高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的变异分析

从天津和内蒙古猪场中分离到2株高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(TJ和NM1),将TJ株经Marc-145细胞连续传代92代,得到致弱疫苗株TJM株。采用RT-PCR方法扩增TJ、NM1和TJM完整的ORF5基因片段,进行序列测定,并与其他国内外毒株的ORF5基因序列进行了比较和变异分析。结果表明:TJ株和NM1株ORF5基因与国内分离的高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)具有较高的同源性,均为99.5%~99.8%,与欧洲型PRRSV同源性最低,分别为63.3%和63.5%。致弱疫苗株TJM与其原始毒株TJ相比有4个氨基酸发生突变(F23S,G80V,R151K,Q196R),这些突变可能与TJ株毒力的降低有关。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒NX-1株ORF5,ORF7基因的克隆

为了从分子水平了解猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)ORF5和ORF7基因的特征,并为PRRSV的遗传进化和分子变异研究提供资料。对宁夏地区流行的PRRSV进行采样分析,运用RT-PCR技术分别扩增了PRRSV NX-1/2008毒株囊膜蛋白基因ORF5与衣壳蛋白基因ORF7,并对其进行了克隆,随后利用DNAS-TAR生物软件进行了同源性比对和进化分析。结果显示,PRRSV NX-1/2008毒株的ORF5,ORF7基因均与JXa-1/2007等高致病性毒株高度同源,ORF7的氨基酸同源性则达到了100%。与空间距离较远的JXa-1/2007毒株相比,NX-1株的ORF5基因在中和抗体决定区196位上发生突变,而与相距较近的HUB-1/2006,CH-1 a/2001等毒株相比较,则无此突变;与CH-1 a/2001毒株相比,GP5蛋白的免疫原性核心位点B 39位的F→I,在诱导中和抗体起重要作用的33位糖基化位点N→S,同时,诱骗位点A(30~38氨基酸)的32,33和35位氨基酸都发生了突变。NX-1株的ORF7基因与国内CH-1 a/2001等低致病性毒株间的突变有69%位于抗原决定区,而其中有56%是高致病性毒株的主动突变。研究表明,分离的PRRSV高致病性毒株与低致病性毒株的抗原性在基因组上有较大范围的变异,且这种变异可能还主要位于免疫决定区。     

公猪精液PRRSV变异株检测及NSP2、ORF5基因序列分析

用荧光RT-PCR方法从某猪场精液中检测到猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)变异株(NSP2 1 594～1 680 bp缺失)核酸阳性.提取1份阳性样品病毒核酸测定和分析其NSP2和OBF5全基因序列,结果表明NSP2基因由950个氨基酸组成,与CH-1a、VR-2332等经典PRRSV相比481位缺失1个氨基酸、532～560位连续缺失29个氨基酸,与JXA1、HUN4等毒株具有相同的缺失特性;ORF5基因第13、151位为具有强毒特性的精氨酸(R),存在4个潜在的糖基化位点,分别位于30～32、35～37、44～46和51～53位氨基酸.遗传进化分析表明,测定序列与JX-A1、HUN4等毒株关系最近,与CH-1a、NVSL等同属一个大分支,而与BJ-4、P129、RespPRRS MLV、VR-2332等处于不同分支.研究证实公猪精液可携带PRRSV变异株,因此猪场(群)在人工授精和引进精液时必须强化检疫和生物安全措施.     

