三疣梭子蟹生长相关 SNP 位点的鉴定

为了发掘三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)与生长相关的SNP,本研究基于三疣梭子蟹比较转录组学数据,筛选出生长相关候选基因片段19条,利用该基因序列设计引物进行PCR扩增,得到总长为17 387 bp的DNA片段;通过直接测序法发现74个SNP位点,分布频率为0.43/100 bp,其中转换突变的比例为80%,颠换突变的比例为20%,转换的比例远远大于颠换,符合"transition bias"原理。C/T(G/A)突变所占比例为60%,G/T(C/A)突变占20%,A/T突变占9.33%,G/C突变占10.67%,C/T(G/A)突变所占比例最大。内含子上突变发生的频率为1.34/100 bp,外显子上仅为0.17/100 bp,说明外显子上的碱基更加保守。通过飞行质谱法,在三疣梭子蟹生长性状分离群体中成功分型了10个SNP位点;通过卡方检验和多元方差分析的方法进行性状关联分析,发现3个SNP位点与生长性状显著相关(P0.05),并且comp58070-R31位点与生长性状极显著相关(P0.01);一般线性模型的多元方差分析显示,comp58070-R31位点与体重、全甲宽、甲宽3个性状极显著相关(P0.01),与体长、体高2个性状为显著相关(P0.05);comp46623-F49位点与甲宽显著相关(P=0.05);comp49193-R333位点与甲宽显著相关(P0.05)。通过对SNP位点的多态性分析发现,三疣梭子蟹SNP标记观测杂合度(Ho)范围为0.162 8~0.833 3,期望杂合度(He)范围为0.189 6~0.591 2,并且显示SNP标记的信息量低于微卫星标记。该研究的结果将有助于推进三疣梭子蟹分子标记辅助育种进程。     

脊尾白虾线粒体基因组SNP位点的筛选及其特征分析

基于mtDNA全序列设计109对引物,利用高分辨率溶解曲线技术,对采自江苏省连云港和南通吕四港沿海地区养殖池塘中平均体长(5.23±0.33) cm的脊尾白虾潜在的单核苷酸多态性(SNP)位点进行筛查,以获得脊尾白虾线粒体基因组(mtDNA)上的SNP位点。结果显示,在109对引物中,有80对引物具有特异性扩增结果;高分辨率熔解曲线(HRM)检测分析表明,80对引物中有9对引物的扩增产物中含有SNP位点,共包含16个SNP位点。统计结果显示,脊尾白虾线粒体基因组中的SNP位点均为单倍型,分布频率为0.10/100 bp,其中转换突变(G/A和C/T)占全部SNP位点的87.5%,颠换突变(A/T)占12.5%,未出现插入、缺失等突变形式;定位分析发现,获得的16个SNP位点分布在脊尾白虾mtDNA的COX1、cob、COX2、tRNA~(Asp)、nad1、nad4、nad5 7个区域,在COX1基因区域中SNP位点最多,有5个SNP位点,其次是在cob区域中有3个SNP位点;进一步比对SNP位点编码的对应氨基酸,结果显示同义SNP位点占总个数的43.7%,而非同义SNP位点相对较多,占56.3%,可能会导致蛋白质的性质和功能发生变化。本研究筛查出的SNP位点,将为进一步开展脊尾白虾的系谱鉴定和遗传多样性分析等工作提供帮助。     

三疣梭子蟹线粒体基因组SNP在增殖放流家系识别中的应用

为开发三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)增殖放流分子标志技术,本研究在前期获得三疣梭子蟹线粒体基因组24个SNP位点的基础上,采用高分辨率熔解曲线(HRM)检测技术对4个用于增殖放流的家系(A、B、C和D)(代表约80~120万个放流个体)进行了鉴别工作。结果显示,含有SNP位点的22条PCR扩增序列中,有9条SNP位点扩增产物在亲代(母本)及其子代的28个个体之间具有基本一致的熔解峰,且子代个体间Tm的均一性较好,无明显差异;进一步以序列已知的野生型及其突变体作为同一SNP引物扩增片段,在各家系间分析HRM标准曲线,这9个SNP可以成功用于三疣梭子蟹4个放流家系的鉴别。在这9个SNP位点中,可鉴定C家系的有5个,可鉴定B家系的有2个,可鉴定A、D家系的各1个。该研究结果为三疣梭子蟹种质资源的鉴定及标志放流工作的开展提供了技术支持。     

