因,该基因最大开放阅读框为1 683 bp,编码560个氨基酸,共包含6个外显子和5个内含子。将BcNAC2与其他30个NACs蛋白进行序列比对以及重构系统进化树分析发现,BcNAC2与十字花科的拟南芥的同源性最高,芜菁BcNAC2与拟南芥NAC2蛋白功能结构域内的特征序列有显著的差异。半定量RT-PCR的结果表明,BcNAC2呈部分组成型表达特征,在授粉8 d的嫩角果中表达丰度最高,而且组织原位杂交结果显示,BcNAC2在胚囊中有较高的表达,由此推测,BcNAC2与芜菁的种子或胚的发育相关。     

甜樱桃MADS box基因的克隆与表达分析

 以甜樱桃‘拉宾斯’（Prunus avium L.‘Lapins’）为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个与花发育相关的MADS box基因,命名为PaMADS3,其在GenBank中的登录号为HQ229605。PaMADS3基因全长1 095 bp,包含1个723 bp的开放阅读框,推断其编码240个氨基酸。序列分析表明：PaMADS3蛋白与拟南芥中的SEP蛋白高度同源。组织特异性表达显示PaMADS3基因在花瓣、雄蕊、心皮中表达。实时定量RT-PCR分析表明,花芽露绿期的离体枝条经过15和25 ℃处理后,其雌蕊中PaMADS3基因在25 ℃的表达量高于在15 ℃的表达量。     

藤稔’葡萄VvGAI基因的克隆、亚细胞定位及时空表达分析

 以‘藤稔’葡萄（Vitis vinifera × V. labrusca‘Fujiminori’）的茎、叶、花和果为试材,采用RT-PCR结合RACE技术,克隆获得1个推测为葡萄赤霉素响应因子VvGAI基因的cDNA序列,全长2 295 bp,其编码590个氨基酸。该基因在GenBank基因数据库的登录号为HQ834311。序列分析表明：VvGAI与杨树、拟南芥、水稻的同源基因的氨基酸序列相似性分别为68.56%、62.79%和54.16%。半定量与定量PCR结果都表明,VvGAI在葡萄茎尖、叶、花和果等营养与生殖器官中均有表达,但在茎尖中的表达最高,是一个与快速生长和分裂关系密切的基因。50 mg · L^-1赤霉素处理后,各阶段果实中VvGAI表达量趋势与对照基本一致,但水平低于对照,其中幼果中表达量最高。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,VvGAI蛋白定位于细胞核。     

‘津田’芜菁光形态建成抑制因子COP1 蛋白cDNA 的克隆及表达分析

 通过RT-PCR和RACE的方法得到了编码‘津田’芜菁（Brassica rapa L. ssp. rapifera‘Tsuda’）BrCOP1的cDNA序列，长2 034 bp，编码677个氨基酸，与拟南芥同源性达94%，命名为BrCOP1，GeneBank收录号为JF738111。Northern杂交分析表明BrCOP1的表达没有组织特异性，而在整株幼苗及成熟植株肉质根表皮中受长波紫外线（UV-A）诱导表达，但成熟植株的直根表皮中表达量不随处理时间延长而增加。这暗示BrCOP1作为光控发育的重要调控因子，可能在UV-A诱导‘津田’芜菁花青素合成及光信号转导中起重要作用。     

黑莓RuMYB10基因的克隆和表达

【目的】从黑莓中克隆RuMYB10的编码区全长序列,并分析其在黑莓果实发育过程中的表达情况与果实花青素苷积累的关系。【方法】以黑莓基因组DNA为模板,通过同源克隆和SON-PCR技术获得了RuMYB10基因全长编码序列(Accession No.:JQ359611);并以黑莓果实mRNA为模板进行验证。采用实时定量PCR技术检测该基因在果实不同发育阶段的表达水平。【结果】结果表明,该基因编码区全长共1 837 bp,编码216个氨基酸,推导蛋白分子质量为24 863 Da。具有MYB转录因子家族特有的R2R3保守序列。含有两个内含子,第2个内含子长度为750 bp,占全长40.8%;在R3重复单元中存在与bHLH因子互作的‘[DE]Lx2[RK]x3Lx6Lx3R’序列;而促进花青素苷合成的MYB转录因子3个特征氨基酸残基中的丙氨酸(A)被丝氨酸(S)取代。RuMYB10基因在黑莓果实发育后期,即果实变红到最后变黑的过程中大量表达,与花青素苷的积累相一致。【结论】从黑莓中克隆到包含完整ORF的转录因子基因RuMYB10,具有MYB因子家族结构特征和bHLH因子结合域,且在果实花青素苷积累高峰期表达量最高。     

