应用葡萄球菌蛋白A的酶联免疫吸附试验用作检测病毒抗体

研制了一种用辣根过氧化物酶标记葡萄球菌蛋白A的改良间接酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。用辣根过氧化物酶标记蛋白A结合物取代抗球蛋白酶结合物作间接酶联免疫吸附试验,检测马、牛、猪、猫、狗、兔和人血清中的病毒抗体。该试验结果与血清—病毒中和试验作比较。并讨论了在实验室中应用该试验对各种动物血清作血清学试验的可能性。自从在1971年Engvall和Perlmann与Van Weemen和Schunrs研制了酶联免疫吸附试验(ELISA)以来,该方法已广泛用于抗体或抗原的检测。因为ELISA和放射免疫测定法同样敏感,且所用试剂稳定,又不需要复杂设备,故当今已于许多诊断实验室中应用。与大多数其它常用方法比较,ELISA方法价廉、快速、简单。各种改良ELISA试验证明是有用的,特别间接方法适用于传染病研究。然而,因为许多实验室工作用各种动物血清,故需要各种抗球蛋白酶结合物,而商业上制备的结合物种类是有限的。显然,如果有一种能够检测各种动物免疫球蛋白的结合了酶的试剂,将大大促进了间接ELISA试验的多种用途。虽然早已知道葡萄球菌蛋白A与大多数动物种类的IgG结合,但这种现象得到广泛应用仅仅是近年的事。在放射免疫电泳,免疫铁蛋白技术和免疫荧光试验中,这种蛋白已用作代替抗IgG血清。本报告的目的是叙述在间接ELISA方法中,酶标记蛋白A的应用。这种改良方法用单一种试剂可以检测多种动物的抗体。强调了此种方法便于对多种动物病进行实验室诊断。     

猪附红细胞体PPA-ELISA检测方法的建立

用物理方法纯化猪附红细胞体抗原，用纯化抗原免疫兔制备超免疫血清，以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗．建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA)检测方法。结果显示，用PPA-ELISA方法检测猪血液中的附红细胞体，具有很高的敏感性和特异性，重复性良好．完全适用于猪附红细胞体病的实验室诊断。     

以重组mE2蛋白为抗原建立检测猪瘟病毒抗体间接ELISA方法的研究

以在Ｅ．ｃｏｌｉ高效表达的猪瘟病毒Ｅ２基因主要抗原编码区（ｍＥ２）为抗原,以辣根过氧化物酶（ＨＲＰ）标记的兔抗猪ＩｇＧ为二抗,建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。经检测筛选出最佳反应条件为：１２μｇ／孔纯化的Ｅ．ｃｏｌｉ表达的ｍＥ２重组蛋白包被酶标板,用１０％的兔血清或马血清进行封闭,以正常Ｅ．ｃｏｌｉ裂解上清液稀释待检血清。试验表明应用重组ｍＥ２蛋白作为诊断ＨＣＶ抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。     

鹅副黏病毒NP蛋白间接ELISA检测方法的建立及免疫鹅抗体水平的检测

以纯化的鹅副黏病毒NP蛋白为包被抗原,建立了检测鹅副黏病毒NP蛋白抗体的间接ELISA方法,并确定了间接ELISA的最适反应条件：抗原包被浓度为1.0μg/mL,血清稀释度为1∶200,兔抗鹅IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1∶2 000,抗原和血清、血清和二抗均于37℃反应1 h,底物于37℃显色15 min。此间接ELISA方法的特异性强、重复性好。应用该方法对试验鹅血清进行检测,以HI试验为参照。经统计学处理后,比较了两方法测得的抗体效价,分别建立了各组鹅群的回归方程。显著性检验证明,这两种方法检测的抗体效价呈显著相关关系。     

应用酶联葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验检测奶山羊血清中抗布氏杆菌抗体的研究

1977年,Dudois—Dalcq以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白(PPA),用于检测细胞中麻疹和水疱性口膜炎病毒抗原的研究,获得了满意的结果。1979年,酶联葡萄球菌A蛋白酶联免疫吸附试验(PPAELISA)用于检测人血清中狂犬病抗体(Atanasiu)。随后,又有检测豚鼠、家兔     

以重组mE2蛋白为抗原建立检测猪瘟病毒抗体间接ELISA方法 …

以在Ｅ．ｃｌｏｉ高效表达的猪瘟病毒Ｅ２基因主要抗原编码区为抗原，以辣根过氧化物酶标记的兔抗猪ＩｇＧ为二抗，建立了检测猪瘟病毒抗体的间接ＥＬＩＳＡ方法。经检测筛选出最佳反应条件为；１．２μｇ／孔纯化的Ｅ．ｃｏｌｉ表达的ｍＥ２重组蛋白包被酶标板，用１０％的兔血清或马血清进行封闭，以正常Ｅ．ｃｏｌｉ裂解上清液稀释待检血清。     