不同地理群体三疣梭子蟹mtDNA本底甲基化水平分析

利用重亚硫酸盐测序法,对适于三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)线粒体基因组甲基化分析的BSP(Bisulfite sequencing PCR)引物进行了筛选,在设计的21对引物中,获得了12对BSP引物。利用这12对引物分析了三疣梭子蟹海州湾群体(江苏连云港)和莱州湾群体(山东东营)线粒体基因组本底甲基化水平,结果表明:海州湾群体不存在甲基化现象,莱州湾群体发现了2个个体在ND2基因(NADH脱氢酶亚基2)位点存在甲基化现象;在存在甲基化的个体中,甲基化类型主要为CHG和CHH类型,还有少量Cp G类型。该研究结果说明,莱州湾群体和海州湾群体线粒体基因组本底水平上的甲基化特征存在一定差异,相关研究值得进一步深入探讨。     

凡纳滨对虾α-淀粉酶基因的SNPs检测

利用PCR产物直接测序法,对凡纳滨对虾SPR和SPF 2个品种共40个样本的α-淀粉酶基因(GenBank序列号:AJ133526)的单核苷酸多态性(SNP)进行了研究。找到9个SNPs,分别为:C127T、A138G、T951C、T1083C、C1457T、A2147C、A2226G、A2297G和T2306C。其中1个SNP是第4外显子中的错义突变,2个SNPs分别是第5和第7外显子中的同义突变,6个SNPs是内含子中的突变。这些结果可为凡纳滨对虾的研究提供遗传学依据。     

凡纳滨对虾α-粉酶基因的SNPs检测

利用PCR产物直接测序法,对凡纳滨对虾SPR和SPF2个品种共40个样本的仅一淀粉酶基因（GenBank序列号：AJ133526）的单核苷酸多态性（SNP）进行了研究。找到9个SNPs,分别为：C127T、A138G、1951C、T1083C、C1457T、A2147C、A2226G、A2297G和T2306C。其中1个SNP是第4外显子中的错义突变,2个SNPs分别是第5和第7外显子中的同义突变,6个SNPs是内含子中的突变。这些结果可为凡纳滨对虾的研究提供遗传学依据。     

牙鲆mstn基因SNPs位点多态性与生长性状的关联分析

为研究牙鲆(Paralichthys olivaceus)肌肉生长抑制基因(mstn)多态性,开发其分子辅助育种新标记,采用重测序方法对120尾牙鲆(3个双克隆杂交家系：60尾;3个雌核发育家系：60尾)的mstn基因进行单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism, SNP)位点筛选,并对不同基因型个体的生长性状进行多重比较及SNP标记验证。结果显示,共检测到7个SNPs位点,均为颠换型突变;外显子区3个(Exonl 1:G2063A; Exonl 3:C3883T, C4009A),为同义突变;内含子区3个(Intron 1:A2444T; Intron 2:T3816C, A3832C);3’端非编码区1个(3’UTR:C4564A)。SNPs与生长性状关联分析结果表明,A3832C和C4564A标记位点与牙鲆体质量、体长、体高等生长性状显著相关(P<0.05),其中A3832C位点AA基因型和C4564A位点AC基因型在生长上表现出优势,A3832C位点CC和C4564A位点AA、CC基因型在生长上表现出劣势,其他5个SNPs位点对牙鲆生长...     

