西农萨能奶山羊乳腺上皮细胞体外培养

用无菌手术法取健康的泌乳期西农萨能奶山羊的乳腺组织,用组织块法进行体外条件下的培养。基础培养液为D—MEM／F-12,含10％胎牛血清,添加EGF(0．01mg／L)、氢化可的松(1mg／L)、孕酮(1mg／L)、胰岛素-转铁蛋白-硒钠(5mg／L)、青霉素(0．05g／L)及链霉素(0．05g／L)。结果表明,获得良好的山羊乳腺上皮细胞原代培养物,传代培养细胞增殖旺盛,长势良好。     

奶山羊乳腺上皮细胞系的建立

乳腺上皮细胞系的建立为乳蛋白基因表达调控机制的研究及乳腺表达载体的检测提供有利条件。本研究建立了正常培养的奶山羊乳腺上皮细胞系。利用胶原酶和透明质酸消化法从奶山羊乳腺组织中分离并获得了纯化的乳腺上皮细胞,利用细胞角蛋白18的免疫荧光染色对乳腺上皮细胞进行了鉴定。通过细胞生长曲线、群体倍增时间、细胞接种存活率、细胞活力检测等生物学性状的检测建立并鉴定了奶山羊乳腺上皮细胞系。结果表明,奶山羊乳腺上皮细胞在添加表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、转铁蛋白-硒钠、10%胎牛血清的DF12培养液中生长状态良好,细胞传至30代时仍保持旺盛的增殖活力。通过细胞传代及反复冻存和复苏实现了细胞系的长期保存,建立了乳腺上皮细胞系,获得了大量的乳腺上皮细胞。从而为开展奶山羊、奶牛等产奶动物乳腺生物反应器及泌乳机制的研究提供了便利条件。     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养技术研究进展

奶牛乳腺上皮细胞具有合成和分泌乳汁的特殊功能,是制作乳腺生物反应器的靶细胞。以奶牛乳腺上皮细胞为试验模型,能够真实反应乳腺生长、发育及泌乳的细胞或分子生物学机制,验证乳腺组织特异性表达载体构建的合理性和有效性,对研究奶牛乳腺生物反应器、乳蛋白基因表达具有重要的意义。文章主要从培养方法、培养体系的建立、形态结构与细胞增殖分化方面阐述乳腺上皮细胞体外培养技术研究进展。     

体外培养的山羊乳腺上皮细胞形态研究

通过有效的细胞培养方法获得山羊乳腺上皮细胞系,对这些细胞形态进行光镜观察,结果发现,细胞可形成闭合型和开放型细胞群,闭合型细胞群边界清晰,细胞之间结合紧密;开放型细胞群边界不清,细胞相互分散存在于一局限的范围内。乳腺上皮细胞与成纤维细胞混生时分区生长,界线明显;细胞之间形成许多腔状结构。纯化的乳腺上皮细胞通过单细胞悬浮后传代,部分细胞形成岛屿状聚集,部分细胞以贴壁的自由单个细胞散在形式存在。上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状(称之为乳球体);乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,细胞之间紧密相靠,互相衔接,连接成片,呈蜂窝状;细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;部分细胞呈圆饼状,体积较大;出现部分长形细胞;部分细胞表面出现绒毛状突起;接触抑制的上皮细胞形态不均一。     

奶牛乳腺上皮细胞三维培养的形态观察

本研究利用原代培养后纯化的奶牛乳腺上皮细胞,以Matrigel为基质胶原,进行奶牛乳腺上皮细胞的三维培养,细胞接种浓度分别为1×104细胞/ml、1×105细胞/ml和1×106细胞/ml。经过16d培养后,用DAPI对细胞染色,利用荧光显微镜观察细胞生长状况。结果表明,当细胞接种浓度为1×104细胞/ml~1×105细胞/ml时,细胞形成了团块状结构,出现了类似腔状的腺泡形态。     

羊乳腺上皮细胞的形态观察

用组织块培养法获得山羊乳腺细胞原代培养物,并根据山羊乳腺成纤维细胞与上皮细胞对胰蛋白酶的敏感性不同将二者分离纯化。对细胞形态进行光镜观察发现:纯化的山羊乳腺上皮细胞传代至第15代时其生长仍正常。山羊乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,大多数上皮细胞呈短梭形或多角形,呈蜂窝状;部分细胞呈圆饼状,体积较大;部分细胞呈长形。纯化的乳腺上皮细胞增殖可形成圆顶型结构,呈乳头状,称之为乳球体。     

大鼠乳腺上皮细胞的体外培养与鉴定

用外科手术的方法采取健康的泌乳期大鼠乳腺组织,采用机械剪切结合酶消化的方法,在体外进行原代乳腺上皮细胞分离培养。结果成功培养出大鼠原代乳腺上皮细胞。显微镜下观察,细胞形成单层呈鹅卵石样;角蛋白免疫组化染色后,呈现阳性反应。经数次传代后,细胞增殖依旧旺盛。     

