利用离子注入技术选育多杀菌素高产菌株

多杀菌素是由刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）发酵产生的大环内酯类化合物,是一种应用前景广阔的生物农药。采用氮离子注入方法并结合前体和自身代谢物抗性来选育多杀菌素高产菌株。结果显示利用氮离子注入诱变刺糖多孢菌,其致死率曲线呈典型的马鞍形,并确定30 s×2.6×1013 ions/cm2的注入剂量用于进一步诱变筛选。通过前体及自身代谢物抗性筛选,最终得到5株多杀菌素高产菌株,其多杀菌素的最高产量比选育前提高了44%。表明该技术对多杀菌素高产菌株的选育是一种行之有效的方法。     

多杀菌素发酵培养基的研究

【目的】以刺糖多孢菌C4-10-8B为试验菌株,对多杀菌素发酵培养基进行优化,以提高刺糖多孢菌的多杀菌素发酵产量。【方法】采用单因素和多因素试验,分别考察了不同碳源、氮源、前体、无机盐和微量元素对多杀菌素生物合成的影响,最后通过正交试验综合考察发酵培养基中各组分对多杀菌素产量的影响。【结果】葡萄糖是较优碳源,最佳质量浓度为40.0 g/L,当葡萄糖与糊精(质量比5∶2)复配时,多杀菌素产量较对照培养基提高18.35%;棉籽蛋白为最优氮源,25.0 g/L棉籽蛋白与15.0 g/L玉米蛋白胨或0.6 g/L硫酸铵复配时,多杀菌素产量分别较对照提高40.0%和45.3%;乙酸钠和谷氨酰胺质量浓度为1.0 g/L时,均能使多杀菌素产量较对照提高21.5%;K2HPO4对多杀菌素合成有明显的促进作用,在其质量浓度为2.5 g/L时,多杀菌素产量较对照提高24.5%;ZnCl2对多杀菌素合成也有促进作用,而MgSO4和CoCl2则显著抑制多杀菌素合成;通过2次正交试验获得最优发酵培养基,利用该培养基时多杀菌素产量可达395.54μg/mL,比对照提高了62.5%。【结论】多杀菌素生物合成的最优发酵培养基为:葡萄糖50.0 g/L,棉籽蛋白25.0 g/L,玉米蛋白胨20.0 g/L,(NH4)2SO40.8 g/L,谷氨酰胺1.25 g/L,乙酸钠0.8 g/L,NaCl 3.0 g/L,K2HPO42.5 g/L,FeSO450.0 mg/L,ZnCl225.0 mg/L,CaCO31.0 g/L。     

96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的研究

考察了刺糖多孢菌在96孔板固体培养基和液体培养基中的生长情况,建立了96孔板高通量筛选多杀菌素高产菌株的方法。结果表明：96孔板三明治盖能同时满足过滤杂菌和刺糖多孢菌生长耗氧所需,刺糖多孢菌在96孔板固体培养基中的生长情况与传统斜面培养相当,种子培养最适种龄为60 h,每孔发酵培养基装液量为0.4 mL。与传统摇瓶发酵筛选平台相比,该方法能显著提高多杀菌素高产菌株的筛选效率。     

多杀菌素发酵培养基优化及发酵工艺研究

为了优化刺糖多孢菌发酵工艺,以刺糖多孢菌YJY^-12为试验菌株,以多杀菌素发酵水平为指标,通过正交试验及单因素试验对产多杀菌素的发酵培养基成分及培养条件(种龄、接种量、温度、pH值等)进行优化,确定最佳的培养基组成及培养条件,并对其进行了试验验证。结果显示：最佳的发酵培养基组成为葡萄糖55 g·L^-1,棉籽蛋白30 g·L^-1,油酸甲酯40 g·L^-1,大豆油15 g·L^-1,酵母粉10 g·L^-1,蛋白粉15 g·L^-1,玉米浆干粉5 g·L^-1,蛋白胨15 g·L^-1,KH₂PO₄ 3 g·L^-1,(NH₄)₂SO₄ 1 g·L^-1,CuSO₄ 0.002g·L^-1,(NH₄     

多杀菌素的提取和萃取条件研究

【目的】研究多杀菌素的最佳提取和萃取条件。【方法】采用单因素试验,分别研究发酵液不同pH(6,7,8,9,10,11)、放置时间(2,4,8,16,24,32,48,72 h)和温度(20,30,40,50,60,70℃)对发酵液中多杀菌素提取效果及稳定性的影响,同时,从乙酸乙酯、石油醚、二氯甲烷和乙醚中筛选最适萃取试剂,并在此基础上研究萃取次数(1,2,3次)和萃取试剂体积对多杀菌素萃取效果的影响。【结果】单因素试验结果显示,在发酵液pH为10时,多杀菌素提取效果较好;放置2~72 h,多杀菌素质量浓度不会发生显著变化;在20~70℃多杀菌素能稳定存在;乙酸乙酯为最适萃取试剂,最佳萃取次数为3次,其与多杀菌素提取液的最适体积比为1∶1。【结论】得到了多杀菌素提取和萃取的最佳条件,在该条件下多杀菌素的质量浓度和萃取率分别为74.50μg/mL和98.18%。     