用间接亲和素—生物素酶标染色法检测马传贫病毒抗体的试验研究

用自制生物素标记兔抗马IgG(简称Bio—IgG)及辣根过氧化物酶与亲和素蛋白偶联物(E—avi),以间接AB酶标染色方法检测马传染性贫血特异性抗体,获得了满意结果。此法比免疫荧光法敏感76信,对照、阻抑试验及类症病马血清均呈阴性结果,43例马传贫血清全部阳性。本试验表明,该方法具有特异、敏感、快速和简便等特点,有实用价值。     

用酶联免疫吸附试验间接法检测猪瘟抗体

酶联免疫吸附试验间接法检测猪瘟抗体系用纯化抗原包被聚苯乙烯微量反应板,洗涤三次;加入待检血清,孵育后洗涤三次;再加入按工作效价稀释的HRP—SPA(辣根过氧化物酶标记的葡萄球菌蛋白A),孵育后洗涤三次;用OPD(邻苯二胺)配制酶的底物溶液。如血清中有猪瘟抗体存在,     

间接酶标抗体染色不检测石蜡切片中鸡肾型传染性支气管炎病毒的研究

以抗鸡肾型传性支气管炎病毒Ｔ株的鼠源超免疫血清为一级抗体，辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠ＩｇＧ为二级抗体，建立了检测石蜡切片中ＮＩＢＶ抗在的间接酶抗体染色技术。经过特异性试验和阻断试验，表明该方法具有高度的敏感性和特异性。     

应用ELISA检测鸭瘟抗体的研究

将粗提鸭瘟病毒经超速离心后作为包被抗原，以健康鸭 IgG 提纯后免疫兔，制备兔抗鸭 IgG，并用改良过碘酸钠法进行辣根过氧化物酶标记，建立了检测鸭瘟病毒抗体的间接酶联免疫吸附试验(ELISA)，经对不同血清样品的检测，表明此方法特异性高，操作简便，适于大批鸭群抗体水平监测和流行病学调查，为合理免疫和科学预防提供了技术手段。     

鹿副结核病抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究以副结核杆菌亲和层析抗原为检测抗原,检测以草分枝杆菌抗原吸收的待检鹿血清,建立检测鹿副结核病血清抗体的间接酶联免疫吸附试验,确定其抗原最佳包被浓度为40μg/mL,血清样品稀释度为1:80,兔抗鹿IgG辣根过氧化物酶标记抗体稀释度为1:8000。经特异性试验和重复性试验证明该方法特异性高、重复性好。对不同地区4个鹿场的760头份鹿血清进行副结核病抗体检测,其中阳性61头份,阳性率为8%,获得副结核病在我国鹿群中的血清流行病学资料,从而为防制鹿副结核病提供一定的依据。     

用3AB-ELISA鉴别猪口蹄疫病毒感染与疫苗免疫猪的研究

采用大肠埃希氏菌表达的口蹄疫病毒(FMDV)非结构蛋白3AB(FMDV-3AB)多肽为抗原，A／G蛋白-辣根过氧化物酶为酶结合物，过氧化氢-四甲基联苯胺为底物溶液，建立了一种可鉴别FMD感染与灭活疫苗免疫猪血清抗体的间接酶联免疫吸附试验(I-ELISA)，即3AB-ELISA。通过对1779份健康猪、免疫猪及人工感染猪血清的检测，确定了该I-ELISA的阳性/阴性判定临界值。该检测方法比VIAA-AGID法检出率高，尤其是采用A／G蛋白酶结合物后操作更简便。     

鼻气管鸟杆菌间接ELISA检测方法的建立及应用

提取A型鼻气管鸟杆菌(ORT)外膜蛋白,经纯化后包被反应板,通过方阵滴定确定最佳抗原包被浓度、血清稀释倍数、兔抗鸡酶标二抗稀释倍数,建立了检测ORT抗体的间接ELISA方法.经方阵滴定确定最佳抗原包被质量浓度为11.85 mg/L,血清样品稀释倍数为1∶20,兔抗鸡IgG辣根过氧化物酶结合物最佳稀释倍数为1∶1 000,抗原抗体最佳结合时间为1 h,血清与二抗最适反应时间为45 min.试验结果确定的判定标准为:样品D490 nm≥0.639判定为阳性,D490 nm≤0.350判定为阴性,介于两者之间的为可疑.试验证明该方法具有良好的稳定性、重复性和特异性,将205份疑似ORT的鸡血清用本方法进行检测,其阳性检出率为11.7%(24/205).     

