胚胎干细胞及其应用

胚胎干细胞(ES细胞)是从动物早期胚胎的内细胞团或原始生殖细胞分离出来的具有发育全能性的一种未分化的无限增殖细胞系.ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等方面的研究应用中起着重要的作用.文章介绍了胚胎干细胞的生物学特性,国内外研究进展和研究动态.阐明了建立ES细胞系的技术要点以及ES细胞的应用及发展前景.     

动物胚胎干细胞的研究概况

胚胎干细胞（ES细胞）是从早期胚胎内细胞团（ICM）或原始生殖细胞（PGCs）经体外分化抑制培养分离克隆的,ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学等的研究应用中起着重要的作用.为此,介绍胚胎干细胞的生物学特性,国内外研究进展和研究动态,阐明建立ES细胞系的技术要点以及ES细胞的应用及发展前景.     

小鼠ES细胞条件培养基对绵羊类胚胎干细胞克隆、传代的影响

本研究以无血清培养基为基础培养液,旨在探求小鼠ES细胞条件培养液(ESCCM)和2种不同饲养层对绵羊类ES细胞分离、克隆效率的影响.绵羊内细胞团从胚胎中分离得到后,分别以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)和绵羊胎儿成纤维细胞(SEF)为饲养层进行培养.结果在MEF饲养层上,绵羊类ES细胞在ESCCM新培养系统中可稳定传至第10代,而使用基础培养液最多传至5代.而在SEF饲养层上,绵羊类ES细胞在ESCCM新培养系统中仅能传至3代.表明使用ESCCM和MEF能促进绵羊类ES细胞的分离和克隆.对类ES细胞进行核型分析、AKP染色及体外分化能力检测,证实所分离的类ES细胞符合ES细胞的主要特征,而且发现这些类ES细胞可以表达胚胎干细胞关键转录因子Nanog.结果表明,ESCCM可显著提高绵羊类ES细胞的分离克隆效率,原因可能是小鼠ES细胞在生长过程中可能分泌某些重要的细胞因子,从而达到促进绵羊ES细胞增殖的作用.且MEF比SEF更适合于绵羊类ES细胞的分离和传代.     

某些因素对牛和小鼠类胚胎干细胞分离与培养的影响

以荷斯坦牛胚胎和小鼠胚胎为材料 ,研究了犊牛血清、饲养层、培养液、添加物和消化液对牛胚胎干细胞和小鼠胚胎干细胞克隆效率的影响。结果表明 ,在 2 4h内使小鼠胚胎贴壁率达 86 %以上的犊牛血清可用于小鼠和牛胚胎干细胞的分离 ;在 ES细胞分离与克隆中 ,以 15 %～ 2 0 %犊牛血清为宜 ,在 DMEM(L)培养基中添加 0 .1μmol/LNa2 Se O3 0 .1mmol/Lβ-巯基乙醇 10 μg/L IGF 10 0 0 IU/m L L IF,能显著提高牛 ES细胞分离与克隆效率 ;在TCM199、DMEM(高糖 )和 DMEM(低糖 ) 3种培养基中 ,低糖 DMEM更适宜于牛 ES细胞的分离 ;优秀胚胎形成的团状 ICM更适宜于分离与克隆 ES细胞 ,在 37℃用低浓度消化液处理 ICM或 ES细胞集落 ,再以机械将其离散为细胞小块 ,ES细胞克隆效率最高。     

昆明小鼠胚胎干细胞培养体系的优化

为了更高效地分离昆明小鼠胚胎干细胞,本研究从饲养层、胚胎发育阶段和培养液方面进行优化。将3代以内的小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)用丝裂霉素C处理后,分别按1×104、1×105、1×106·mL-1密度接种,以H-DMEM+15%KSR+LIF为培养液,观察不同密度饲养层对昆明小鼠胚胎干细胞(ES细胞)生长的影响,并研究胚胎发育阶段和培养液中分别添加干细胞生长因子(SCF)、SCF+胰岛素对昆明小鼠ES细胞分离克隆的影响。结果显示,胚胎在密度为1×105·mL-1的饲养层上,F1代和F2代ES细胞克隆形成率均显著高于其他2组(P<0.05)。囊胚的F2代ES细胞克隆形成率显著高于桑椹胚(P<0.05),培养液中添加SCF显著提高昆明小鼠胚胎贴壁率(P<0.05),同时添加SCF和胰岛素得到昆明小鼠最高胚胎贴壁率及F1、F2代ES细胞克隆形成率。所分离的ES细胞显示AKP染色强阳性,Oct-4、SSEA-1的免疫荧光检测阳性,具有ES细胞的特点。由此认为,发育至囊胚的胚胎在MEF密度为1×105·mL-1上,培养液中同时添加SCF和胰岛素更适合昆明小鼠ES细胞的分离培养。     