小鼠乳腺上皮细胞的体外培养

采用I型、II型胶原酶和胰蛋白酶混合（1：1：1）消化乳腺组织,并用差速贴壁法纯化培养乳腺上皮细胞,倒置显微镜下观察细胞的形态,并用角蛋白18免疫荧光染色的方法对细胞进行鉴定。结果表明：改良型混合酶消化法能获得较多的细胞团,且12h后细胞团绝大多数已贴在细胞瓶壁,72h后细胞团完全铺开呈单层融合,细胞呈典型的铺路石样。免疫荧光鉴定结果显示,角蛋白18呈阳性反应。因此,应用改良型混合酶消化法能在短时间内获得大量较纯的乳腺上皮细胞。     

奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系的建立

通过乳汁中提取细胞进行传代培养获得增殖且可分泌特异性酪蛋白的奶牛乳腺上皮细胞,细胞形态以鹅卵石型和多角型为主,逐渐趋于多角型.当多角型细胞增殖融合到一定阶段,会出现乳头状和圆顶型结构.并进一步对泌乳中后期乳汁分离的细胞做细胞生物学性状检测:细胞接种存活率达到81;;细胞生长曲线呈典型的"S"形,符合细胞生长的一般生物学规律;细胞群体倍增时间最短达48.7 h;经过对乳腺上皮细胞特异性分泌蛋白-酪蛋白的检测,证明培养获得的细胞为乳腺上皮细胞,且具有正常分泌乳蛋白功能.试验初步建立了奶牛乳腺上皮细胞的体外培养体系.     

小白鼠乳腺上皮细胞的体外培养

本试验对小白鼠乳腺上皮细胞的原代培养方法进行了探索。胶原酶消化法和组织块种植法均可用于培养小白鼠原代乳腺细胞。胶原酶消化法容易得到均匀的乳腺细胞，且上皮细胞所占比例也比较高。组织块种植法不容易丢失、损伤上皮细胞，然而上皮细胞长出较晚，且占比例较低。结果表明，可结合组织块转移、胰蛋白酶消化纯化上皮细胞。     

二甲基苯蒽诱导山羊乳腺上皮细胞体外转化研究

分别用5,10和15μg／mL二甲基苯蒽(DMBA)的完全培养液处理体外培养的山羊乳腺上皮细胞36, 24和12 h,再以25 ng／mL佛波酯(TPA)作用2周,研究DMBA和TPA对山羊乳腺上皮细胞的诱导转化作用,确定最佳诱导转化条件,探讨二甲基亚砜(DMSO)对细胞增殖的影响。结果表明,用含15μg／mL DMBA的完全培养液培养12 h,再用TPA连续作用4 d,几乎无山羊乳腺上皮细胞存活,10μg／mL DMBA培养24 h转化效果较差,5μg／mL DMBA培养36 h转化效果最佳;转化的山羊乳腺上皮细胞体积增大、核浓缩、生长排列紊乱、无规则并出现转化灶; DMSO对细胞生长有抑制作用．随培养时间延长抑制作用减弱。试验初步建立了乳腺上皮细胞的体外转化系统。     

山羊乳腺上皮细胞培养体系的建立

为研究乳腺上皮细胞增殖和分化特性及其基因表达的分子机制 ,建立了山羊乳腺上皮细胞培养体系。用无菌手术法从健康第二胎泌乳期山羊乳腺取得组织块 ,在体外条件下用组织块法进行原代培养。基础培养液用 RPMI1 6 4 0 ,含胎牛血清 1 5 0 m L/ L,添加 EGF(1 0 μg/ L)、胰岛素 (0 .1 m g/ L)、E2 (1 μg/ L)、氢化可的松 (0 .1mg/ L)、孕酮 (1 m g/ L)、青霉素 (0 .1 g/ L)及链霉素 (0 .0 5 g/ L) ,在铺有胶原的塑料培养板上培养。从细胞接种存活率、细胞群体倍增时间、细胞生长曲线和细胞分裂指数 4个方面考察了乳腺上皮细胞的生物学性状。结果表明 ,在此培养体系中 ,山羊乳腺上皮细胞生长良好 ,增殖旺盛。细胞产物电泳及蛋白印迹分析结果表明 ,培养的细胞为山羊乳腺上皮细胞 ,并具有表达山羊酪蛋白的功能     

雌激素对奶牛乳腺上皮细胞增殖及细胞周期变化规律的影响

目的 研究雌激素对乳腺上皮细胞增殖及细胞生长周期变化规律的影响。方法 选取扩增生长状态良好的乳腺上皮细胞,添加0、50、100、200 μmol/L雌激素孵育乳腺上皮细胞后,分别在0、12、24、48、72 h后检测各组细胞增殖及细胞周期。结果 培养12 h时,50 μmoL/L雌激素组的OD值显著高于对照组及100 μmoL/L雌激素组(P＜0.05),且极显著高于200 μmoL/L雌激素添加组(P＜0.01);培养至12 h时,对照组及添加50 μmoL/L雌激素组其G1期极显著高于其他两组(P＜0.01),对照组S期极显著高于其他各组(P＜0.01),添加100 μmoL/L雌激素组其G2期极显著高于其他各组(P＜0.01)。结论 添加雌激素可以促进乳腺上皮细胞的增殖,且50 μmoL/L、12 h时雌激素促进乳腺上皮细胞的增殖效果最好。添加雌激素不影响乳腺上皮细胞在各时期时细胞生长的基本规律,各雌激素添加组在12 h时的细胞周期由G1、S期向G2期转化较快。     

