猪凝血酶的亲和层析纯化及其酶原的激活研究

采用柠檬酸钡作吸附剂、ＥＤＴＡ溶解的方法从猪血浆提取凝血酶原，建立了凝血酶原激活的简单方法。并以环氧氯丙烷活化的Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ４Ｂ为载体，采用１－乙基－３－（３－二甲氨丙基）碳二亚胺进行肝素的固定化，将固定化肝素用于猪凝血酶的亲和层析纯化。结果表明，通过一步亲和层析将猪凝血酶粗品提纯了８．２倍，获得了比活超过１１００Ｕ／ｍｇ的凝血酶，收率为６０％。     

猪凝血酶的分离纯化和部分性质研究

以猪血为材料,采用等电点沉淀和７２４树脂离子交换柱层分离提纯,得凝血的,经ＣａＣｌ４激活后,通过ＤＥＡＥ－纤维素离子交换柱层析,获得比活为１２００ＩＵ／ｍｇ的凝血酶制剂,其收率为３２．１％,研究发现,ＮａＣｌ浓度对猪凝血酶活力有较大的影响,加１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ于凝血酶溶液中,室温放置３ｈ后,活力丧失５０％。猪凝血酶的最适温度和最适ｐＨ分别是３７℃－和ｐＨ７．０。猪凝血酶在ｐＨ７．０,４０℃下放置     

猪凝血酶的分离纯化和部分性质研究

以猪血为材料,采用等电点沉淀和７２４树脂离子交换柱层析分离提纯,得凝血酶原,经ＣａＣｌ２激活后,通过ＤＥＡＥ－纤维素离子交换柱层析,获得比活为１２００ＩＵ／ｍｇ的凝血酶制剂,其收率为３２．１％。研究发现,ＮａＣｌ浓度对猪凝血酶活力有较大的影响,加１ｍｏｌ／ＬＮａＣｌ于凝血酶溶液中,室温（２５℃）放置３ｈ后,活力丧失５０％。猪凝血酶的最适温度和最适ｐＨ分别是３７℃和ｐＨ７．０。猪凝血酶在ｐＨ７．０、４０℃下放置２７ｈ,活力丧失８４％。通过ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００凝胶层析,测出猪凝血酶的分子量为３０ｋｄ。     

猪凝血酶的分离纯化及部分性质研究

经等电点沉淀,ＤＥＡＥ离子交换纤维素柱层析和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００分子筛层析从猪血浆中纯化得到到猪凝血酶,酶比活力为２０００Ｕ／ｍｇ,纯化倍数为１００,酶活力回收为５６％,酶反应的最适ＰＨ和温度分别为７．０和３７℃,ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００层析测得酶分子量为３６０００。猪凝血酶的稳定性较差,４０℃保温２７ｈ,酶活力下降８４％。高浓度的盐对酶稳定性有较大的影响,在２ｍｏｌ＝／ＬＮａＣｌ下放置３     

猪凝血酶的分离纯化及部分性质研究

经等电点沉淀,DEAE离子交换纤维素柱层析和Sephadex G-100 分子筛层析从猪血浆中纯化得到猪凝血酶,酶比活力为2 000 U/m g,纯化倍数为100,酶活力回收为56% ,酶反应的最适pH 和温度分别为7.0 和37℃,SephadexG-100层析测得酶分子量为36 000。猪凝血酶的稳定性较差,40℃保温27 h, 酶活力下降84% 。高浓度的盐对酶稳定性有较大的影响,在2 m ol/LNaCl下放置3 h,酶活力下降50% 。     

聚乙二醇对猪凝血酶的化学修饰及其效果分析

利用亲和层析法,从粗酶中纯化得到猪凝血酶.采用活化的单甲氧基聚乙二醇对凝血酶进行了共价修饰,以此修饰酶为研究对象,进行了凝血酶在修饰前后的主要酶学性质的比较研究.结果表明,凝血酶经mPEGl修饰后,Km有所增加,pH和盐离子浓度的稳定性、热稳定性以及抗胰蛋白酶的水解能力均有所增强.     

