草甘膦为筛选标记的水稻高效遗传转化体系的建立

【目的】建立以日本晴愈伤组织为受体、草甘膦抗性基因CP4为选择标记基因的高效水稻遗传转化体系。【方法】以粳稻日本晴的成熟胚为试验材料,通过农杆菌介导法,将含有草甘膦抗性基因CP4的P1300载体转化日本晴的愈伤组织,分别用质量浓度为10、20和40 mg/L的草甘膦进行3轮抗性筛选,诱导分化和再生成苗;利用1 000 mg/L草甘膦对移栽成活的阳性苗进行抗性鉴定。【结果】获得145株转基因幼苗,PCR检测阳性株为128株,阳性率达88.27%;经过3轮抗性筛选后,转基因幼苗的阳性率提高;移栽成活的99株阳性苗中,65株表现为抗性,抗性率为65.66%。【结论】成功建立了以草甘膦为筛选标记的水稻转基因体系,该体系为水稻育种提供了材料,并对以抗草甘膦基因作为筛选标记的水稻转基因和一些基因功能验证提供了技术支持。     

RNA干扰技术抑制洋桔梗ACC合酶基因的表达

为了延长洋桔梗的花期,本研究通过农杆菌介导法,以ACC合酶(ACS)基因干扰表达载体,对Double Mariachi Pink洋桔梗(Eustoma grandiflorum)的叶片外植体进行了转化。经过再生芽的筛选增殖培养,在含有卡那霉素Km(15 mg/L)再生根筛选培养基中得到了46株抗性苗,其中11株经GFP基因PCR鉴定为阳性。经进一步的GFP基因RT-PCR鉴定,3株表达为阳性,并且其中2株经GFP荧光检测呈阳性。提取荧光阳性植株RNA,逆转录后,进行了ACS荧光定量PCR。结果表明,与未转基因对照植株相比,转基因植株ACS的相对表达量平均下降了63.17%。花期统计结果表明,ACS干扰表达载体转化的洋桔梗植株花期比未转基因植株对照延长了17 d。     

转G10aroA棉花株系的获得及分子生物学鉴定

【目的】培育具有抗草甘膦除草剂的棉花材料具有极其重要的意义。利用农杆菌介导法在棉花中转入编码EPSPS酶的抗草甘膦除草剂基因G10aroA,通过体细胞愈伤诱导组织培养技术获得能够稳定遗传的转基因棉花株系材料。【方法】首先,利用不同草甘膦抗性筛选条件比较分析不同棉花受体材料的愈伤诱导效率;其次,以R15材料作为受体,利用含有G10aroA的农杆菌侵染下胚轴切段,在进行体细胞愈伤诱导的组织培养过程中通过草甘膦抗性筛选获得棉花再生植株,对获得的棉花再生植株进行纯合繁育。在此基础上,利用PCR扩增检测证实外源G10aroA在转基因植株中能够稳定遗传;利用RT-PCR分析其外源基因在转基因植株不同组织中的转录水平进行研究、并进一步利用Western-blot对转基因植株中外源蛋白的表达进行分析。【结果】在优化的草甘膦筛选条件下,以草甘膦浓度为2.5 mmol•L-1的抗性条件进行棉花愈伤诱导筛选并获得棉花再生植株;利用特异引物进行PCR检测结果表明,在检测的全部再生植株中,扩增得到1.8 kb预期大小目标条带的阳性株系32株,其中,收获的27个株系的外源目标基因能够在T0、T1转基因植株中稳定遗传;对G10aroA在转基因株系L12、L14的不同组织中的转录表达进行定量RT-PCR分析表明,外源G10aroA在转基因棉花植株的不同组织中表达具有差异,相对表达量高低依次为茎、苞叶、叶和花;另外,蛋白检测结果进一步表明,该外源基因能够在转基因株系L7、L12和L14中植株中正常表达为预期46 kD的EPSPS蛋白。【结论】通过农杆菌介导法转化外源抗草甘膦基因G10aroA,在草甘膦抗性条件下进行棉花体细胞诱导的组织培养,成功获得转外源G10aroA的棉花再生株系,并通过分子生物学方法研究证实外源G10aroA能够在T0、T1转基因株系中稳定遗传、转录以及表达。     