环腺苷酸对山羊乳腺上皮细胞增殖的影响

为研究环腺苷酸 (c AMP)对乳腺上皮细胞增殖的影响 ,建立了山羊乳腺上皮细胞培养体系。将细胞分为 8个组 ,分别用 1× 10 ,1× 10 2 ,1× 10 3,1× 10 4 ,1× 10 5,1× 10 6 ,1× 10 7pmol/ m L c AMP刺激细胞 ,从中选出效果明显、组间差异显著的 2组作为试验的高剂量组 (1× 10 7pm ol/ m L)和低剂量组 (1× 10 6 pm ol/ m L)。从细胞群体倍增时间、细胞生长曲线和细胞分裂指数 3个方面研究了 c AMP对山羊乳腺上皮细胞增殖的影响。结果表明 ,低浓度的 c AMP有促进细胞增殖的作用 ,高浓度 c AMP有抑制细胞增殖的作用。     

奶山羊乳腺发育过程中肥大细胞的分布

肥大细胞是乳腺内重要的免疫细胞,参与乳腺的免疫防御、发育与重建.对不同发育时期山羊乳腺内肥大细胞的分布特点进行研究,用卡诺氏液固定乳腺组织,甲苯胺蓝染色,肥大细胞呈蓝紫色.结果表明,肥大细胞在乳腺发育的青春期和退化期数量较多,妊娠期数量明显少于青春期(P<0.05).泌乳期内乳腺肥大细胞数量最少,与其他时期差异显著(P<0.05).     

组织块种植法体外培养奶牛乳腺上皮细胞

为建立成熟的奶牛乳腺上皮细胞体外培养体系,以组织块种植法培养荷斯坦泌乳期成年母牛乳腺组织,观测长出的上皮细胞在各生长时期的形态变化,绘制生长曲线并计算群体倍增时间,用免疫组化技术鉴定乳腺上皮细胞角蛋白18的表达,用SDS-PAGE电泳和免疫印迹分析技术检测乳腺细胞的酪蛋白分泌情况。试验结果表明,此培养体系可获得良好的奶牛乳腺上皮细胞,原代以及传代培养,细胞增殖旺盛,长势良好;细胞骨架蛋白——角蛋白18表达为阳性,且培养的细胞具有分泌牛乳酪蛋白的功能。     

四种二肽对奶牛乳腺上皮细胞增殖及β-酪蛋白分泌的影响

通过添加不同浓度的二肽:蛋氨酸-蛋氨酸、赖氨酸-赖氨酸、蛋氨酸-赖氨酸、赖氨酸-蛋氨酸二肽,用CASY细胞活力分析仪检测奶牛乳腺上皮细胞的增殖和活力,用荧光定量PCR、HPLC检测β-酪蛋白的基因表达情况,确定培养24 h时四种二肽的最佳添加浓度分别为80、100、50、80μg.mL-1。以最佳二肽浓度添加时细胞的增殖分别为1.28×105、1.66×105、1.79×105、.85×105cells.mL-1,活力分别为93.72%、95.59%、94.35%、95.65%,培养液中β-酪蛋白含量分别为1.34、1.38、1.44、1.63 mg.10-5cells。为进一步利用小肽提高乳蛋白产量、调控乳蛋白合成提供理论依据。     

体外培养的牛乳腺上皮细胞形态研究

通过有效的细胞培养方法获得了牛乳腺上皮细胞系,并系统观察了乳腺上皮细胞的长出、贴壁、聚集、迁移、分裂、分化、凋亡等一系列形态变化。结果发现,原代培养的乳腺上皮细胞大多数呈卵圆形,细胞之间连接成片,单层生长,如鹅卵石铺过路面,乳腺上皮细胞和成纤维细胞混生时分区生长,界线明显。传代的乳腺上皮细胞呈岛屿状聚集生长,细胞核呈圆形或椭圆形,核仁2～4枚;在含雌激素的培养液中,细胞出现双核或多核现象,但仍表现一定的接触抑制现象。多次传代后的乳腺上皮细胞含不同的细胞类型,通过光镜观察,部分细胞仍保持较快的分裂增殖能力;部分细胞渐渐分化,出现长形细胞、三角形细胞。上皮细胞增殖分化可形成圆顶型结构,乳腺上皮细胞可产生并分泌乳汁,分泌到细胞外的乳汁流动形成网状结构。