草鱼GH基因3'部分序列多态性与生长性状及肌肉成分的相关性分析

为了解草鱼GH基因多态性与早期生长性状及肌肉成分的相关性,实验利用直接测序法从156尾草鱼GH基因的3′部分序列中共筛选到9个变异位点(分别命名为SNP1~SNP9:G2825A、G2914T、T2966G、A3002T、T3022C、A3301G、C3463T、C3547T、C3620T)。卡方检验结果显示,9个位点均未显著偏离Hardy-Weinberg平衡,且均表现为中等多态性(0.25PIC0.5);经连锁不平衡分析发现,SNP3、SNP4和SNP5位点为一组完美连锁不平衡,SNP2、SNP7、SNP9位点为一组完美连锁不平衡;GH基因3′部分序列5个位点单倍型分析共发现6种单倍型,其中Hap1(30.4%)所占的比例最高,Hap6(4.8%)所占比例最低。利用GLM及多重比较对草鱼GH基因中9个SNPs多态性与早期生长性状和肌肉成分进行相关性分析,发现SNP2和SNP3位点的纯合突变型在体质量、体长和粗脂肪性状上均显著高于野生型和杂合突变型;在双倍型分析时得出了相似的结果,同时含有SNP2和SNP3位点纯合突变的双倍型组合在生长和粗脂肪性状上均显著性高于其他组合。研究表明,草鱼GH基因中SNP2和SNP3位点与早期生长性状及肌肉成分存在显著性相关,可作为草鱼生长及肉质改良的候选辅助分子标记,并且为进一步对相关变异位点的功能验证奠定研究基础。     

ENU诱变草鱼家系生长特性及肌肉生长抑制素基因SNP筛选的研究

经过175 d养殖,对4个N-乙基-N-亚硝基脲(ENU)诱变草鱼家系进行生长对比,采用显著性比较,偏相关分析和因子分析统计方法对草鱼体质量、全长、体长、头长、体高、尾柄长、尾柄高、体厚性状进行分析,进而运用双向测序法对MSTN1、MSTN2基因在具有明显差异家系中进行SNP位点筛选。试验结果显示,家系4的生长速度明显大于家系3,家系4的8个性状明显大于其他3个家系;家系1中体长、尾柄长、体厚与体质量密切相关,家系2中体长、头长、体厚与体质量密切相关,家系3中全长、体长、尾柄高与体质量密切相关,家系4中全长、体长、体厚与体质量密切相关。由此可知,家系4和家系3具有明显的生长差异。对于MSTN1基因,家系3在465位点C/G、467位点G/A,家系4在465位点C/G均发生错义突变;对于MSTN2基因,家系3和4在912位点C/T均发生同义突变,家系3在1027位点G/A、家系4在366位点A/G均产生错义突变,位于非编码区1390位点A/T和1401位点G/A在两个家系均发现SNP位点。试验结果表明,MSTN1、MSTN2基因的不同SNP位点与ENU诱变草鱼的生长性状存在紧密联系。     

紫贻贝EST-SNP的筛选及多态性检测

利用EST 数据库开发SNP是筛选SNP标记的重要途径。本研究利用EST数据库开发紫贻贝的SNP标记,利用QualitySNP软件对紫贻贝已有的19 709条EST序列中含有4条以上同源序列的重叠群进行分析,在含有4条以上同源序列的963个重叠群中,筛选得到候选SNP位点4 833个,SNP的平均频率为129.1 bp,其中C/T和 A/G突变较多,分别占总数的28.8%和27.4%。 根据候选SNP位点设计30组引物,通过等位基因特异性PCR结合溶解曲线分析,在30个野生个体中进行基因分型验证,6组引物(20%)没有扩增产物,10组引物(33%)没有多态性,〖JP2〗14组(47%)引物具有二等位基因多态性,稀有等位基因的频率为0.083~〖JP〗0.446,观测杂合度和期望杂合度的范围分别为0.166 7~0.615 4和0.155 4~0.503 2。序列比对结果显示,14组引物中的12个SNP位点位于基因编码区,并且全部为同义突变。研究结果表明,EST数据库中存在大量的SNP位点,差异熔解曲线法是一种高效便捷的SNP分型方法,所筛选的SNP标记可用于紫贻贝遗传学分析。     

四引物扩增受阻突变体系PCR技术在中国明对虾SNP基因分型中的研究

采用四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer ARMS-PCR)技术,对中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)的80个单核苷酸多态性位点(Single Nucleotide Polymorphisms,SNPs)进行验证.结果表明,通过优化PCR反应条件、调整内外引物浓度和采取To...     