中国部分地区2005－2007年猪繁殖与呼吸综合征病毒分离株ORF5基因和Nsp2基因遗传变异分析

 【目的】为分析2005－2007年间中国部分省区猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）流行毒株的分子生物学特征,了解其遗传演化规律,查明中国目前PRRSV流行毒株现状。【方法】应用病毒分离方法从中国4个省份在2005－2007年间采集的81份疑似蓝耳病病料中分离到36株猪繁殖与呼吸综合征病毒,应用RT-PCR方法对36株PRRSV现地分离株的ORF5基因和Nsp2基因进行扩增和序列分析。【结果】36株现地分离株均属于美洲型 PRRSV,ORF5基因全长均为603 bp,未发现有基因缺失或插入,编码约200个氨基酸,分离株推导氨基酸序列变异主要发生在9～39位;36个分离株中有15株PRRSV Nsp2基因全长为2 940 bp,21株PRRSV Nsp2基因全长为2 850 bp;发生Nsp2缺失的PRRSV在Nsp2基因第481位、532～560位发生了不连续缺失,共缺失30个氨基酸。与GeneBank中收录的14个PRRSV ORF5、Nsp2基因进行核苷酸及氨基酸序列比较和分析,系统进化关系显示,除B02-2005株可能与疫苗株有关外,多数现地分离株与Ch-1a株遗传距离较近,不同年份分离到的毒株与早期PRRSV分离株的同源性逐年降低。【结论】根据氨基酸变异情况对PRRSV现地分离株进行亚群聚类分析,发现36株现地分离株分别归属于以VR-2332为代表的4亚群,以BJ-4为代表的1亚群和以Ch-1a为代表的２亚群。进化关系表明PRRSV ORF5、Nsp2基因及其推导的氨基酸序列均发生了较大变异,不同地区PRRSV分离株的遗传关系存在交叉现象,地域特征不明显。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒YA株ORF5基因的克隆与序列分析

以猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）YA株为材料，采用RT－PCR扩增其ORF5基因全长cDNA并进行序列测定和比较分析。结果YA株ORF5基因cDNA编码区长603bp，可编码200个氨基酸残基。与欧洲型代表株LV株、美洲型代表株VR－2332株在氨基酸水平上的同尖性分别为58％和90％，与国内首株分离株(CH－1a)的同源性高达95％，推测YA株属于美洲型。根据YA株ORF5基因编码的氨基酸序列，与具有代表性的12株美洲型毒株和2株欧洲型毒株绘制进化系统树，结果也显示YA株与美洲型分离毒株的遗传关系较近，而与欧洲毒株的遗传关系较远。进一步采用序列分析软件对推导的氨基酸进行比较分析，发现YA株ORF5编码的E蛋白存在5个潜在的N－糖基化位点，6个抗原位点，其糖基化位点的数目及抗原位点的分布与其它美洲毒株均存在一定程度的差异，但3个最主要的抗原表位相对保守。     

猪繁殖与呼吸综合症病毒分离株ORF5和Nsp2基因的序列分析

根据美洲型猪繁殖与呼吸综合症病毒(PRRSV)基因组序列设计2对引物,对疑似PRRSV感染猪的病料进行RT-PCR检测,核酸检测阳性病料进行PRRSV分离,获得了1株美洲型PRRSV,命名为GD08-2.对PRRSV GD08-2株、GD-XH株、GD08-1株的ORF5基因和部分Nsp2基因进行序列测定与分析.结果表明,GD08-2株的ORF5基因与PRRSV疫苗株pMLV、经典株VR-2332和GD-XH株的相似性较高,而与GD08-1株的相似性较低.GD08-2株的Nsp2基因推导的氨基酸序列出现12个氨基酸的不连续缺失,分别位于66~74位和192~194位,由此推测,GD08-2株可能为PRRSV的突变株.GD08-1株的ORF5基因与国内分离的高致病性PRRSV相似性较高,其Nsp2基因推导的氨基酸序列存在30个氨基酸的缺失,与国内高致病性PRRSV分离株JXA1的缺失位置完全一致,由此推测,GD08-1株属于高致病性PRRSV;GD-XH株的ORF5基因与疫苗株pMLV的相似性较高,其Nsp2基因存在个别核苷酸的点缺失.遗传进化分析表明,GD08-1株与国内分离的高致病性PRRSV的遗传进化关系较近,属同一分支;GD-XH株和GD08-2株与PRRSV经典株VR-2332、疫苗株pMLV的遗传关系较近,属另一分支.     

新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及Nsp2和ORF5基因遗传变异分析

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的变异特征,利用RT-PCR、ORF5和部分NSP2基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒.分离的病毒株被鉴定为PRRSV美洲型,命名为XJ-Q株.该株病毒与香港分离株HK13亲缘关系最近,与国内变异株(HUB1和JXA1)同源性较为亲近.与美洲型标准毒株VR-2332相比,该分离株在481位和532～560位共有30个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV变异株相比,在487～489位有3个氨基酸的独特缺失.结果表明,新疆分离株为PRRSV美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒贵州流行株ORF5序列变异分析

通过RT-PCR扩增9株贵州省PRRSV流行毒株的ORF5基因,并将其连接到pMD18-T载体进行克隆测序得到目的基因序列.参考国内外毒株,分析其变异特点.结果表明,9株PRRSV贵州流行株都属于美洲型毒株,其ORF5序列之间同源性为99.5%~100.0%.以GZCJ株为贵州省代表毒株,与美洲型参考毒株之间的同源性为89.7%~98.7%,与近年流行的毒株遗传距离较近,与早期流行毒株遗传距离较远,其发生了大量点突变.     

