中国4个牛种MSTN基因外显子2多态性分析与其系统发生关系研究

[目的]解决牛亚科动物近缘物种的分类归属问题,了解牛亚科各种群遗传多样性。[方法]采用酚-氯仿抽提法从4个中国牛种中提取基因组DNA,对MSTN基因进行PCR扩增和测序,构建系统发育树,探讨4个牛种间MSTN基因外显子2的系统发生关系。[结果]MSTN基因外显子2编码区为372 bp。蒙古牛、牦牛和独龙牛的MSTN基因外显子2具有丰富的多态性。在所测66个样本中存在3个核苷酸多态位点,定义了6种单倍型。雷琼牛、蒙古牛、独龙牛与巴州牦牛享有共同的单倍型。巴州牦牛独自聚成一支,而雷琼牛与一部分独龙牛、大部分蒙古牛和引用瘤牛聚成一支。[结论]蒙古牛、雷琼牛、独龙牛种间存在着基因交流。牦牛与普通牛、瘤牛的分化较明显,比瘤牛与普通牛的亲缘关系要远。     

黔北麻羊MSTN基因的多态性分析

为给黔北麻羊品种遗传资源的保护及进一步选育提供科学依据,利用BsmAI、MspI、EcoRI、MvaI、XmnI、MnII等6种限制性内切酶对黔北麻羊MSTN基因部分内含子1、2和外显子2进行PCR-RFLP多态性分析。结果表明:在扩增的MSTN基因1 241bp序列中含有BsmAI、EcoRI、MvaI和MnII 4个酶切位点,但均不具有多态性;未发现MspI和XmnI酶切位点。     

伊拉肉兔和美系獭兔MSTN基因多态性研究

为了探索伊拉肉兔和美系獭兔MSTN基因多态性,以期为家兔分子选育提供理论依据。试验分别选取了伊拉肉兔与美系獭兔70只,其中公母各35只,采用PCR扩增MSTN基因部分片段并测序,结果：① 共发现了4个SNP位点,分别位于MSTN基因序列外显子Ⅰ的111bp处,内含子Ⅰ的234bp处,外显子Ⅱ的338bp处和内含子Ⅱ的34bp处;外显子Ⅲ中则未发现多态位点;内含子多态位点首次发现。② MSTN基因外显子Ⅰ的SNP位点发生C—T的转换,有CC、CT和TT 3种基因型,CC为优势基因型,且基因型频率分布在伊拉肉兔群体中不符合hardy-weinberg平衡外（P <0.05）。③ 内含子Ⅰ的SNP位点发生了G-A的转换,有GG、GA和AA 3种基因型;外显子Ⅱ的SNP位点处T-A的颠换,有TT、TA和AA 3种基因型;内含子Ⅱ的SNP位点处发生T-C的转换,有TT、TC和CC 3种基因型。这3个SNP位点基因型频率在伊拉肉兔和美系獭兔群体中均符合hardy-weinberg平衡（P >0.05）。④ 4个SNP位点在伊拉肉兔和美系獭兔群体中均表现为中度多态（0.25相似文献   

贵州小香羊MSTN基因内含子2和外显子3的多态性

为贵州小香羊选育及进一步研究MSTN基因与贵州小香羊生长性状的相关性提供理论依据,采用PCR-RFLP方法对67只贵州小香羊MSTN基因内含子2和外显子3进行了多态性分析。结果表明,所扩增内含子2中存在Bsp1286I酶切多态位点,杂合型(AB)为优势基因型,无纯合野生型(AA)和纯合突变型(BB);所扩增内含子2和外显子3中存在BstBI酶切多态位点,杂合型(CD)为优势基因型,纯合野生型(CC)和纯合突变型(DD)为非优势基因型,D等位基因为优势基因,且含有2个TatI正常酶切位点,但不存在多态性,不存在BsmFI酶切位点。     