茶树DHAR酶基因的克隆与非生物胁迫响应分析

利用RT-PCR技术从茶树‘龙井43’cDNA中克隆得到1个编码茶树脱氢抗坏血酸还原酶基因CsDHAR，该基因全长639 bp，编码212个氨基酸，属于谷胱甘肽转移酶（GST）超级家族成员，具较高保守性。系统进化分析结果表明CsDHAR蛋白与拟南芥DHAR1、DHAR2进化关系近，在不同物种间，与毛果杨、胡杨等植物亲缘关系较近；理化性质分析表明CsDHAR属于亲水性蛋白；结构分析表明CsDHAR蛋白具典型功能结构域，三级结构主要由α–螺旋和不规则卷曲构成。荧光定量PCR分析显示，CsDHAR在茶树叶片不同发育阶段表达量差异不显著；对‘龙井43’与‘安吉白茶’中CsDHAR进行荧光定量PCR分析，‘龙井43’在低温、高温处理4 h表达量最高、干旱和高盐处理24 h表达量最高；‘安吉白茶’在高温、高盐处理4 h表达量最高，干旱处理2 h表达量最高。不同逆境胁迫下CsDHAR均被诱导表达，表明该基因参与茶树响应逆境胁迫调节过程。     

茎瘤芥AP2/EREBP 转录因子基因BjABR1 的克隆和表达分析

 以茎瘤芥（Brassica juncea var. tumida Tsen et Lee）‘永安’为材料,通过RACE 和RT-PCR 技术得到1 个AP2/EREBP 转录因子基因的cDNA 全长序列和基因组DNA（gDNA）序列,该基因与拟南 芥AtABR1 基因的氨基酸序列相似性高达72%,因此命名为BjABR1（GenBank 登录号：JQ713825.1）。BjABR1 基因gDNA 序列含1 个内含子;cDNA 序列全长1 514 bp,含有1 个1 146 bp 的开放阅读框（ORF）,编 码381 个氨基酸;其推定编码的蛋白分子量为41.674 kD,等电点为9.11,具有14 个磷酸化位点,含1 个典型的AP2 DNA 结合域和1 个CMX-1 基序。洋葱表皮细胞的瞬时表达显示,BjABR1 蛋白定位于细 胞核。荧光定量PCR 分析结果表明,该基因在茎瘤芥不同发育时期的根、茎、叶中均有表达,但在根中 表达量极高;在对茎瘤芥组培幼苗进行高盐、渗透压和低温3 种非生物胁迫处理后发现,3 种胁迫均能诱 导该基因表达,但其对高盐的响应更为迅速。     

茶树硫酸盐转运蛋白基因CsSUL3.5 的克隆与表#br# 达分析

 采用电子克隆与RT-PCR 相结合的方法获得茶树硫酸盐转运蛋白（CsSUL3.5）的cDNA 序 列,并进行了相关生物信息学分析。克隆到茶树CsSUL3.5 cDNA 序列2 017 bp（GenBank 登录号 KP984500）,包含完整的开放阅读框（ORF）1 914 bp,编码637 个氨基酸。生物信息学分析显示,CsSUL3.5 编码的蛋白分子量为70.38 kD,无信号肽,是疏水性的非分泌蛋白,有11 个跨膜区;与其他物种相似性 均在60%以上,与烟草的相似性最高（74%）,具有硫酸盐转运蛋白家族典型的保守结构域和空间结构, 属于硫酸盐转运蛋白家族。系统进化分析表明茶树的CsSUL3.5 属于第3 亚家族,与芝麻的关系比较近。 荧光定量PCR 表明该基因在茶树幼苗根与成熟叶中均有表达;Na2SO4 与Na2SeO4 处理均能显著诱导 CsSUL3.5 的表达。     