猪卵母细胞激活方法的研究

【目的】探讨猪卵母细胞体外胚胎生产的最佳激活条件。【方法】以不同电场强度(100,150,200,250V/mm)、脉冲时间(2,30,40,60,80μs)、电脉冲次数(1,2,3次)的电激活方法及电激活(电场强度为200 V/mm,脉冲时间为60μs,激活次数为1次)联合化学处理(NCSU-23+CHX、NCSU-23+6-DMAP和NCSU-23+CHX+6-DMAP)方法对猪卵母细胞进行激活,研究不同激活方法对猪卵母细胞孤雌活化的影响。【结果】电激活猪卵母细胞时,在200 V/mm、60μs、1次激活的条件下其卵裂率和囊胚率均最高。电激活联合NCSU-23+CHX、NCSU-23+6-DMAP、NCSU-23+CHX+6-DMAP化学处理时,在孤雌激活后期的卵裂率分别为69.17%,82.31%和79.67%,囊胚率分别为24.17%,39.46%和39.84%,在统计学上各处理间无显著差异。【结论】猪卵母细胞孤雌激活的最佳条件,是在电场强度为200 V/mm,脉冲时间为60μs,激活次数为1次的电激活后,联合NCSU-23+6-DMAP处理4 h,再移入胚胎培养液NCSU-23+4 g/L BSA中继续孵育(40±4)h。     

猪卵母细胞的电激活

以湖北白猪体内或体外成熟卵母细胞为对象,研究不同直流脉冲条件、激活液Ｃａ＾２＋浓度及卵龄对猪卵母细胞电激活的影响,并比较了体内与体外成熟卵的激活率与发育率。结果表明,脉冲强度、脉冲次数、脉冲时间、Ｃａ＾２＋浓度及卵龄均可影响激活效果。１次脉冲就足以激活猪卵母细胞,脉冲时间以４０￣６０μｓ为优,强度以１２５０Ｖ／ｃｍ（体外成熟卵）或１５００Ｖ／ｃｍ（体内成熟卵）为优,激活液Ｃａ＾２＋浓度０．０５ｍｍ     

用乙醇激活与电激活研究猪卵母细胞孤雌激活

以猪的体外成熟卵母细胞为实验材料,研究了乙醇激活、电激活对猪成熟卵母细胞体外孤雌发育的影响.结果表明,2个1.6 kV/cm的60 μs的电激活法卵裂率高(88.68％,94/106);使用8％乙醇处理10 min的卵裂率为84.21％(64/76).2个1.6 kV/cm的60μs的电激活法可以获得更高的卵裂率,为下一步研究奠定基础.     

猪卵母细胞电激活参数的研究

以体外成熟的猪卵母细胞为对象,研究不同卵龄、电场强度、脉冲次数和激活液Ca ,Mg 对猪卵母细胞电激活效果的影响.结果表明,1次脉冲就足以激活猪卵母细胞,电场强度以1 250～1500V/cm为优,含Ca ,Mg 的激活液激活效果显著高于非电解质液,卵龄以54h为宜.     

猪卵母细胞孤雌激活的研究

从卵母细胞孤雌激活的机制及影响因素,猪卵母细胞的激活,猪孤雌胚死亡主要原因,提高卵母细胞孤雌激活效果的技术途径,以及对孤雌激活的研究意义和发展前景等方面,对猪卵母细胞孤雌激活研究进行了综述.     

重组猪干扰素α的纯化工艺研究

[目的]研究重组猪干扰素α的纯化工艺,为进一步研究该蛋白的分子结构及rPoIFN-α标准品的制备奠定基础。[方法]将含重组菌E.coliBL21诱导表达后得到的粗制rPoIFN-α,分别用2种方案进行纯化。方案1,依次用GST亲和层析法、DEAE阴离子交换法及分子筛法层析三步法进行纯化;方案2,依次用GST亲和层析和分子筛法层析两步法进行纯化。纯化结果用SDS-PAGE及Western-blot进行纯度检测及鉴定。[结果]诱导表达后的表达产物经SDS-PAGE检测,发现在45Kd分子量处有目的条带,Western-blot检测有特异性条带。通过两步法纯化后的rPoIFN-α纯度达96%,蛋白得率为42.8%,三步纯化纯度为98.8%。[结论]两步法得到的蛋白纯度非常接近三步法,但与三步法相比工艺更为简单方便。     