鹅生长激素基因外显子单核苷酸多态性分析

以莱茵鹅、四川白鹅、豁眼鹅、皖西白鹅和朗德鹅5个鹅品种为试验材料,根据鸭、鹅生长激素基因序列设计了3对引物扩增第2、第3、第5外显子,用PCR-SSCP方法进行单核苷酸多态性分析,并对不同鹅品种进行群体遗传学分析。结果显示:在鹅GH基因第2外显子上共发现2个单碱基突变位点,第39个碱基处的T→C突变未发生氨基酸变化,为沉默突变;第74个碱基处T→C单碱基突变导致第25个氨基酸由缬氨酸(V)变为丙氨酸(A);鹅群中表现出10种基因型(AA、AB、AC、AD、BB、BC、BD、CC、CD、DD)。统计结果发现:10种基因型在鹅品种间分布存在极显著差异(P0.01);所有鹅品种均处于Hardy-W e inberg平衡状态。群体遗传分析显示:杂合度、有效等位基因数朗德鹅最低,豁眼鹅最高;朗德鹅PIC为0,四川白鹅为中度多态外,其他品种均为高度多态。表明鹅GH基因在不同鹅品种中具有丰富的单核苷酸多态性,可以进一步作为候选基因来分析其与生产性状的相关性。     

牦牛MSTN基因第2外显子的遗传变异分析

研究采用PCR-SSCP方法分析了牦牛MSTN基因第2外显子遗传变异特征.结果表明:在第2外显子以及80bp的部分第1内含子和102bp的部分第2内含子,共556bp的区域中存在5处点突变,表现AA、BB、AB、AC 4种基因型,由A、B和C 3个复等位基因控制.各基因型频率分别为0.884 0、0.001 4、0.106 0和0.008 6.序列分析表明等位基因B在位于第2外显子411bp处发生A→G突变,导致编码的第235位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸,其余4处突变位于等位基因C上,即位于第1内含子31bp处的G→A突变和65bp处的核苷酸缺失以及第2内含子529bp处的A→G突变,还有一处是位于第2外显子第121bp处的T→C沉默突变.     

鹅PRLR基因外显子10单核苷酸多态性分析

运用PCR-SSCP法,检测了皖西白鹅和莱茵鹅PRLR基因外显子10的单核苷酸多态性。结果表明：在皖西白鹅群体中存在多态性,10-2位点的A-181G和10-3位点的-/22A缺失突变;而在莱茵鹅群体中则不存在多态性。     

7个绵羊品种PGR基因第4外显子多态性分析

为探索绵羊PGR基因第4外显子的多态性,采用PCR-SSCP技术,对‘德克塞尔羊’、‘无角陶赛特羊’、‘小尾寒羊’、‘蒙古羊’、‘德国美利奴羊’、‘滩羊’和‘藏羊’7个绵羊品种共计414个个体的PGR基因第4外显子进行了遗传多态性检测分析.结果表明:绵羊PGR基因第4外显子存在多态性,发现了AA、BB和AB 3种基因型.不同基因型PCR产物测序结果显示,该多态的产生是由于PGR基因第4外显子扩增序列的第227bp处发生了C→T的碱基突变.基因型和基因频率统计结果表明,‘小尾寒羊’同时存在AA、BB和AB 3种基因型,‘无角陶赛特羊’和‘德国美利奴羊’只存在AA基因型,而其他品种存在AA和AB 2种基因型;在所检测的品种中,AA基因型为优势基因型,A等位基因均为优势等位基因.χ2适合性检验结果表明,7个绵羊品种在该基因座位都处于Hardy-Weinberg平衡状态(P>0.05).不同基因型在7个绵羊品种间分布的独立性检验结果表明,在该位点,‘无角陶赛特羊’与‘藏羊’之间表现为差异极显著(P<0.01);‘无角陶赛特羊’与‘蒙古羊’和‘滩羊’之间,‘德国美利奴羊’与‘滩羊’和‘藏羊’之间均表现为差异显著(P<0.05);‘无角陶赛特羊’与‘德国美利奴羊’只发现同一种基因型,不存在差异;其他绵羊品种之间均表现为差异不显著(P>0.05).多态信息含量(PIC)分析结果表明,‘无角陶赛特羊’和‘德国美利奴羊’在该位点没有多态,其他属低度多态.     