多杀菌素生产菌种保藏方法的研究

采用斜面低温保藏法、冻干管保藏法以及沙土管保藏法,对刺糖多孢菌进行保藏方法的研究。结果表明,保藏30 d,斜面保藏菌株生长最旺盛,产孢能力最强。保藏90 d,斜面保藏菌株生长最弱,产孢能力退化严重。保藏180 d,斜面保藏菌株死亡率达100%;冻干管保藏菌株死亡率大于91.474%;沙土管保藏菌株死亡率大于99.935%。保藏270 d,冻干管保藏菌株死亡率大于93.859%,各分离纯化株生长及产孢能力一般,产量下降率差异小;沙土管保藏菌株死亡率大于99.970%,各分离纯化株生长及产孢能力一般,产量下降率差异大。     

基于诱变和抗性突变的多杀霉素高产菌株的选育

为提高菌株发酵液中多杀霉素产量,本试验利用常温常压等离子体(ARTP)诱变、紫外(UV)诱变和抗性突变技术处理刺糖多孢菌株DS0322-3,结合高通量筛选和摇瓶发酵选育多杀霉素高产菌株。结果显示,通过ARTP诱变和UV诱变育种,筛选获得384株突变菌株,其中有9株突变菌株的效价较原始菌株增加10%以上,且1株效价较原始菌株增加20%以上,经过ARTP诱变30 s,得到的突变菌株AR1019-4效价为547.78 mg/L,较原始菌株增加了21.88%。以ARTP诱变得到的高产突变菌株AR1019-4为出发菌株,通过抗性突变筛选技术筛选获得1 152株突变株,其中13株突变菌株的效价较出发菌株增加10%以上,且2株效价较出发菌株增加15%以上,在0.5 mg/L的氯霉素平板上得到的突变菌株Chl 1215-5效价为637.12 mg/L,较出发菌株增加了16.31%;12 mg/L的庆大霉素抗性突变筛选到了突变菌株Gen 1207-8,效价为597.59 mg/L,该菌株的Spinosyn D组分由10%～15%增加至30%～35%左右,经遗传稳定性试验验证,突变菌株Chl1215-5和Gen1207-8可稳定遗传。试验结果表明ARTP诱变、紫外诱变和抗生素突变技术对选育多杀霉素高产菌株具有重要意义。     

刺糖多孢菌分批发酵动力学研究

利用摇瓶培养试验研究了刺糖多孢菌Saccharopolyspora spinosa的分批培养过程中生物量、培养液pH、葡萄糖消长、多杀菌素含量等因素的变化规律。利用MATLAB软件对试验数据进行非线性回归,拟合出了细胞生长动力学模型、基质消耗动力学模型和产物生成动力学模型,得到了细胞生长量、残糖量、多杀菌素产量在发酵过程中随时间变化的规律,相关系数分别为0．98934、0．99266和0．98635．拟合曲线95％置信度区间分析的结果表明,该模型能够很好的反映出刺糖多孢菌分批发酵的过程．     

环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响

【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor protein,Crp）基因在刺糖多孢菌（Saccharopolyspora spinosa）中的过量表达,研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响,促进多杀菌素的生物合成。【方法】PCR扩增环腺苷酸受体蛋白基因（crp）,通过限制性酶切、连接方法构建中间载体pOJ260-cm-P_ermE-crp,使crp置于红霉素增强型启动子P_ermE的控制下;PCR扩增P_ermE-crp基因片段,利用Red/ET同源重组技术将P_ermE-crp亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体pUC-spn上,构建成Crp表达载体pUC-spn-P_ermE-crp。然后,采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-P_ermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中,通过单交换同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上,以染色体上整合了原始质粒pUC-spn的刺糖多孢菌作为对照菌株。利用PCR扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子;观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基中的生长及菌落形态差异,同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况,测定生长曲线。借用扫描电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态;采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp重组表达载体pUC-spn-P_ermE-crp,并通过接合转移导入到刺糖多孢菌中;PCR检测结果显示,工程菌株作为模板扩增出长约2 kb的cm-P_ermE-crp目的条带,说明crp已成功整合到刺糖多孢菌染色体上,并且获得的重组工程菌株S. spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培养基上,工程菌株S. spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株S. spinosa-1相比均有所延迟,但在R6培养基上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株S. spinosa-1相比,液体培养基中工程菌株S. spinosa-Crp二次生长现象消失,且生物量略高于S. spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高,分支较少,有利于提高工程菌株S摇瓶发酵结果表明,工程菌株中的多杀菌素产量与对照菌株相比提高了128%。. spinosa-Crp发酵过程中的溶氧水平。【结论】crp的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响,并有效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成,为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。     