昆明系小鼠胚胎干细胞分离培养的优化

以昆明系小鼠为对象,经过丝裂霉C处理成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)制备饲养层,对影响小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)分离培养的相关因素进行研究。分别收集小鼠3.5d的囊胚(扩张囊胚)和4.5d囊胚(孵化囊胚)进行培养,比较扩张囊胚和孵化囊胚的贴壁率、原代克隆率及传代率的情况。收集3.5d胚龄的囊胚,通过全胚法和免疫外科法对内细胞团(Inner cell mass,ICM)进行分离培养ICM集落,确定离散ICM的适宜时间。用0.25%胰酶+0.04%EDTA,0.125%胰酶+0.02%EDTA和0.25%胰酶+1%小鸡血清等方法对小鼠ES细胞集落进行传代,观察不同酶浓度对ES细胞分离克隆的影响。结果显示,孵化囊胚的贴壁率高于扩张囊胚(P0.05),但传代率则相反(P0.05),原代克隆率差异不显著(P0.05);一般ICM增殖培养2～3d(免疫外科法)或4～5d(全胚培养法)后,出现典型的克隆集落,再挑取ICM;0.125%胰酶+0.02%EDTA及0.25%胰酶+1%小鸡血清,形成ES原代克隆率较高,2组没有显著性差异(P0.05);结果表明,分离得到的ES细胞经形态学观察,AKP染色,体外分化试验等表明其具有胚胎干细胞的特性。     

动物胚胎干细胞在动物科学中的应用

自Ｅｖａｎｓ等从延迟着床胚胎中分离出小鼠胚胎干细胞 (ＥＳ)以来 ,包括小鼠在内的各种动物ＥＳ细胞的分离受到国内外科学家的关注[1] 。ＥＳ细胞在克隆动物 ,生产转基因动物 ,创建人类遗传疾病动物模型 ,研究细胞分化 ,细胞与细胞的相互关系以及用人类ＥＳ细胞定向分化制造用于器官移植的组织器官等领域具有广阔的应用前景。本文对动物ＥＳ细胞克隆及其遗传操作技术在动物遗传育种、胚胎学及发育生物学领域的应用前景作一评述和展望。1　生产克隆动物1 1　利用ＥＳ细胞生产克隆动物的优势　近年来的研究表明 ,动物早期胚胎细胞、动物胚胎…     

胚胎干细胞的研究进展及其应用

胚胎干细胞 (ES细胞 )是一类从早期胚胎内细胞团或原始生殖细胞分离和克隆出的、具有发育全能性和多能性的细胞。ES细胞在动物克隆、转基因动物生产、细胞工程、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学、遗传学以及制作动物疾病模型等的研究应用中起着重要的作用。文章介绍了胚胎干细胞及其生物学特性 ,国内外研究进展和新动态。阐述了建立干细胞系的技术要点、ES细胞的应用及发展前景     

ES细胞在遗传育种中的应用

胚胎干细胞(embryonic stem cell．ES细胞)是从早期胚胎内细胞团(inner cell mass．ICM)或原始生殖细胞(primordial germ cells．PGGs)分离和克隆的具有全能性的细胞。ES细胞作为一种新型的实验材料,广泛应用于动物克隆、转因动物的生产、真核细胞基因的表达与调控、人类遗传病动物模型的创建,人类器官移植材料的生产以及细胞分化机制的研究等领域。ES细胞分离、克隆技术与遗传工程和胚胎工程相结合,对于阐明动物生长发育的基本规律、抢救和保护濒危动物遗传资源、建立先进的动物育种技术体系具有重大的理论意义和实践价值。本文将结合胚胎干细胞的生物学特性,综述其在动物遗传育种中的应用及在当前技术水平下存在的问题。     

人胚胎原始生殖细胞的原代培养

从5－9周人胚胎生殖嵴中消化分离原生殖细胞（PGC），将其置于经过丝裂霉素C处理过的单层小鼠胚胎成纤维细胞（PMEF）饲养层上培养。结果，经过培养形成的克隆以及克隆的生长方式基本符合小鼠胚胎干细胞（ES）的特性，表现为细胞核大，细胞排列紧密，界限不清，集落边缘可见分化的成纤维细胞等；将其接种于裸鼠皮下，经过29d生长，得到具有3个胚层组织结构的畸胎瘤。     