牛LAP3基因内含子12和外显子13单核苷酸多态性

采用单链构象多态性(single-strand conformation polymorphism,SSCP)、创造酶切位点PCR(created restriction site-PCR, CRS-PCR)、限制性片段长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RFLP)以及直接测序方法,研究中国荷斯坦牛、鲁西黄牛和渤海黑牛LAP3基因第12内含子和第13外显子的单核苷酸多态性(SNP)。共检测到5个SNP,分别为24 794（T/G）、24 803(T/C)、24 846（T/C）、24 564（G/A）和25 415（T/C）,其中24 564（G/A）为首次报道的位点。经PCR-SSCP结合测序图谱发现24 794（T/G）、24 803(T/C)、24 846（T/C）位点完全连锁,但该连锁位点在鲁西黄牛群体中未检测到。5个SNP位点在中国荷斯坦牛、鲁西黄牛和渤海黑牛群体的优势等位基因相同,分别是T、T、T、G、T,其等位基因频率分别是T（CH 0.579/LY 1/BB 0.722）、T（CH 0.579/LY 1/BB 0.722）、T（CH 0.579/LY 1/BB 0.722）、G(CH 0.584/ LY 0.775/BB 0.500)和T(CH 0.596/LY 0.796/BB 0.750),多态信息含量均在0.25至0.5之间,属于中度多态。     

绵羊生长激素基因第4外显子的多态性分析

采用PCR-SSCP技术检测包括蒙古羊、小尾寒羊、德国美利奴羊以及德美寒杂交一代在内的绵羊生长激素(GH)基因第4外显子的多态性.结果表明:在1188~1502 bp片段上,德国美利奴羊及杂交后代中,AA型个体占多数,而小尾寒羊则以BB型个体为主.对这个片段的纯合型(AA,BB)分别进行克隆测序发现:1188~1502 bp片段上,AA型在第1406位发生了T→C的突变.实验结果证实绵羊生长激素基因第4外显子存在序列多态性.     

牛MyoG基因单核苷酸多态性分析

以皖东牛和广丰牛共128头牛为研究对象,采用PCR-RFLP方法检测牛MyoG基因的多态性。结果表明,在牛MyoG基因的外显子466碱基处发生G>C突变,检测到AA和AB 2种基因型,该位点的突变未引起氨基酸序列的变化。在皖东牛群体中AA基因型频率为23.66%,AB基因型频率为76.34%;在广丰牛群体中AA基因型频率为17.24%,AB基因型频率为82.76%。皖东牛的多态信息含量（PIC）为0.3606,广丰牛为0.3702,在该位点均处于中度多态。卡方检验表明皖东牛群体处于哈代-温伯格不平衡状态(P<0. 05);广丰牛处于哈代-温伯格平衡状态(P>0. 05)。     