糖多孢菌属菌株的体内转座诱变系统

为实现糖多孢菌的体内转座诱变,采用刺糖多孢菌的强启动子促进Tn5转座酶基因tnp(5)的表达,优化链霉菌高效转座质粒pHL734,构建了转座质粒pJTn1、pJTn2、pJTn3、pJTn4、pJTn5、pJTn6。结果显示:pJTn1～pJTn6系列转座质粒均可在红色糖多孢菌中高效转座;pJTn1和pJTn5可在刺糖多孢菌中进行转座,获得31个刺糖多孢菌转座突变株;其中30个菌株的基因组中检测到标准的Tn5转座,8个突变株的多杀菌素产量显著降低。表明pJTn系列转座质粒可作为糖多孢菌的体内转座诱变工具,为抗生素的产量调控研究和高产育种靶标基因筛选提供理论依据。     

我国小麦航天诱变育种研究进展与思考

航天诱变育种作为现代育种的一条新途径,以外层空间为诱变环境,在微重力、多种射线等复杂因素的作用下诱发植物产生突变,除具有提高突变率、变异较易稳定的特点外,还有生理损伤较轻、处理后代个体存活率高的优点,因此在植物育种中利用较多.作者综述了小麦航天诱变育种的研究概况,并对目前存在的问题进行了探讨,以期对今后我国小麦航天诱变育种工作有所启发.     

航天诱变孔雀草新品系wh1-6-1选育报告

孔雀草新品系wh1-6-1是甘肃省天水市农业科学研究所和甘肃省航天育种工程技术研究中心通过太空搭载,盆钵筛选选育而成,与原品种相比,具有分枝强、花繁、花期长、紧凑、美观等特点。     

中国太空育种现状及其前景展望

太空环境条件特殊,可以使植物细胞发生突变,从而产生新物种。与常规育种方法相比较,此育种方法具有变异幅度大、稳定快、周期短等优点,不仅植株明显增高增粗,产量和品质也大为提高,中国已经育成如"赣早籼47号"、"赣棉12号"和"太空莲子"等多种的优良太空品种。今后除了继续重视农作物的品种培育外,还应加强树种和花卉的太空育种,只有牢牢把握未来的太空育种方向,才能保持中国在这一领域的世界领先地位。     

利用空间诱变育种技术选育航椒黄帅一代杂种

航椒黄帅是以采用航天搭载、空间诱变、生物技术、农业育种技术集成创新,以育成的新自交系032-1-2-1-1-H-H做母本,以未搭载的082-1-1-H-H做父本培育而成的加工型黄色辣椒一代杂交种.果实长指形,皱纹少,有光泽,青熟果黄绿色,老熟果黄色,味极辣,维生素C的含量202 mg/100 g,可溶性固形物的含量为11.6％;果实纵径17.5 cm,横径1.6cm,肉厚0.16 cm,单果重15.6 g;对辣椒疫病、病毒病、白粉病表现高抗;平均产量56 493.0kg/hm2,适宜在甘肃、宁夏、辽宁、浙江等地区推广种植.     

高效液相色谱法测定多杀菌素的方法研究

[目的]建立一种高效液相色谱法定量测定多杀菌素的分析方法。[方法]以甲醇、乙腈和水(含0.05%乙酸铵)为流动相,采用高效液相色谱仪对多杀菌素进行了测定。[结果]测得甲醇-乙腈-水的最佳配比为49.0∶49.0∶2.0,多杀菌素的最大检测波长为246 nm。方法的线性关系良好,线性相关系数为0.999 97;标准偏差为0.147 6,变异系数为0.143 8%,平均回收率为115.73%。[结论]该方法具有快速、简便、准确的特点,且重复性良好,适合多杀菌素的快速定量检测。     

产壳聚糖酶菌株的选育研究进展

结合最新资料,对壳聚糖酶产生菌的选育研究进行了综述。     

多杀菌素饵剂对红火蚁的药效试验

[目的]为红火蚁的有效防治提供依据。[方法]选择以多杀菌素为原药,制成含量不同的多杀菌素诱饵,研究其对红火蚁的室内外毒杀效果。[结果]0.02%、0.04%和0.08%的多杀菌素诱饵室内毒杀作用迅速,红火蚁全部死亡时间分别为24 h1、2 h和8 h;0.01%多杀菌素毒饵室内作用适中,药后54 h红火蚁死亡率可达到100%。0.01%多杀菌素毒饵对红火蚁野外防控效果明显,药后5 d防控效果达到71.52%,25 d后上升到92.91%。0.01%多杀菌素诱饵不会快速杀死觅食工蚁,可在红火蚁个体间传播,最后达到令其全巢覆灭的目的。[结论]多杀菌素饵剂具有药效高、防治彻底、适合于各种环境使用等优点,是防治红火蚁的理想方法。     

小麦航天诱变育种效果研究

利用返回式卫星搭载两个小麦品种(系)种子进行空间诱变处理,对SP2代农艺性状变异效果进行了分析。结果表明,两个品种(系)的农艺性状均发生了变异,但株系内变异多数为不显著。两个品种(系)的诱变率和性状的变异方向存在差异,豫农201的诱变率高于大粒1号;大粒1号变异株系的性状指标多数为增加,豫农201变异株系的性状指标多数为减少。性状间的诱变率具有差异,株高和粒重的诱变率明显高于其它性状。