猪体外成熟卵母细胞的电激活及其激活后的体外培养

 主要研究了猪体外成熟卵母细胞电激活的条件以及孤雌激活胚胎的体外培养体系。用不同场强、脉冲时程和脉冲次数激活猪体外成熟的卵母细胞。结果表明 ,在本试验条件下电激活最佳场强和脉冲时程为 130V·mm-1/ 80 μs ,其囊胚发育率为 (2 0 .12± 8.18) % (P >0 .0 5 )。多次脉冲并不比单次脉冲的激活效果好 (P >0 .0 5 )。孤雌激活胚胎用不同培养方式和气体环境在体外培养 7d ,发现 7d不换液与第 5天换液和第 5天换含 10 %胎牛血清的培养液其囊胚发育率 [分别为 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、(2 6 .4 4± 8.35 ) %和 (17.6 8± 5 .39) % ]无显著差异 (P >0 .0 5 ) ,后两者换液培养方式其囊胚细胞数 (15 .78± 5 .4 6、14 .5 5± 4 .81)明显低于不换液的 (18.0 1± 6 .79,P <0 .0 1)。同时发现低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养的胚胎囊胚发育率和囊胚细胞数和高氧环境 (5 %CO2 的空气 )无明显差别 ,分别为 [(2 0 .78± 8.80 ) %、17.0 0± 6 .12和 (2 5 .30± 7.5 5 ) %、18.0 1± 6 .79,P >0 .0 5 ]。表明激活后第 5天换原液和换含胎牛血清的培养液不能提高囊胚细胞数。低氧 (5 %CO2 ∶7%O2 ∶88%N2 )气体环境培养猪胚胎的效果不比高氧环境 (5 %CO2 的空气 )好。     

猪凝血酶C端衍生肽抑菌活性和膜作用机制研究

猪凝血酶C末端富含正电荷和疏水性氨基酸残基,通过结构参数分析获得截短肽RD27,测定相应指标。探讨猪凝血酶C末端肽段抑菌活性及作用机制。结果表明,RD27对革兰氏阴性和阳性菌最小抑菌浓度为4~8μmol·L~(-1),对血细胞最小溶血浓度为45.9μmol·L~(-1),显示较强的抑菌活性和较低的溶血活性,治疗指数为10,大于蜂毒素。RD27在模拟膜环境中呈现α-螺旋结构,优先与模拟细菌脂质体作用,使E.coli UB1005膜产生去极化作用,并存在时间和剂量依赖效应。揭示其膜作用机制,拓宽抗菌肽设计方法,探究凝血与免疫系统联系。     

猪卵母细胞不同孤雌激活方法的研究

通过对不同电激活参数的摸索,电激活和化学激活联合的研究,以确定适合于猪卵母细胞孤雌激活的最佳方案。结果表明,体外成熟猪卵母细胞在电场时程60μs,1次直流脉冲的条件下,电场强度1.6kV/cm时其卵裂率(88.68%)和桑葚胚率(81.13%)较其他各组高。在电场强度为1.6 kV/cm,1次直流脉冲的条件下,脉冲时程20μs时,卵母细胞卵裂率仅为75.38%,桑葚胚率为64.62%;40和80μs时,卵裂率分别是84.62%和77.17%;100μs时,卵母细胞的卵裂率和桑葚胚率都明显下降。在电场强度为1.6kV/cm,电场时程为60μs的条件下,2次电脉冲激活卵母细胞的卵裂率(87.50%)、桑葚胚率(81.25%)和1次电脉冲的卵裂率(88.68%)、桑葚胚率(80.13%)之间无显著性差异(P﹥0.05),但两者均显著高于3次电脉冲的卵裂率(72.50%)和桑葚胚率(70.27%)。成熟卵母细胞经电刺激(ES)后,分别用CB(7.5μg/mL)、CHX(10μg/mL)、6-DMAP(2 mmol/L)、CB(7.5μg/mL)+CHX(10μg/mL)、CB(7.5μg/mL)+6-DMAP(2 mmol/L)各自处理4 h,ES+CB+CHX和ES+CB+6-DMAP组卵裂率显著高于其他3组,但其桑葚胚率差异不显著。结果显示,电场强度为1.6 kV/cm,电场时程60μs,1次脉冲的电刺激对体外成熟的猪卵母细胞(IVM)孤雌激活效果最好;1次或2次电脉冲就足以激活猪卵母细胞,过高脉冲对细胞反而有伤害作用;电激活和化学激活联合应用可提高猪卵母细胞的卵裂率。     

电激活前亚胺环己酮预处理对猪孤雌激活胚发育的影响

本研究的目的是检测电激活前亚胺环己酮(CHX)预处理对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活及随后胚胎发育的影响。试验结果表明:去卵丘卵母细胞最佳电激活参数为120 V/mm,40μs,1DC。卵母细胞在含CHX(10mg/mL)的NCSU-23中处理10min获得的囊胚率最高,显著高于处理0、30、40min组。电激活前,用CHX预处理较短时间可提高体外成熟卵母细胞孤雌激活胚的发育能力。     