MSTN基因突变对优质鸡肌肉生长的影响

为了研究肌肉生长抑制素基因(MSTN)在优质鸡群体中的遗传变异及其对肌肉生长特性的影响,以优质鸡S3系为研究对象,采用PCR-SSCP及测序技术进行多态性检测。结果发现MSTN基因G195C和A234G 2个突变位点。公鸡群体在G195C处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P0.05),各群体在G195C和A234G位点均处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05)。最小二乘方差分析显示,在G195C位点处,S3系优质母鸡的CC基因型个体胸肌重、腿肌重、肌纤维密度与GG基因型个体差异显著(P0.05),肌纤维面积CC基因型个体极显著高GG基因型个体(P0.01)。在A234G位点处,肌纤维密度GG型个体显著小于AA基因型个体(P0.05),肌纤维面积极显著高AA基因型个体(P0.01)。基因组合CCGG型个体屠体重、胸肌重、腿肌重显著高于GGAA型个体(P0.05),肌纤维面积和肌纤维密度间差异极显著(P0.01)。在G195C和A234G位点处,S3系优质公鸡突变型CC和GG基因型个体在屠体重、胸肌重和腿肌重间差异不显著(P0.05)。在A234G位点处肌纤维密度GG型个体显著小于AA基因型个体(P0.05),肌纤维面积极显著高于AA基因型个体(P0.01)。基因组合CCGG型个体屠体重、胸肌重、腿肌重显著高于GCAA型个体(P0.05),肌纤维面积和肌纤维密度间差异极显著(P0.01)。因此,MSTN是影响鸡肌肉生长的一个主效基因,基因突变显著影响优质鸡肌肉的生长,为优质鸡肌肉生长性状的选育提供遗传学依据,其肌肉生长性状的分子遗传学基础需进一步研究。     

猪PLIN1基因单核苷酸多态检测与遗传分析

以皖南黑猪、安庆六白猪、圩猪和霍寿黑猪共236头猪为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测猪脂滴包被蛋白（Perilipin, PLIN1）基因的遗传多态性。结果表明,在皖南黑猪、安庆六白猪PLIN1基因3 519 bp碱基处发生A>G突变,检测到AA、AB、BB 3种基因型, 其中AA基因型频率在这2个群体中分别为8.97%和29.23%,AB基因型频率分别为43.59%和56.92%,BB基因型频率分别为47.44% 和13.85%;皖南黑猪、安庆六白猪的多态信息含量（PIC）分别为0.3353和0.3690,在该位点均处于中度多态;卡方检验表明皖南黑猪群体和安庆六白猪群体均处于哈迪-温伯格平衡状态(P>0.05);在圩猪、霍寿黑猪群体中PLIN1基因的第2外显子没有检测到突变。PLIN1基因的第3外显子在4个群体中均没有检测到突变。     

巢湖麻鸭MSTN基因单核苷酸多态性与体重和屠体性状的关联分析

应用聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)的方法,检测巢湖麻鸭公母群体共144只个体MSTN基因外显子3和内含子2的SNPs位点,分析SNPs与8周龄体重、12周龄体重和屠宰性能(胸肌率、腿肌率)的关联性。结果表明,在外显子3（6375 bp）检测到G/A突变,形成3种基因型,分别为AA、AB和BB型,公鸭群体中AA型胸肌率显著高于BB型 (P<0.05);母鸭中AB型胸肌率显著高于AA型和BB型 (P<0.05), AA型腿肌率显著高于BB型(P<0.05);各基因型间体重差异不显著(P>0.05)。内含子2（5264 bp）检测到T/C突变,产生的3种基因型分别为DD、DE和EE型,各基因型间体重和屠宰性能差异均不显著(P>0.05); 合并基因型结果显示,ABDD型母鸭胸肌率显著高于AADD型(P<0.05)并且极显著高于AAEE型和BBDD型(P<0.01),ABDD型母鸭腿肌率显著高于BBDD型母鸭(P<0.05);公鸭在各周龄体重上均显著或极显著高于母鸭,但在屠宰性能上普遍显著低于母鸭。综合以上研究结果,巢湖麻鸭公鸭早期生长速度快于母鸭,母鸭ABDD基因型表现出较高的屠宰性能。     