洋葱开花相关基因AcLFY 的克隆与表达分析

 以洋葱（Allium cepa L.）品系‘1007’为试材,采用同源基因克隆及RACE-PCR 的方法, 获得植物开花调控关键基因LEAFY 的同源基因的cDNA 序列,命名为AcLFY,GenBank 登录号为 JX275962。序列分析表明,该基因包含1 个1 119 bp 的开放阅读框,编码372 个氨基酸,该氨基酸序列 含有5′-N 端脯氨酸富集区,亮氨酸拉链结构和中央酸性区,具有LEAFY（FLO）家族的典型结构特征。 同源分析表明,该氨基酸序列与水仙的同源性接近70%,与其他高等植物LEAFY 类蛋白的同源性均在 50%以上。进化树分析表明AcLFY 与单子叶植物的亲缘关系高于双子叶植物。荧光定量结果显示,AcLFY 在洋葱抽薹开花的整个过程中都有表达,在抽薹初期的花序分生组织中表达量最高,在花器官中只有微 量表达,花器官形成后,主要在叶片中表达。     

毛竹纤维素合成酶基因PeCesA的克隆及组织表达谱分析

根据物种间同源基因设计引物,对构建好的毛竹笋全长cDNA文库进行大规模PCR筛选,成功分离出了毛竹纤维素合成酶基因PeCesA的cDNA序列,全长共3 545 bp（GenBank登录号：FJ799713）。该序列包含3 243 bp的开放阅读框（ORF）,编码1 081个氨基酸。通过核酸序列比对发现,该序列与绿竹、水稻、玉米、小麦和大麦的纤维素合成酶基因同源性极高（> 90%）。蛋白序列比对分析发现：PeCesA蛋白含有植物纤维素合成酶特有的保守区、可变区、N端Zn指结构域以及8个跨膜区;系统发育分析表明PeCesA与绿竹BoCesA4、水稻OsCesA4、玉米ZmCesA4属于同一进化分支。运用实时定量PCR法分析PeCesA基因的组织表达特异性发现,PeCesA在毛竹根部的表达量最高,茎部其次,叶中较少;在竹笋基部的表达量远远高于竹笋上部。随着PeCesA基因表达量的增高,组织中的纤维素含量亦相应增高。推测PeCesA参与了毛竹次生细胞壁中纤维素的生物合成。     

香石竹切花水孔蛋白基因DcPIP2的克隆及特征分析

 采用RT-PCR和RACE技术从香石竹（Dianthus caryophyllus L.）叶片中获得质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein,PIP）类水孔蛋白（aquaporins,AQP）基因的cDNA全长序列,命名为DcPIP2,GenBank登录号为GU989036。该cDNA全序列长983 bp,包含有858 bp的完整阅读框（ORF）,编码285个氨基酸,分子量约为30.6 kD。克隆相应的DcPIP2基因组全长序列得知,该基因长2 635 bp（GenBank登录号为JF706350?）,包含由3个外显子和2个内含子组成的编码区序列。同源性分析显示,DcPIP2氨基酸序列与陆地棉（Gossypium hirsutum）PIP2;3（ACB42440）、麻疯树（Jatropha curcas）AQP（ABM54183）和巴西橡胶树（Hevea brasiliensis）PIP2（ACV66986）氨基酸的同源性分别为89%、88%和87%。利用实时荧光定量PCR技术研究表明,DcPIP2基因在香石竹切花的叶片、茎颈部、花瓣、雌蕊、雄蕊和萼片中均有表达,表达量为雌蕊 > 花瓣 > 雄蕊 > 萼片 > 茎颈部 > 叶片。     

牡丹查耳酮合酶基因Ps-CHS1的克隆及其组织特异性表达

以牡丹（Paeonia suffruticosa）品种‘彩绘’为试材,采用RT-PCR和RACE方法从花瓣中获得了一个牡丹查耳酮合酶（chalcone synthase,CHS）基因cDNA全长,命名为Ps-CHS1,GenBank登录号为GQ483511。序列分析结果表明,Ps-CHS1全长1 475 bp,包含82 bp的5′非编码区、208 bp的3′非编码区和一个长度为1 185 bp编码394个氨基酸的开放阅读框。氨基酸序列分析显示该基因编码的蛋白具有CHS家族保守存在的所有功能活性位点和特征多肽序列。序列比对和系统进化分析表明,Ps-CHS1与杨柳科、锦葵科、蔷薇科等植物的CHS亲缘关系较近,相似性达90%以上。相对荧光定量PCR分析表明,Ps-CHS1在花瓣中的表达量最高,其次是萼片,再次是叶片和雄蕊,在心皮中表达量最低。     