胚胎干细胞分离和克隆影响因素的研究进展

胚胎干细胞ES是从早期胚胎或原始生殖细胞中分离出来的能够在体外进行传代培养,而不分化的全能性细胞,ES细胞最主要的生物学特征是具有发育的全能性或多能性,ES细胞能在体外培养、增殖、传代、冻存和诱导分化,是研究生物发育、行为和建立人体疾病模型的理想工具,本文重点论述了影响胚胎干细胞分离和克隆的因素。并展望了胚胎干细胞的应用前景。     

牛胚胎干细胞研究进展

牛胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES)在畜牧业生产中具有重要的应用价值,可以用来研究早期胚胎的发育和培育新品种,对加速牛良种化进程具有重要理论意义和实践价值。国内外很多研究者为建立牛ES细胞系付出了巨大努力,并建立了一些牛类ES细胞系,但是迄今还未建立公认的牛ES细胞系。近年来,小鼠和人类干细胞体外培养及其功能研究取得了巨大进展,然而小鼠和人ES细胞体外培养的条件并不适合培养牛ES细胞。影响牛ES细胞建系过程中的诸多因素如细胞因子、多能性标记基因与表面标记、传代方式和饲养层等还有待深入研究。本文综述了国内外牛ES细胞研究进展和影响牛ES细胞建系的主要因素,以期为牛ES细胞研究提供参考。     

类ES细胞自然分化为跳动的类心肌细胞的观察

胚胎干细胞简称ES细胞，是一种存在于尚未着床的早期胚胎中来分化的原始细胞，从早期胚胎中培养胚胎干细胞，首先必须分离培养出胚胎的内细胞团（即ICM团)。自1981年Evans、Kaufman及Martin等成功地培养出小鼠ES细胞以来．以胎鼠成纤维细胞(MEF)制作饲养层，培养早期胚胎．分离ICM团，进而在抑制分化的条件下，不断地进行     

哺乳动物胚胎干细胞应用研究进展

胚胎干细胞是从哺乳动物着床前胚胎的内细胞团体外分离培养而建立的克隆细胞系 ,具有在体外不分化的无限增殖能力。利用胚胎干细胞建立体外分化模型 ,并建立各种基因改变的胚胎干细胞系 ,以求发现某些基因或因子在胚胎发育早期对不同类型细胞或组织分化形成的作用。本文就胚胎干细胞的研究进展做一综述。1　胚胎干细胞的分离、培养与鉴定关于胚胎干细胞的建系 ,最早由Ｅｖａｎｓ等 ( 1 981 )报道。小鼠受精后 2 5天切除卵巢 ,使囊胚延缓着床 ,收集并体外培养这种囊胚 ,4天后滋养层细胞贴壁生长 ,挑出内细胞团 ,胰蛋白酶处理使细胞分散 ,小…     

胚胎干细胞定向分化研究进展(上)

胚胎干细胞 (ES细胞 )是由哺乳动物早期胚胎分离克隆的一类未分化二倍体细胞 ,能在体外增殖 ,又能保持未分化状态。在一定条件下 ,ES细胞可向多个方向分化 ,并生成多种功能细胞。ES细胞在遗传上具有可操作性 ,即导入外源基因、标志基因和报告基因 ,诱导基因突变 ,基因打靶或导入额外原有基因使之过度表达等。利用该特性可制作各种实验模型并进行各种基因分析。ES细胞能被诱导分化为构成机体的任一种细胞类型 ,可用于临床细胞、组织和器官的修复和移植治疗 ,研究ES细胞的定向分化有着重要的理论和应用价值。1　ES细胞分化机制研究现状目…     