Single Nucleotide Polymorphisms in the Leptin‐a Gene and Associations with Growth Traits in the Golden Pompano,Trachinotus blochii

Leptin is a multifunctional protein involved in processes such as body weight (BWT) regulation, food intake, and appetite regulation. In this study, we isolated and cloned the full‐length leptin‐a gene from the golden pompano, Trachinotus blochii. A search for polymorphisms, as well as association analyses between these polymorphisms and 10 growth traits were performed. A total of 10 polymorphisms, consisting of five single nucleotide polymorphisms (SNPs) in intron 1 (C203T, G252A, C380G, G383C, and G587A), one mutation in exon 2 (T775A), one mutation in exon 3 (G1239A), and three SNPs in the 3′‐untranslated region (G1424A, T1653A, and A1654T) were identified and genotyped in 150 individuals. The C203T and C380G polymorphisms, as well as the G1424A and T1653A polymorphisms, showed complete linkage. Association analyses revealed that the T775A polymorphism was significantly associated with BWT, body height (BWH), body length, and overall length (OL), and genotype TT had negative effects on growth traits. Additionally, the SNP G1239A was significantly associated with BWT, BWH, OL, and head length, with the GA genotype showing positive effects on growth traits. The results indicate that polymorphisms in the leptin‐a gene loci can be used as a selection criterion to improve growth traits in golden pompano.     

Universal PCR primers for ribosomal protein gene introns of fish

Human ribosomal protein (RP) gene sequences with respect to intron/exon structures and corresponding cDNA or genomic data of fish species were obtained from the GenBank database. Based on conserved exon sequences, 128 primer pairs for 41 genes were designed for exon-primed intron-crossing (EPIC) polymerase chain reaction (PCR). In reference to the draft genome sequences of the Pacific bluefin tuna (Thunnus orientalis), 12 primer pairs expected to amplify introns of the bluefin tuna with lengths of 500–1000 bp were selected and applied to six distantly related fish species belonging to the Orders Clupeiformes, Tetraodontiformes, Pleuronectiformes, Perciformes, Scorpaeniformes, and Anguilliformes. PCR amplification was observed for at least four species in each primer pair, and all fragments were larger than those expected for intronless amplification. Single fragment amplification was observed for at least seven primer pairs per species. Fragment sizes of the bluefin tuna for nine primer pairs corresponded to those expected from the genomic data. Thus, our primer pairs are potentially applicable to a wide variety of fish species and serve as an initial step for isolating single-copy nuclear DNA sequences.     

基于黄河鲤新品系IGF2b基因SNPs获取体系的建立及在该品系选育中的应用

为了建立鲤 IGF2b (insulin-like growth factor 2)基因全基因组信息 SNPs (single nucleotide polymorphism)的获取体系,并验证该获取体系在黄河鲤新品系选育中运用的适用性,本研究首先对 10个不同鲤品种的 33个鲤个体重测序数据进行分析,整体上了解 IGF2b 基因的单核苷酸位点及其在基因组上的分布情况。然后在基因组 DNA 水平上分段获取 IGF2b 基因的 SNPs 信息,并以不同的鲤品种验证引物的适用性,最后在黄河鲤新品系中检测其应用。研究结果:获得 8 对聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)引物进行分段克隆的结果,并通过直接测序和限制性片段长度多态性来获取相应的 SNPs。经过直接测序,本文对黄河鲤、建鲤、黄河鲤和建鲤的正反交后代进行 PCR 检测发现条带单一,目地片段正确;结合黄河鲤新品系的体重数据,本文又以 IGF2b3#引物检测到一个与体重明显相关的 SNPs,同时检测到一个与该基因表达量相关的另一个 SNPs。本研究的方法能够在该基因全基因组范围内开展鲤分子育种中 SNPs 的检测,并验证发现黄河鲤新品系 IGF2b3#引物 227 号位点处,出现的突变位点使体重降低,且有一处 SNPs 与其表达量有关。这将为其他物种、其他功能基因的多态性分子标记研究提供思路。     