新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒分离鉴定及Nsp2和ORF5基因遗传变异分析

为探索新疆猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的变异特征,利用RT-PCR、ORF5 和部分NSP2 基因序列进行分析,鉴定从新疆某猪场疑似猪高热病死亡猪肺脏分离出的一株病毒。分离的病毒株被鉴定为PRRSV 美洲型,命名为XJ-Q 株。该株病毒与香港分离株HK13 亲缘关系最近,与国内变异株（HUB1 和JXA1）同源性较为亲近。与美洲型标准毒株VR-2332 相比,该分离株在481 位和532~560 位共有30 个氨基酸缺失;与国内分离的PRRSV 变异株相比,在487~489 位有3 个氨基酸的独特缺失。结果表明,新疆分离株为PRRSV 美洲型,属于新缺失的PRRSV毒株。     

猪繁殖与呼吸综合征流行株ORF5基因遗传变异分析

[目的]分析猪繁殖与呼吸综合症（PRRS）发病原因、流行趋势,为预防和控制PRRSV提供理论依据。[方法]根据GenBank上的猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）ATCCVR-2332的全基因序列,设计并合成引物,采用RT—PCR技术扩增了7株流行株（HIJ10,HL148,HLJ64,HLJ76,HL177,HLJ85,HLJ87）中的ORF5基因序列。应用DNAStar软件分析所测序列,并与ATCCVR-2332、CH-1a、BJ-4、LV及疫苗株MLV进行序列比较。同时用系统进化树分析了分离株之间的亲缘关系。[结果]核苷酸序列分析表明这7株流行株中ORF5基因与VR-2332、CH—1a、BJ-4等代表株的同源性分别为88．1％～98．8％,89．9％～95．2％,85．6％～98．7％;与LV的同源性为54．7％～56．9％。氨基酸序列分析表明这7株流行株与VR-2332、CH-1a、BJ4等代表株的同源性分别为88．1％～96．8％,88．1％～94．5％,86．1％～96．5％;与LV的同源性为54．7％～56．2％。通过系统发育进化树分析可知HLJ48、HL164、HLU6、HLJ77、HLJ85与CH-1株亲缘关系密切,同属一亚群,表明所获得的毒株与参考株CH．1亲缘关系较近,可能由CH-1演化而来。HLJ10、HU87与疫苗株MLV关系较近,而且HLJ10、HLJ87的同源性高达100％,可能由于使用疫苗而感染,说明黑龙江省存在疫苗毒的隐性感染。[结论]流行株在ORF,基因区域的变异较大,同一地域分离株间ORF,基因序列同源性较高且亲缘关系较近,不同地域则较远。     

一株猪繁殖与呼吸综合征病毒的分离及ORF5基因序列与国内外毒株的分析和比较

分析一株猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV) ORF5基因遗传变异情况及与国内外其他毒株比较为指导当地生产提供一定依据,通过常规病毒检测和分离方法,从2008年山东无名高热病猪送检样品肺部组织中检测并分离PRRSV.根据PRRSV美洲经典株VR-2332的ORF5基因设计特异引物,利用RT-PCR和基因克隆ORF5基因,分析其与国内外PRRSV毒株差异.经过细胞病变和间接免疫荧光检测证明所分离到的PRRSV是一山东地方流行毒株,命名为SD-4.通过分析ORF5基因序列及与其它毒株的比较,将北美洲株分为Ⅰ亚群和Ⅱ亚群.SD-4的核苷酸与Ⅰ亚群和Ⅱ亚群及欧洲毒株相比同源性分别为87.4 %～89.9 %,92.7 %～99.2 %和63.7 %～63.8 %.其氨基酸序列的同源性相比分别为85.1 %～91.0 %,90.5 %～99.5 %和56.7 %～57.7 %.进化树分析结果表明SD-4与高致病性毒株JXA1,HUB1,HEB1和SY0608的亲缘关系很近.PRRSV山东分离株SD-4属于美洲经典毒株,可能为高致病性PRRSV毒株.     