农杆菌介导的2mG_2-epsps基因转化玉米自交系18-599R幼胚的研究

【目的】对农杆菌介导的抗草甘膦新基因2 mG2-epsps转化玉米18-599R幼胚的体系进行优化,以获得具有明显草甘膦抗性的转基因植株。【方法】以玉米18-599R幼胚为受体,采用农杆菌介导法,对转化时的预处理条件、菌液浓度×浸染时间、草甘膦筛选浓度设置处理,以优化转化体系;并用PCR、实时荧光定量PCR和喷洒草甘膦鉴定外源基因在转基因植株中的表达情况。【结果】热激处理对抗性愈伤率没有明显的提高作用,离心处理会降低抗性愈伤率;菌液浓度为OD600=0.6,浸染时间为10 min时,平均抗性愈伤率最高,为37.33%;草甘膦浓度为2.0mmol/L是比较理想的筛选浓度;实验共得到46株再生植株,5株PCR检测呈阳性,阳性率为10.87%;实时荧光定量PCR表明外源基因在T2代植株的根、茎、叶中均有表达;对T2代转基因植株喷洒1.5g/L的草甘膦,表现出耐受性。【结论】实验成功将2 mG2-epsps导入18-599R基因组,并获得了明显的草甘膦抗性。     

RNAi和GroEL介导的双价转基因番茄对TYLCV的抗性

本研究将已构建的SUC2-GroEL和pBI121-AC1-AC2植物表达载体共转化番茄,共获得19株卡那霉素抗性再生植株。经过PCR和RT-PCR检测,初步获得转SUC2-GroEL载体的阳性植株5株,转pBI121-AC1-AC2载体的阳性植株3株以及转SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2双载体的阳性植株2株。利用TYLCV侵染性克隆农杆菌注射接种法对T0代转基因阳性植株进行抗性鉴定,获得抗TYLCV的转基因植株7株。对T0代未扩出病毒条带的T1代植株进行抗性鉴定,结果发现转SUC2-GroEL、pBI121-AC1-AC2、SUC2-GroEL/pBI121-AC1-AC2不同载体的株系植株中平均带毒率依次是35%、25%和15%,推断转双基因的植株的抗病能力优于转单个基因植株的抗病能力。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

农杆菌介导pta和sb401基因共转化水稻的研究

利用农杆菌介导法,将半夏凝集素(pta)基因和高赖氨酸蛋白(sb401)基因导入水稻中,经潮霉素抗性筛选,得到70株独立再生植株.通过PCR检测,从中筛选出18株转基因植株.对这些转基因植株当代进行Southern blotting分析表明:pta 基因和sb401基因已经共转化并整和到受体基因组中.对转基因植株后代的叶片进行RT-PCR分析表明:pta基因在转录水平上得到了有效的表达.测定10株T0转基因植株成熟种子的赖氨酸和总蛋白质量分数表明,与对照相比,赖氨酸和总蛋白的提高率分别为8.48%～35.34%和4.55%～32.74%,表明sb401基因在大部分转基因植株成熟种子中的蛋白质水平上得到了比较有效的表达.     

转2mG2-epsps基因烟草的草甘膦耐受性分析

利用农杆菌介导法将耐草甘膦基因2mG2-epsps转入烟草,获得87株PCR阳性植株,阳性率为43%。对PCR阳性植株进行Southern杂交、RT PCR、Western 杂交和ELISA分析,结果显示外源基因已经整合到烟草基因组中并高效表达,转基因植株的叶片中2mG2-EPSPS蛋白的最高表达量可达26.03 μg/g 鲜重。转基因烟草草甘膦耐受性分析显示,其中有15个转化事件表现出较好的草甘膦耐受性,对草甘膦的耐受性可达到1%。转基因植株的种子可以在10 mmol/L草甘膦异丙铵盐浓度下萌发,T1代转基因烟草幼苗可以耐受浓度为0.8%的草甘膦。研究结果表明转2mG2-epsps基因烟草具有较高的草甘膦耐受性,2mG2-epsps基因可以用于耐除草剂转基因作物的培育。     

转基因马铃薯植株的抗性筛选及其PCR鉴定

近年来,转基因技术研究发展很快,筛选、鉴定转基因植株是基因转移的必须环节。本实验利用农杆菌(含有pARTGF植物表达载体)介导法将外源基因转入马铃薯植株,经过含有卡那霉素培养基的抗性筛选,初步筛选出转基因马铃薯植株A、B、C分别为5株、7株、8株;将筛选的转基因马铃薯植株利用PCR进行检测,经分析,其结果初步表明,已成功将目的基因转入马铃薯基因组中,并获得阳性植株分别为2株、4株、5株。     