绵羊MSTN基因慢病毒表达载体的构建及其对成肌细胞的分化作用

【目的】构建新疆细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,研究其在细毛羊成肌细胞分化中的作用,并探讨其作用机制。【方法】采用RT-PCR技术,扩增MSTN编码区序列,克隆入plex-mcs慢病毒表达载体,构建plex-MSTN慢病毒表达载体,并进行酶切及测序鉴定。将plex-MSTN包装成plex-MSTN慢病毒。用酶消化法分离培养新疆细毛羊成肌细胞,慢病毒感染制备MSTN过表达成肌细胞系,通过马血清诱导分化,Western blotting检测分化细胞MSTN基因的表达,免疫荧光分析分化肌管的融合率及肌管直径,Realtime RT-PCR检测分化相关基因的表达。【结果】 克隆的新疆细毛羊MSTN基因编码区全长序列（1 128 bp）与NCBI上公布的序列99.9%同源,仅在外显子2上存在单碱基突变;Western blotting检测结果显示,MSTN过表达成肌细胞过表达MSTN蛋白;免疫荧光检测表明,MSTN过表达成肌细胞的肌管融合率与肌管直径分别为5.69%和12.35 μm,显著低于非转化成肌细胞（10.21%和18.5 μm）（P<0.05）;Realtime RT-PCR结果显示,MSTN过表达成肌细胞中的Myogenin、p21、MyoD-基因表达显著下调,Smad3基因表达极显著上调（P<0.01）。【结论】 成功构建了细毛羊MSTN基因慢病毒表达载体,MSTN基因对细毛羊成肌细胞的分化具有显著的抑制作用,确定了MSTN基因与Myogenin、p21、MyoD及Smad3基因在成肌细胞分化过程中的调控关系。     

利用HRM技术对皮南牛MSTN基因C313Y位点快速分型

旨在利用高分辨率熔解(HRM)技术建立一种皮南牛MSTN基因C313Y突变的快速分型方法,进而统计MSTN基因C313Y突变在皮南牛群体中的突变频率,以及突变对生产性能的影响。测量并统计99头皮南牛(母牛)的体尺和体质量指标,然后分别利用Sanger测序法和HRM技术对皮南牛MSTN基因C313Y位点进行分型,并利用一般线性模型分析突变对体尺和体质量指标的影响。结果表明,皮南牛在3岁之后体尺和体质量指标均趋于稳定,平均体高、体斜长、胸围、尻宽、尻长和体质量分别是(127.88±3.65) cm、(154.10±6.89) cm、(181.48±8.54)cm、(46.19±2.94) cm、(50.52±2.65) cm和(471.34±53.78)kg。Sanger测序法和HRM技术对MSTN基因C313Y位点的分型结果完全一致,其中野生型(GG)、杂合型突变(GA)和纯合型突变(AA)的个体分别占8.08%、70.7%和21.21%。关联分析表明,杂合型突变(GA)和纯合型突变(AA)均能够显著提高皮南牛的体尺和体质量指标,其中纯合突变型个体和杂合突变型个体的体质量比野生型个体分别显著提高38.55%和10.32%。成功建立基于HRM的皮南牛MSTN基因C313Y位点快速分型方法,该方法对于快速组建皮南牛MSTN C313Y纯合突变群体,进而有效提高群体的体尺和体质量指标具有重要的应用价值。     

尾叶桉苯丙氨酸解氨酶基因的克隆、表达与单核苷酸多态性分析

【目的】通过获得尾叶桉Eucalyptus urophylla苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因序列,分析其在不同水肥处理下的表达模式及在尾叶桉群体中的单核苷酸多态性(SNP),为研究该基因与尾叶桉抗逆性的相关性提供基础。【方法】根据巨桉E.grandis的PAL基因序列设计引物,通过基因克隆、测序获得尾叶桉PAL基因序列;采用逆转录定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)分析该基因在不同水肥处理下的表达模式。【结果】PAL基因组全长4 507 bp,包括166 bp的5′非编码区、411 bp的3′非编码区、2 172 bp的氨基酸编码序列(由2个外显子组成,分别为422和1 750 bp)和1 759 bp的内含子区域。PAL基因在AT4处理中表达量最高,在AT5处理中表达量最低。尾叶桉PAL基因与巨桉具有高度相似性。尾叶桉PAL基因的SNP位点主要集中在内含子区域,可见尾叶桉PAL基因在长期进化过程中保持着稳定的遗传。【结论】获得尾叶桉PAL基因全长4 507 bp,该基因具有遗传稳定性,且可能在尾叶桉抗逆性中起重要作用。     

