用PCR方法诊断鸡传染性鼻炎的研究Ⅱ.病料保存及治疗对诊断的影响

围绕副鸡嗜血杆菌（Ｈｐｇ）分离和ＰＣＲ检验中遇到的病料运输保存及药物治疗影响问题进行试验设计， 结果证明将棉拭子放在甘油ＰＢＳ中４℃或直接取病鸡头冷藏运输保存对Ｈｐｇ 分离和ＰＣＲ 检验是最为简便有效的方法，Ｈｐｇ 可存活３～７ｄ，ＰＣＲ 检验到９０或３０ｄ 仍很敏感。试验还表明，抗菌药物治疗不仅影响细菌分离，也影响ＰＣＲ 检测。     

DIG—标记鸡传染性法氏囊病病毒cDNA探针的制备

用ＩＢＤＶ特异引物对ＩＢＤＶ ＲＮＡ进行逆转录和ＰＣＲ扩增。以低融点琼脂糖凝胶电泳法回收ＰＣＲ扩增带，经酚－氯仿纯化后，用ＤＩＧ标记制备ＩＢＤＶ ｃＤＮＡ核酸探针。斑点杂交试验证明，该探针能与ＩＢＤＶ不同毒株发生阳性杂交反应，敏感度为１ｐｇ。本实验制备的ＩＢＤＶ ｃＤＮＡ核酸探针不仅为ＩＢＤＶ的流行病学研究和分子生物学鉴定提供了敏感可靠的手段，而且也是核酸探针制备方法的一次探索。     

用核酸探针检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物，ＰＣＲ产物重组子和新城疫强，弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ，ＩＬＴ，ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料的杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是且特异的检测方法。     

地高辛标记大肠杆菌1型菌毛结构基因核酸探针对鸡大肠杆菌分离株？…

将ＰＣＲ扩增的鸡大肠杆菌１型菌毛蛋白结构基因（ｐｉｌＡ）用地高辛标记成核酸探针与分属２８个血清型的５０个鸡大肠杆菌分离株进行斑点杂交，阳性率达８４％，用甘露糖敏血凝试验（ＭＳＨＡ）检测阳性率为７２％，表明核酸杂交比ＭＳＨＡ法更敏感。     

用地高辛标记的核酸探针从尿囊液和组织中检测传染性支气 …

将ＩＢＶＴ株基因组Ｓ１基因上０．６kb片段（位于Ｓ１基因上１１２１bp～１７２３bp之间）克隆到ＰＩＢ－ＰＣＲ Ｃloning vector中,用地高辛标记探针,分别与９株ＩＢＶ 的ＰＣＲ产物和１２株ＩＢＶ的核酸进行点杂交均呈阳性反应,而该探针不与ＩＢＤＶ和ＮＤＶ的ＲＮＡ,ＥＤＳ－７６病毒的ＤＮＡ及正常鸡胚尿囊液的抽提物反应。探针检测ＩＢＶ－ＰＣＲ产物的灵敏度为１００～２００pg。用该探针检测不同毒株ＩＢＶ在鸡胚中的繁     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT—PCR扩增及其 …

采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶ Ｓ１全基因特异性引物分别从我国华东,华北,华中,华南,西北及东北等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅⅢ酶切分析及其与英国ＩＢＶ Ｓ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶ Ｓ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５‘和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切识别位点的分子修饰之后插入到     

PCR结合分子杂交法检测鸡传染性支气管炎病毒

利用逆转录－ＰＣＲ（ＲＴ－ＰＣＲ）特异性扩增鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）基因组中Ｍ基因和Ｎ基因之间一段核酸片段。以ｐＵＣ１９质粒载体将此片段克隆，用ＥｃｏＲＩ和ＨｉｎｄⅢ酶切此重组质粒，回收克隆片段后，制成生物素标记的核酸探针。用ＲＴ－ＰＣＲ及生物素核酸探针法分别对ＩＢＶ，ＩＢＤＶ，ＩＬＴＶ，ＭＤＶ及ＮＤＶ进行检测，结果证明该方法为ＩＢＶ特异性检测方法。对人工感染ＩＢＶ的ＳＰＦ鸡口腔棉拭样品进行跟踪检测，证明本方法能在ＳＰＦ鸡接毒后１～１０ｄ内检出ＩＢＶ。     