猪细小病毒SC1株非结构蛋白NS1基因的原核表达及PPA-NS1-ELISA的初步建立

含有猪细小病毒SC1株非结构蛋白NS1基因的重组质粒pPNS1通过EcoR Hind双酶切后,回收NS1基因,将其亚克隆进原核表达载体pET30a( )中,构建了重组表达质粒pET-NS1,转入表达宿主菌BL21中,通过IPTG的诱导表达,SDS-PAGE电泳结果表明,重组NS1蛋白高效表达,以包涵体形式存在,占细菌总蛋白的26.7%。并确定了NS1蛋白的最佳诱导条件:IPTG终浓度为0.6mmol/L,诱导时间为3h。Westernblotting检测表明,表达产物具有良好的免疫原性。重组蛋白经纯化后作为抗原,包被酶标板,以辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白作为二抗,建立了辣根过氧化物酶标记葡萄球菌A蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-NS1-ELISA)。结果表明,抗原最佳包被质量浓度为31.3mg/L,血清最佳稀释度为1∶40。阳性标准初步定为:待检血清D490>0.32,且待检血清D490/阴性血清D490>2.0。     

蛋白A/G在PPR H蛋白ELISA中的应用研究

分别以山羊、绵羊和牛的阳性血清和阴性血清作为待检血清,分别以酶标蛋白A/G、酶标兔抗山羊抗体、酶标兔抗绵羊抗体和酶标兔抗牛抗体作为酶标二抗,进行以小反刍兽疫(PPR)裂解蛋白为抗原和基于抗血凝素(H)蛋白的单克隆抗体的PPRH蛋白酶联免疫吸附(ELISA)试验。结果四种酶标抗体均分别能使山羊、绵羊和牛阳性血清的百分抑制率达到100。在阳性血清百分抑制率为100时,检测山羊时酶标蛋白A/G、酶标兔抗山羊抗体的百分抑制率分别为17、12,检测绵羊时酶标蛋白A/G、酶标兔抗绵羊山羊抗体的百分抑制率分别为20、16,检测牛时酶标蛋白A/G、酶标兔抗牛抗体的百分抑制率分别为14、13。结果认为,酶标蛋白A/G而且与酶标抗抗体相比,具有本底低的优点,在PPRH蛋白ELISA试验中可以同时应用于检测山羊、绵羊和牛血清并具有较好效果。     

蛋白A／G在PPRH蛋白ELISA中的应用研究

分别以山羊、绵羊和牛的阳性血清和阴性血清作为待检血清,分别以酶标蛋白A／G、酶标兔抗山羊抗体、酶标兔抗绵羊抗体和酶标兔抗牛抗体作为酶标二抗．进行以小反刍兽疫（PPR）裂解蛋白为抗原和基于抗血凝素（H）蛋白的单克隆抗体的PPRH蛋白酶联免疫吸附（ELISA）试验。结果四种酶标抗体均分别能使山羊、绵羊和牛阳性血清的百分抑制率达到100。在阳性血清百分抑制率为100时,检测山羊时酶标蛋白A／G、酶标兔抗山羊抗体的百分抑制率分别为17、12．检测绵羊时酶标蛋白A／G、酶标兔抗绵羊山羊抗体的百分抑制率分别为20、16,检测牛时酶标蛋白A／G、酶标兔抗牛抗体的百分抑制率分别为14、13。结果认为．酶标蛋白A／G而且与酶标抗抗体相比,具有本底低的优点．在PPRH蛋白ELISA试验中可以同时应用于检测山羊、绵羊和牛血清并具有较好效果。     

应用间接ELISA检测微小隐孢子虫抗体的研究

以在大肠埃希氏菌中表达的微小隐孢子虫(Cryptosporidum parvum)子孢子表面抗原CPl5为抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA。试验筛选出的最佳反应条件为：大肠埃希氏菌CPl5抗原包被量为1μg/孔，用100mL／L的兔血清进行封闭，以正常大肠埃希氏菌裂解上清液稀释待检血清。试验结果表明，应用CPl5重组蛋白作为诊断微小隐孢子虫抗体的抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。     

鸡传染性喉气管炎兔源高免血清有效酶标免疫组化试验

用辣根过氧化物酶HRP标记ILT兔源高免血清抗体，进行免疫组化试验检测15份人工感染ILT患鸡，5份(ND)患鸡和10份健康鸡气管分泌物，并进行了特异性和敏感性测定．结果人工感染ILT患鸡阳性检出率高达100％，ND患鸡和健康鸡阳性检出率为0．表明ILT兔源高免血清酶联免疫组化试验是一种特异性强、敏感性高的检测诊断方法．     

检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA方法的建立

以在E．coli高效表达的微小隐孢子虫子孢子表面抗原CPl5／60为抗原，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG为二抗，建立了检测微小隐孢子虫抗体的间接ELISA方法。经检测筛选出最佳反应条件为1μg／孔纯化的E．coli表达的CPl5／60抗原包被酶标板，用10％的兔血清进行封闭，以正常E．coli裂解上清液稀释待检血清。结果表明应用CPl5／60重组蛋白作为诊断C．parvum抗原具有特异性高、抗原易纯化和成本低等特点。     

间接ELISA方法检测血清2型鸭疫里默氏杆菌的研究

应用超声波裂解法制备的血清2型鸭疫里默氏杆菌裂解物作为抗原包被酶标板.以辣根过氧化物酶标记的羊抗鸭IgG抗体为第二抗体,以TMB为显色剂,成功地建立了检测鸭血清2型鸭疫里默氏杆菌抗体的间接ELlSA方法.特异性试验和重复性试验证明此方法的特异性高、重复性好.