奥利亚罗非鱼线粒体基因组全序列测定与系统进化分析

采用LA-PCR(long amplification polymerase chain reaction)扩增方法获得奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)线粒体基因组全序列.分析表明,序列全长16 632 bp,包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个长度为931 bp的主非编码区.A、T、G、C碱基的组成分别为27.89％、25.50％、15.62％、30.99％.基因排列与罗非鱼属的其他物种一致.13个蛋白质基因除COX1用TGT做起始密码子外,其他均以ATG为起始,终止密码子除COX2、Cyt b、ND4为不完整的T,其余基因均以典型的TAA做终止密码子.22个tRNA的二级结构都具有典型三叶草结构.系统发育分析显示,罗非鱼属与丽鱼科(Cichlidae)其他物种分开,聚为单系群,其中奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼亲缘关系较近,莫桑比克非鱼和罗非鱼KM-2006亲缘关系较近.本研究旨在为进一步利用线粒体基因组分析罗非鱼群体遗传多样性、亲缘关系以及丽鱼科系统进化提供基础依据.     

基于正交试验设计优化三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系

相关序列扩增多态性（sequence related amplified polymorphism,SRAP）是一种多态性高的新型分子标记,其扩增结果稳定,容易操作和引物通用性高,在遗传多样性分析、种质鉴定和遗传图谱构建等方面的广泛应用逐渐从植物转移到水产动物中。为了建立三疣梭子蟹（Portunus trituberculatus）SRAP技术体系,文章利用正交设计L16（45）对三疣梭子蟹SRAP-PCR反应体系的5因素[TaqDNA聚合酶、镁离子（Mg2＋）、模板、三磷酸脱氧核苷（dNTPs）和引物]在4个水平上进行优化试验,结果得出各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为模板（纯度1.75~1.90,质量浓度10~70ng.μL-1）,Mg2＋（1.60~2.00mmol.L-1）,dNTPs（0.10~0.40mmol.L-1）,TaqDNA聚合酶（0.50~2.00U）和引物（0.10~0.40μmol.L-1）;筛选出各反应因素的最佳水平,建立三疣梭子蟹SRAP-PCR反应的最佳体系（25μL）为TaqDNA聚合酶0.50U,Mg2＋2.20mmol.L-1,模板DNA10ng,dNTPs0.20mmol.L-1,引物0.20μmol.L-1。这一优化体系可望在三疣梭子蟹遗传多样性和性别连锁标记等研究中应用。     

中华绒螯蟹肌肉抑制素基因(MSTN)同义突变对基因转录和翻译效率的影响

为分析同义突变对基因转录和翻译的影响,实验应用定点突变、体外转录和过表达等技术对中华绒螯蟹肌肉抑制素基因(Es-MSTN)中发现的5个SNP同义突变位点即SNP1(C/T)、SNP2(C/T)、SNP3(C/T)、SNP4(A/G)和SNP5(T/G),及其对应的12种基因型组合(CG、TA、1T、2T、3T、4A、5T、1C、2C、3C、4G和5G)进行了转录和翻译水平的研究。结果显示,12种基因型在体外转录中存在转录效率差异,1C基因型的转录水平最高,而CG和TA基因型的转录水平最低,差异显著;且TA基因型转录水平显著高于CG基因型。对上述基因型在293T细胞中进行过表达研究发现,不同突变基因型在转染后的不同时间(24、36、48、60、72、84、96和108 h)的表达强度存在显著差异,且TA突变基因型的表达强度显著高于CG突变基因型。研究表明,5个同义突变位点对中华绒螯蟹Es-MSTN的转录和翻译具有重要影响,同义突变也可能具有较为重要的生物学意义。