鸡传染性支气管炎腺胃病变型毒株免疫原基因的分离鉴定

以腺胃病变型鸡传染性支气管炎病毒分离株Ｈ９５提取的ＲＮＡ为模板，按ＩＢＶＢｅａｕｄｅｔｅ株Ｓ１基因两侧对应序列，设计一对２７ｂｐ引物，引物间跨幅为１７Ｋｂ。用反转录聚梧酶链反应（ＲＴＰＣＲ）获得与预期大小一致的核酸片段。ＲＴＰＣＲ产物凝胶电泳后，Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹，经Ｓ１探针检测呈阳性，表明获得分离株Ｈ９５Ｓ１基因。从核酸水平说明以腺胃病变为特征的分离毒Ｈ９５为传支新出现的变异株。此结果与我们血清学鉴定结果一致。     

新城疫病毒融合蛋白基因片段的构建与鉴定

重组和构建了新城疫病毒融合蛋白基因,并对该基因进行了鉴定。结果显示,将ＮＤＶ Ｆｘ基因片段经ＲＴ－ＰＣＲ扩增,插入经ＥｃｏＲⅠ和ＳａｌⅠ酶切克隆载体ｐＵＣ１８及表达载体转化大肠埃希氏菌ＪＭ１０９株。用氨苄青霉不平板法初步筛选克隆,双酶切法,核酸探针,ＰＣＲ及核苷酸序列分析法鉴定后,表明插入成功且阅读框架正确。     

禽流感A／鸡／北京／1／96（H9N2）株核蛋白基因克隆和序列分析

本研究采用ＰＴ－ＰＣＲ法从禽流感Ａ／鸡／北京／１／９６（Ｈ９Ｎ２）株克隆了核蛋白（ＮＰ）基因。ＮＰ基因全长１４９７ｂｐ,编码４９８个氨基酸。将其序列与数株Ａ型流感病毒ＮＰ序列进行比较,相互间同源性在９６．６％～９５．４％。这一结果为研究核酸探针和其它方法诊断禽流感奠定了基础     

DNA—RNA杂交法检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ，制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物、ＰＣＲ产物重组子和新城疫强弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ、ＩＬＴ、ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料和杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是敏感且特异的检测方法。     

用核酸探针检测新城疫病毒的研究

用光敏生物素标记鸡新城疫ｃＤＮＡ，制备核酸探针，经斑点杂交和碱性磷酸酶显色后，探针同该ｃＤＮＡ的ＰＣＲ产物、ＰＣＲ产物重组子和新城疫强、弱毒株呈现阳性反应，与ＩＢＶ、ＩＬＴ、ＭＧ和正常尿囊液等均呈阴性杂交反应，田间病料的杂交试验也表明该ｃＤＮＡ探针是敏感且特异的检测方法     

DIG－标记鸡传染性法氏囊病病毒cDNA探针的制备

用ＩＢＤＶ特异引物对ＩＢＤＶＲＮＡ进行逆转录和ＰＣＲ扩增。以低触点琼脂糖凝胶电泳法回收ＰＣＲ扩增带，经酚－氯仿纯化后，用ＤＩＧ际记制备ＩＢＤＶＣＤＮＡ核酸探针．斑点杂交试验证明，该探针能与ＩＢＤＶ不同毒株（ＳＴＣ、Ｌｕｋｅｒｔ、Ｂ＿２和ＬＱ）发生阳性杂交反应，敏感度为１ｐｇ．本实验制备的ＩＢＤＶｃＤＮＡ核酸探针不仅为ＩＢＤＶ的流行病学研究和分子生物学鉴定提供了敏感可靠的手段，而且也是核酸探针制备方法的一次探索。     

副鸡嗜血杆菌种特异性的核酸探针

副鸡嗜血杆菌种特异性的核酸探针陈小玲Ｊ．Ｋ，Ｍｉｆｌｉｎ张培君Ｐ．Ｊ．Ｂｌｅｃｋａｌｌ（北京市农业科学院畜牧兽医研究所北京，１０００８１）鸡传染性鼻炎（ＩＣ）是由副鸡嗜血杆菌（Ｈｐｇ）引起的呼吸道传染病。其危害主要在于影响鸡的生长和使鸡产蛋率下降。诊...     