抗草甘膦与磷高效吸收基因双价表达载体的构建及对甘蓝型油菜的遗传转化

【目的】甘蓝型油菜是产油效率较高的油料作物,在其生长过程中往往伴随着土壤环境中磷素匮乏及杂草胁迫,严重影响着最终产量和品质.因此,同时解决有效磷匮乏及草害问题已经成为目前油菜研究的重要方向.【方法】采用PCR法克隆得到了与草甘膦抗性(eCTP和EPSPS)和磷高效吸收(Pht1;2和phyA)的相关目的基因,随后构建了双价植物表达载体,通过农杆菌介导法转化甘蓝型油菜,对转化植株进行PCR检测筛选,并通过qRT-PCR法对筛选的阳性植株内目的基因的表达进行定量分析.【结果】将PCR扩增得到的片段经琼脂糖凝胶电泳检测,结果符合预期.测序结果也与GenBank注册序列同源性高度一致,可用于后续试验.对转基因油菜进行草甘膦抗性筛选和PCR扩增检测,共获得5株转基因阳性植株.实时荧光定量结果发现转基因阳性植株内phyA和EPSPS基因的表达量均较对照植株有显著提高.【结论】本研究成功构建了抗草甘膦和磷高效吸收基因双价植物表达载体,获得的转基因阳性植株同时兼具草甘膦抗性及磷素高效吸收利用的特性,为培育甘蓝型油菜优良种质资源提供了理论依据.     

转基因复合抗虫耐除草剂玉米BFL4-1的分子特征及功能评价

玉米螟和田间杂草严重影响我国玉米的生长发育,导致玉米产量和品质下降.培育具有抗虫、耐除草剂等复合性状的转基因玉米成为转基因玉米育种的一个趋势.将cry1Ab、cry1F和cp4epsps构建在同一载体上并利用农杆菌转化到玉米Hi-Ⅱ中,通过与玉米自交系郑58进行回交转育,获得了具有郑58遗传背景并兼具抗虫和耐除草剂性状...     

兼抗虫、除草剂、干旱转基因玉米的获得和鉴定

【目的】培育抗玉米螟、抗草甘膦、抗旱的转基因复合性状玉米种质。【方法】通过农杆菌介导的玉米茎尖遗传转化法,把重组到同一植物表达载体的cry1AcM、epsps、GAT和ZmPIS转入玉米骨干自交系9801和齐319（Q319）,获得转基因植株。通过逐代除草剂筛选、分子检测和抗虫性鉴定,从大量转基因株系中优选出6个优良玉米株系。在此基础上,以非转基因自交系9801、Q319为对照,在严格控制条件下对6个转基因株系进行抗虫、抗除草剂和抗旱性检测。由于不同生长时期植株对玉米螟危害的敏感程度有差异,在抗虫性检测试验中,对不同生长阶段的转基因玉米的抗虫性,分别进行了田间和室内玉米螟接种试验,并以灌浆期玉米的籽粒和苞叶饲喂玉米螟幼虫检测其杀虫性。在草甘膦抗性鉴定试验中,对6叶期田间玉米植株喷洒大田除草用量的草甘膦溶液评估其应用价值;采用3倍应用剂量的草甘膦溶液喷施3叶期玉米植株测试其草甘膦耐受力。在抗旱性鉴定试验中,对10叶期玉米植株进行干旱胁迫处理,观测转基因植株的表型变化并测定光合作用和叶绿素荧光等参数。【结果】选择出6个遗传稳定的兼抗亚洲玉米螟、抗草甘膦和抗旱性提高的转基因玉米株系,其中株系L1-L3来自自交系9801,Q1-Q3来自自交系Q319。通过RT-PCR检测4个转基因的转录强度,证明它们在转基因植株中有效表达;利用Western blot方法检测cry1Ac蛋白的表达水平,确定其在玉米植株中稳定表达。植株抗虫性鉴定结果显示这6个株系在玉米营养生长期和灌浆期的抗虫能力均显著高于未转基因自交系。在草甘膦抗性测试中,转基因植株表现出明显高于未转基因自交系的草甘膦抗性。在干旱控水期间,转基因植株能维持较强的光合能力和光系统Ⅱ活性,对干旱胁迫的抗性显著高于对照植株。【结论】将cry1AcM、epsps、GAT、ZmPIS一同转入玉米,赋予了植株抗玉米螟、抗除草剂草甘膦特性,提高了植株的抗旱性,达到生产中应用标准。培育出具有优良复合性状的转基因玉米新材料。     

利用玉米作为生物反应器表达PEDV中和表位抗原蛋白

以玉米为生物反应器,将猪流行性腹泻病毒（porcine epidemic diarrhea virus, PEDV）主要中和抗原表位（core neutralizing epitope, COE）基因导入玉米自交系,获得了高效表达PEDV\|COE的转基因玉米稳定株系。首先,根据玉米密码子的偏好性,设计合成优化的COE编码基因,构建了植物表达载体pBAC9036。然后,利用PDS1000/He基因枪转化玉米幼胚,经过愈伤组织诱导、分化再生培养,获得71株转化再生植株,进而通过田间草甘膦抗性筛选,获得2个T1代转基因玉米稳定株系。通过PCR、RT\|PCR、间接ELISA和Western blot等鉴定结果显示,COE基因已成功整合到玉米基因组并进行了转录和蛋白表达。并且种子中COE蛋白占可溶性总蛋白的0.122％和0.078％。最后,提取转基因玉米稳定株系的种子可溶性蛋白,与佐剂混合皮下注射免疫小鼠并取可溶性蛋白灌胃免疫小鼠,均可产生针对PEDV抗原的特异性抗体。获得的转基因玉米可有效表达COE蛋白,表达产物具有显著的免疫原性,为进一步研制PEDV\|COE转基因玉米疫苗奠定了基础。     