饲养层细胞的接种密度对分离培养胚胎干细胞的影响

建立有效的昆明白小鼠胎儿成纤维细胞(Mouse embryonic fibroblast,MEF)饲养层培养体系,用于分离和培养小鼠胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES细胞)的研究.(1)取怀孕14.5 d昆明白小鼠胎儿分离成纤维细胞,利用体外培养体系分离传代,选取生长旺盛并且已纯化的P3代的MEF,经丝裂霉素处理后.用细胞计数板计算活细胞数,分别按1×104、1×106、1×108/mL密度接种,制备饲养层,观察不同密度饲养层的生长状况.(2)取怀孕4 d的昆明白小鼠囊胚,接种在不同密度饲养层上.观察不同密度饲养层上囊胚、ICM及ES细胞的克隆生长情况.结果显示:囊胚在密度为1 × 106/mL的饲养层上,贴壁率和ICM孵出率分别为(97.0±3.606)%和(96.3±2.887)%,显著高于其他2组;密度为1×104/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率高于密度为1×104/mL(差异极显著,P<0.01)和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率(差异显著,P<0.05);而1×104/mL饲养层和1×108/mL饲养层上的ES细胞克隆形成率差异不显著(P>0.05).结果表明:以1×104/mL密度接种的MEF作为饲养层,最适合用于分离培养昆明白小鼠ES细胞,有利于囊胚的发育,ICM的增殖,促进ES细胞的增殖,并起到抑制其分化的作用.     

ICR小鼠胚胎干细胞的分离与培养

为了研究不同条件对ICR小鼠ES细胞的影响,试验以12.5～13.5 dICR小鼠胚胎成纤维细胞(MEF)为饲养层,以3.5 d ICR小鼠胚胎为试验材料,探讨了血清、生长因子及传代方法对ICR小鼠ES细胞分离培养的影响.结果表明:采用含15%FBS的ES细胞培养液的囊胚贴壁率及ICM增殖率(79.3%,69.0%)均...     

SC1(pluripotin)对昆明小鼠胚胎干细胞分离培养的影响

比较了在无血清培养体系中分别添加小分子化学物质pluripotin(SCl)和白血病抑制因子(LIF)对昆明小鼠ES细胞未分化状态的维持作用,并探讨了SC1在培养液中的最佳浓度.以小鼠胎儿成纤维细胞(MEF)为饲养层,以含LIF的添加血清替代品(KSR)的培养基(ESC-SR)为对照,分别用SC1浓度为0.3、1、3μmol/L的ESC-SR培养液对昆明小鼠胚胎进行分离培养.结果显示:胚胎在添加3 μmol/L SC1的ESC-SR培养液中ICM形成率显著高于对照组(P＜0.05),形成的ES集落与对照组形态差异不明显,最高传至第7代,并且在无饲养层条件下可以传至第6代而保持未分化状态.不同浓度SC1培养液中,胚胎在SC1浓度为0.3 μmol/L组的F2代形成率显著高于1 μmol/L组和3μmol/L组(P＜0.05),所分离的细胞AKP染色呈阳性,Oct4、Nanog和Sox2的免疫荧光染色均显阳性,具有ES细胞的特点.结果表明,ESC-SR培养液中SC1可以替代LIF用于小鼠ES细胞未分化状态的维持,并且可以在无饲养层条件下进行昆明小鼠ES细胞的培养.     

动物胚胎干细胞鉴定方法研究进展

动物胚胎干细胞 (ＥＳ细胞 )是早期胚胎经体外分化抑制培养建立的多能性和全能性细胞系。它在发育阶段类似于早期内细胞团细胞 (Ｉｎｎｅｒｃｅｌｌｍａｓｓ) ,当它被注射到囊胚胎或被注射到去核成熟卵母细胞后 ,可参与包括生殖腺在内的各种组织的形成 ,生产克隆动物。ＥＳ细胞具有多能性及核型正常的特征是其作为研究哺乳类动物胚胎发育、细胞分化、外源基因的表达以及利用基因突变ＥＳ细胞建立人类遗传病动物模型的理论基础。1　形态鉴定　　ＥＳ细胞体积小 ,细胞核大 ,有一个或多个核仁。小鼠ＥＳ细胞直径一般为 12～14 μｍ ,牛的为 11…     

胚胎干细胞的研究与应用

胚胎干细胞（ES细胞）是由早期胚胎内细胞团或盈儿原始生殖细胞分离克隆出的具有发育全能性的细胞，是动物多种组织细胞的祖细胞。由于ES细胞与克隆动物、转基因动物、组织工程、临床克隆治疗和发育生物学、遗传学以及昨动物疾病模型等研究与应用的关系密切，引起广大学者的关注和兴趣。尤其是从1999年以来，人类ES细胞研究取得很大进展，人们渴望该技术尽快成熟，应用于临床医学克隆治疗，在世界范围内掀起了ES细胞的研究热潮。海峡两岸应组织多学科、多行业、多单位的科技工作者协同攻关，使该项研究尽快取得突破性进展。