利用电极盘进行猪卵母细胞电激活

[目的]研究不同电激活参数以及电脉冲联合6-DMAP对猪卵母细胞孤雌激活效果的影响。[方法]使用电极盘,测定不同场强（1．1、1．3、1．5、1．7、1．9kV／cm）,不同脉冲时程（30、50、70、90、110ps）,1次脉冲下猪卵母细胞囊胚率的变化。[结果]结果表明,脉冲强度以1．5和1．7kV／cm效果最好,在80胂时其猪卵母细胞囊胚率分别达到（22．35±5．16）％和（20．59±9．41）％;脉冲强度1．5kWcm,1次电脉冲后4h联合6-DMAP激活卵母细胞,当脉冲时程达到70和90μs时,囊胚率分别达到（21．65±9．95）％和（23．10±16．27）％。[结论]在试验条件下,使用电极盘的最适电激活参数为脉冲强度1．5-1．7kV／cm,脉冲时长80μs,1次脉冲电激活。     

猪卵母细胞体外成熟及乙醇孤雌激活研究

探讨了不同基础培养液(mTCM-199、NCSU23)和PMSG、HCG浓度、作用时间对猪卵母细胞体外成熟的影响和乙醇及乙醇与各种化学试剂联合处理对猪体外成熟卵母细胞孤雌激活、孤雌生殖胚胎发育的影响,最终找到了优异的猪卵母细胞体外成熟培养体系,并确定了乙醇孤雌激活的适宜浓度、作用时间和与不同化学试剂联合处理的适宜组合。结果表明:优化的猪卵母细胞体外成熟培养体系为NCSU23 20 IU/mLPMSG 20IU/mL HCG 10%PFF,激素作用时间为45 h,成熟率可达70.3%±3.9%;乙醇的适宜激活浓度为8%,激活率为29.6% 2.5%;乙醇激活的适宜处理时间为10 min,激活率为32.6%±4.1%;乙醇与CB CHX联合处理的激活率最高,激活率为60.8%±3.2%,卵裂率、3-4细胞率、6-8细胞率分别为45.1%±3.0%、28.6%±3.7%、8.7%±1.2%;乙醇与CB 6-DAMP联合处理的激活率为51.7%±1.9%,卵裂率、3-4细胞率、6-8细胞率分别为41.7%±3.6%、30.3%±4.3%、9.9%±1.8%,虽然激活率、卵裂率低于乙醇与CB CHX处理组,但3-4细胞率、6-8细胞率均高于乙醇与CB CHX处理组(30.3%±4.3%对28.6%±3.7%,9.9%±1.8%对8.7%±1.2%)。因此,乙醇激活的适宜方法为:8%乙醇处理10 min,CB 6-DAMP处理7 h。     

猪卵母细胞孤雌激活方法及影响因素的研究

 研究了离子霉素、电刺激、二硫苏糖醇、6-DMAP和硫柳汞等单独或结合使用及极体形态对猪卵母细胞的激活率、原核类型及激活卵卵裂的影响。结果表明:(1) 单独用离子霉素(88.9%)或电脉冲(80.0%)处理卵母细胞的激活率与二者同6-DMAP结合处理的激活率(84.3%和79.1%)差异不显著,但6-DMAP处理明显(P<0.05)提高电激活卵的1PN比率,而对离子霉素激活卵作用不明显。(2) DTT后处理显著提高硫柳汞处理对卵母细胞的激活率(由4.6%提高到82.6%)。(3) 极体皱缩(85.4%)和极体     

不同激活方法对猪ICSI卵早期发育的影响

[目的]探讨不同激活方法对猪单精子显微受精（ICSI）胚发育的影响。[方法]冷冻精子解冻洗涤后直接应用于ICSI,ICSI后采用不同激活方法激活卵母细胞,检测其原核形成情况。[结果]结果表明,单纯电脉冲激活以及电脉冲与6-DMAP联合激活其受精率分别达53.3%和60.4%,对ICSI卵雌雄原核形成的影响差异不显著（P〉0.05）;ICSI后采用不同激活方法激活卵母细胞,检测猪ICSI卵胚胎早期发育情况,单纯电脉冲激活囊胚率达13.0%,显著高于对照（P〈0.05）。[结论]单纯电脉冲激活能促进猪ICSI胚胎的早期发育。