转基因抗虫、耐除草剂及品质改良复合性状玉米BBHTL8-1的分子特征及功能评价

随着转基因作物的发展和推广,具有复合性状的转基因作物种植面积逐年增加.传统的转基因复合性状作物具有抗虫和耐除草剂性能,聚合其他性状的转基因作物培育逐渐受到重视.转基因玉米株系BBHTL8-1含有Cry1Ab、Cry3Bb、cp4epsps 、ZmHPT和ZmTMT共5个基因表达框,外源插入片段位于玉米基因组第4染色体,...     

水稻OsCERK2转基因植株的获得及初步分析

以水稻粳稻品种日本晴为研究材料,利用拟南芥CERK1的蛋白质序列检索,在水稻基因组候选了与拟南芥CERK1同源的水稻基因OsCERK2,通过RT-PCR分离了该基因的全长cDNA。生物信息学分析显示,OsCERK2是一种含有信号肽的质膜蛋白,胞外结构域含有LsyM基序,激酶结构域含有酪氨酸蛋白激酶结构域。构建了由35S启动子驱动该基因的过表达遗传转化载体和由玉米的泛素基因的启动子驱动的RNA干涉（RNAi）的遗传转化载体,利用农杆菌介导的遗传转化技术,将OsCERK2基因导入水稻,得到T0代转基因植株。对T0代植株进行了PCR检测和半定量RT-PCR检测,获得了OsCERK2有效表达的转基因植株。     

Overexpression of a modified AM79 aroA gene in transgenic maize confers high tolerance to glyphosate

It has previously been shown that a bacterial 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase(EPSPS) encoding gene AM79 aroA can be a candidate gene to develop glyphosate-tolerant transgenic crops(Cao et al. 2012). In this study, AM79 aroA was redesigned using the plant biased codons and eliminating the motifs which would lead to the instability of mRNA, to create a synthetic gene that would be expressed highly in plant cells. The redesigned and artificially synthesized gene, named as mAM79, was cloned into plant expression vector pM3301 Ubi Sp AM79, where mAM79 is fused with signal peptide sequence of pea rib-1,5-bisphospate carboxylase(rbcS) small subunit and controlled by ubiquitin promoter. The plasmid was transformed into maize(Zea mays) immature embryos using Agrobacterium-mediated transformation method. Total 74 regenerated plants were obtained and PCR analysis showed that these transgenic plants had the integration of mAM79. Southern blot analysis was performed on the genomic DNA from four transgenic lines, and the result showed that one or two copies of mAM79 were integrated into maize genome. RT-PCR analysis result indicated that mAM79 was highly transcribed in transgenic maize plants. When sprayed with glyphosate, transgenic maize line AM85 and AM72 could tolerate 4-fold of commercial usage of glyphosate; however, all the non-transgenic maize plants were killed by glyphosate. The results in this study confirmed that mAM79 could be used to develop glyphosate-tolerant maize, and the obtained transgenic maize lines could be used for the breeding of glyphosate-tolerant maize.     

转基因甘蔗抗黑穗病鉴定研究

用分离得到的甘蔗黑穗病病菌单孢子菌丝体对5个甘蔗转基因株系进行体外抑菌作用鉴定,结果显示,5个转基因株系对甘蔗黑穗病均有不同程度的抗性表现;通过人工接种方法对转基因植株（T1）进行了甘蔗黑穗病病菌的田间接种实验,利用病害流行指标LP、SDD、IPmax、Ymax、AUDPC对其后代（他）进行抗病性鉴定,结果表明,SCG1和SCG2两个株系表现为抗病（R）,而SCG3、SCG4和SCG5三个株系表现为中抗（Ⅰ）;并结合RT-PCR技术鉴定目的基因在转基因甘蔗无性系后代（T2）中的表达,结果显示两个目的基因在转基因甘蔗无性系12中均有表达,此结果与其抗病表现一致。     

利用花粉管通道法将耐草甘膦基因mG2-epsps 导入玉米自交系的研究初报

构建了含有耐草甘膦基因mG2-epsps的植物表达载体pUmG2,采用花粉管通道法将其导入优良玉米自交系X90中,对Tn代1542株植株进行草甘膦喷洒实验,共得到32株能够耐受0．25％草甘膦药液的抗性植株;对这32株抗性植株的PCR检测结果表明,其中29株为PCR阳性植株,平均转化率为1．88％;Southern杂交和Western杂交检测结果证明mG2-epspps基因已整合至玉米基因组并正确表达。