地高辛标记DNA探针检测伪狂犬病的研究

利用伪狂犬病病毒特异性扩增产物制成地高辛标记的探针，对闽Ａ株，鄂Ａ株，Ｂａｒｔｎａ株，英国株及临床病料进行检测，其结果与ＰＣＲ检测结果相符，准确率为１００％，灵敏度达到２ｐｇＤＮＡ，试验认为该探针具有灵敏、特异、安全的特点     

地高辛标记DNA探针检测伪狂犬病的研究

利用伪狂犬病病毒特异性扩增产物制地高辛标记的探针，对闽Ａ株，鄂Ａ株，Ｂａｒｔｎａ株，英国株及临床病料进行检测，其结果与ＰＣＲ检测结果相符，准确率为１００％，灵敏度达到２ｐｇＤＮＡ，试验认为该探针具有灵敏，特异，安全的特点。     

鸡传染性支气管腺胃病变型毒株免疫原基因的分离鉴定

以腺胃病型变型鸡传染性支气管炎病毒分离株Ｈ９５提取的ＲＮＡ为模板,按ＩＢＶ Ｂｅａｕｄｅｔｔｅ株Ｓ１基因两侧对应序列,设计一对２７ｂｐ引物,引物间跨幅为１．７Ｋｂ。用反转录－聚梧酶链反应获得与预期大小一致的核酸片段。ＲＴ－ＰＣＲ产物凝胶电泳后,Ｓｏｕｔｈｅｒｎ印迹,经Ｓ１探针检测呈阳性,表明获得分离株Ｈ９５Ｓ１基因。     

我国鸡传染性支气管炎病毒地方性流行毒株S1基因的RT-PCR扩增及其克隆与鉴定

采用ＲＴ－ＰＣＲ方法,以ＩＢＶＳ１全基因特异性引物分别从我国华东（ＨＤ）、华北（ＨＢ）、华中（ＨＺ）、华南（ＨＮ）、西北（ＸＢ）及东北（ＤＢ）等地的ＩＢＶ流行株基因组中扩增出预期的１．７ｋｂ左右的ＤＮＡ片段。ＰＣＲ产物的ＨａｅＩＩ酶切分析及其与英国ＩＢＶＳ１全基因核酸探针的分子杂交证实所获６个ＩＢＶ流行株的ＰＣＲ产物为ＩＢＶＳ１基因。将此６个毒株的Ｓ１基因ＰＣＲ产物分别进行５’和３’端的ＢａｍＨＩ和ＨｉｎｄＩＩ酶切识别位点的分子修饰之后插入到克隆质粒ｐＵＣ１８的ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄＩＩ位点,在大肠杆菌中实现了目的基因的分子克隆。Ｓ１基因的ＲＦＬＰ分析表明我国ＩＢＶ已有分子水平的变异。     

鸡毒支原体感染的诊断方法和防制研究

鸡毒支原体感染是严重感受养鸡业的一种传染病，经常与其他细菌性或病毒性疾病并发或继发。可发生于整个饲养周期，呈慢性经过，复发率很高。常用的诊断方法有病原的分离鉴定、血清平板凝集试验、血凝抑制试验和酶联免疫吸附试验等。近几年来ＰＣＲ、核酸探针等敏感性和特异性更高的分子生物学方法也得到了应用。免疫接种是防制该病的重要方法。当前应用的疫苗主要有灭活苗和弱毒苗。灭活苗安全不散毒，但不能阻止鸡毒支原体野毒株在     

用PCR技术从一兔出血症病料扩增和检出2种病毒核酸

应用ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ技术,对兔出血症病毒核酸作了鉴定,分别设计合成２对ＰＣＲ扩增特异性引物,即按兔出血症病毒中国分离的ＮＪ核酸酸序列合成１对引物（ＮＪ引物）,按国分离的ＦＲＧ株核酸序列民另１对引物（ＦＲＧ引物）,进行ＰＣＲ和ＲＴ－ＰＣＲ。