秦川牛PYGM基因的表达及其遗传变异对胴体和体尺性状的影响

【目的】以秦川牛糖原磷酸化酶基因PYGM为候选基因,研究其在秦川牛生长和胴体性状形成中的作用。【方法】以300头(24±2)月龄纯种秦川牛为试验材料,通过DNA测序和PCR-RFLP技术,研究PYGM基因的多态性对秦川牛个体宰前活体质量、胴体质量、体高、体斜长和屠宰率共5个性状的影响;运用RT-PCR技术分析PYGM基因在秦川牛成体和4~5月龄胎牛2个阶段的肺脏、心脏、肝脏、舌、背最长肌及脾脏6种组织中的表达情况。【结果】半定量RT-PCR检测结果显示,PYGM基因在秦川牛胎儿和成年时期的心脏、舌及背最长肌组织中的表达量均显著高于其他组织。并在该基因中筛查到了2个新的单核苷酸变异(SNP)位点,分别为PYGM内含子1上的C→T突变和内含子6中的C→G突变。群体多态性分析结果表明,秦川牛群体在这2个位点处于Hardy-Weinberg平衡状态,并且处于中度多态。2个SNP位点中A和C等位基因为优势等位基因,SNP 1位点上AA和AB基因型个体的宰前活体质量和胴体质量显著高于纯合的BB基因型个体;SNP 2位点上CC基因型个体的体高显著高于DD基因型个体。【结论】PYGM基因可以作为秦川牛品种改良中与肌肉生长相关的候选基因。     

6个黄牛群体MyoG基因单核苷酸多态性及其与体尺性状的相关性

【目的】研究牛肌细胞生成素基因(MyoG)第2、3外显子及其侧翼区单核苷酸的多态性(SNPs),分析其与牛部分体尺性状的相关性。【方法】以6个牛群体（鲁西牛、鲁杂牛（鲁西牛×西门塔尔牛）、南阳牛、夏南牛、郏县红牛、秦川牛）共779头3～4岁左右母牛为研究材料,通过PCR-SSCP和DNA测序技术检测牛MyoG基因上存在的SNPs,并分析其与牛部分体尺性状的关联性。【结果】MyoG基因第2外显子及其侧翼区的扩增片段中不存在多态性,第3外显子及其侧翼区的扩增片段中存在3种基因型(AA、AB、BB),测序结果表明该突变位于3′-UTR 2 109位点处。最小二乘法分析表明,各群体中AA基因型个体的体斜长均显著高于BB基因型个体(P＜0.05);鲁西牛群体中AA基因型个体的尻长显著高于BB基因型(P＜0.05);郏县红牛群体中AA基因型个体的体高显著高于BB基因型(P＜0.05)。3种基因型对其他体尺性状没有显著影响(P＞0.05)。【结论】MyoG基因对黄牛体尺性状有一定影响,可作为黄牛体尺性状标记辅助选择的候选基因。     

皖南黑猪CETP基因单核苷酸多态检测与遗传分析

以 112头皖南黑猪为研究对象,采用PCR-SSCP方法检测胆固醇酯转运蛋白（cholesteryl ester transfer protein,CETP）基因的多态性。结果表明：(1) 皖南黑猪CETP基因第1内含子795碱基处发生C→T突变（C795T）;(2) 在C795T突变位点中检测到CC、CT、TT 3种基因型,其基因型频率分别为0.6250、0.3036和0.0714;C的基因频率为0.7768,T的基因频率为0.2232;(3) 皖南黑猪CETP基因的多态信息含量（PIC）为0.2866,该位点处于中度多态;卡方检验表明,该位点的χ²值为1.7388,处于哈迪-温伯格平衡状态。