茶树NADPH氧化酶基因的克隆、亚细胞定位与表达分析

以茶树(Camellia sinensis)‘迎霜’为试验材料,采用同源克隆的方法,利用RACE和RT-PCR技术获得茶树NADPH氧化酶基因Cs RBOHA的c DNA全长(Gen Bank登录号:KJ782632)。该基因全长3 157 bp,开放阅读框2 769 bp,编码922个氨基酸。生物信息学分析显示,该基因编码的蛋白分子量为103.33 k D,理论等电点为9.28;C端序列较保守,N端序列保守性较低,与烟草和蓖麻的相似性达79%,进化关系最近;蛋白结构具有典型的家族特征。该蛋白分布于细胞质膜上,与预测结果一致。实时荧光定量PCR结果显示,该基因的表达存在组织特异性,并且在低温(4℃)、高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、ABA(200 mg·L-1)和干旱(10%PEG 6000)条件下出现不同程度的上调。     

莲藕GBSS基因cDNA全长的克隆与序列分析

采用RT-PCR结合RACE技术,扩增得到全长为2265bp的莲藕＂美人红＂品种的GBSS基因的cDNA序列（GenBank登录号EU938541）,其中开放阅读框（ORF）长为1848bp,共编码615个氨基酸。用DNAman软件比对,莲藕GBSS基因cDNA与金鱼草（AJ006293）、马铃薯（EU403426）、大豆（EF153101）、水稻（EU735072）Wx基因cDNA序列的同源性分别达61.2%、59.6%、64.2%、50.6%。对该基因编码的氨基酸序列进行Blastp分析发现,该序列与金鱼草的序列同源性最高,达到77%,与马铃薯、甘薯的同源性达到75%,与豆科植物的同源性在70%～75%,与禾本科植物的同源性在65%～70%。     

番茄黄化曲叶病毒石家庄分离物的分子鉴定及序列分析

根据番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV）基因组序列的复制酶保守区设计1对引物JC1,对石家庄具有典型番茄黄化曲叶病毒症状的番茄样品进行检测,经PCR扩增得到626 bp的片段,序列分析比对表明其为TYLCV的一部分。根据上述序列设计1对特异引物QC,通过PCR分离石家庄的TYLCV全长序列并进行测序。同时利用已报道的DNA-B的通用引物CR01/CR02进行PCR扩增。结果表明石家庄分离物只含有DNA-A组分,全长为2 781 bp（GenBank登录号：KF612971）,命名为TYLCV-Shijiazhuang。基因组序列比较发现,该分离物与TYLCV-Israel株系相似性为99.0%。基因组序列系统进化分析表明,石家庄病毒分离物与北京分离物TYLCV-Beijing3（GenBank登录号：GU983859）、山东分离物TYLCV-SDSG-XC（GenBank登录号：KC999851）序列相似性很高,均属于TYLCV-Israel分支。     

牡丹开花调控转录因子基因PrSOC1的克隆与表达分析

以紫斑牡丹（Paeonia rockii）花芽为试验材料,采用RT-PCR的方法克隆得到1个牡丹开花调控的重要转录因子SUPPRESSOR OF OVEREXPRESSION OF CONSTANS1（SOC1）基因的同源基因PrSOC1,其cDNA开放阅读框长度为678 bp,3′非编码区为421 bp,编码225个氨基酸,GenBank登录号为KJ427808。序列比对和结构域分析表明,此蛋白包含典型的MADS-box和K-box结构域,C末端还含有一个保守性很高的基序-SOC1 MOTIF,与葡萄中的SOC1蛋白最为相似。系统进化树分析表明,PrSOC1与葡萄VvSOC1的亲缘关系最近,属于MADS基因家族中的SOC1/TM3亚家族。半定量RT-PCR表明,PrSOC1基因在紫斑牡丹花芽中的表达量最高,根、茎、叶片中次之,种子中最少。在不同品种牡丹的花芽中,PrSOC1和其光周期途径上游的CO家族基因PsCOL4的表达量没有显著的品种间差异,推测PrSOC1具有很高的保守性,可能是参与牡丹成花的重要基因。利用原核表达系统成功表达了PrSOC1蛋白,并构建了PrSOC1的植物超表达载体,为进一步研究PrSOC1的功能奠定了基础。