新疆南疆猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因克隆与序列分析

[目的]掌握新疆南疆PRRSV流行毒株特点,为新疆南疆PRRS的有效预防和控制提供理论依据.[方法]研究利用克隆和测序获得了8个新疆南疆PRRSV ORF5基因全序列,并进行序列分析.[结果]8个新疆南疆PRRSV ORF5基因长度均为603 bp,它们之间核苷酸同源性为87.4; ～ 100.0;;与欧洲型代表株LV、美洲型代表株ATCC VR-2332、中国代表株CH-1a和中国HP-PRRS代表株JXA1核苷酸同源性分别为60.9;～63.5;、88.4;～ 89.9;、88.9; ～ 94.7;和87.4;～98.7;;与中国猪养殖场常用的几种弱毒疫苗株核苷酸同源性为87.4;～94.7;;与美洲型毒株和欧洲型毒株氨基酸同源性为84.5;～98.0;和50.0;～59.5;.[结论]研究的8株新疆南疆PRRSV株均属于美洲型亚群Ⅱ毒株.利用新疆南疆PRRSV分子流行病学调查结论,可为新疆南疆PRRS防制疫苗的选择等做迸一步的调整或指导奠定基础.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF7基因变异分析

采用RT—PCR方法对疑似PRRS阳性病料进行克隆和测序获得了0RF7基因片段。序列分析结果表明获得的0RF7基因序列不存在缺失现象。与美洲型代表毒株VR-2332的核苷酸序列的同源性为91．3％,氨基酸同源性为92．6％;与我国最早的PRRSV分离株CH—la相比,核苷酸同源性为93．5％,氨基酸同源性为92．6％;与我国高致病性PRRSV毒株SD—ZQ的核苷酸同源性最高为98．1％,氨基酸只有两个不同,同源性为98．3％;与本省的Hn-1／06毒株的核苷酸同源性为97．3％,氨基酸同源性为97．5％;与2004年分离的FJ-2株与ORF7基因的核苷酸差异稍大为85．4％,氨基酸同源性为88．6％;与欧洲型分离株LV株和N-34株0RF7基因的核苷酸差异很大,同源性仅为41．1％和40％,氨基酸同源性为47．1％和47．6％。表明所获得序列的流行毒株属于美洲型,但其毒力已发生了变异。     

PRRSV辽宁分离株ORF3基因的克隆与序列分析

以辽宁地区某猪场猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)病料为材料,采用RT-PCR方法特异性扩增编码猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)GP3蛋白的ORF3基因全长cDNA,结果该分离株ORF3基因cDNA编码区长765bp,可编码254个氨基酸残基,与美洲型代表株VR-2332和欧洲型代表株LV进行同源性比较,氨基酸同源性分别为87.8%和54.5%,因此推测辽宁分离株属于美洲型。     

Attenuation of Virulent Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Strain CH-1a and Genetic Variation of ORF5 Gene

To develop a modified live vaccine (MLV) against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), virulent CH-1a strain was attenuated by serial passages up to 130 passage (P130) in Marc-145 cells. The virulence and immune efficacy of the attenuated CH-1a were evaluated in pigs. The results showed that animals inoculated with P130 did not develop any clinical sign of the disease, but produced rapid and effective humoral immune responses against PRRSV challenge, indicating that attenuated CH-1a P130 is the candidate as the effective vaccine against PRRSV. To define the potential mutations in the attenuated CH-1a genome, we sequenced and analyzed the ORF5 gene of CH-1a strain of different passages (P39, P55, P65, P70, P85, P100, P115, P120, P125, and P130) and found that three mutations (C5Y, H38Q and L146Q) which may be related with the attenuation of CH-1a. In addition, we also found a unique restriction enzyme site (TspEI) in the ORF5 gene of attenuated CH-1a, which can be used as a genetic marker to distinguish original and attenuated CH-1a.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2株ORF7基因的克隆、序列分析及原核表达

[目的]对猪繁殖与呼吸综合征病毒HBKM2毒株核蛋白编码基因ORF7进行研究,为进一步了解其编码蛋白的功能和研制新的血清学诊断方法奠定基础。[方法]采用RT—PCR方法扩增HBKM2株的DR胛基因,然后利用DNAStar软件包对克隆的序列进行序列分析,将ORF7基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX—KG上,构建重组表达质粒pKG—N。将重组质粒转化到大肠杆菌B121。并经IPTG诱导表达,最后利用Western-blot对表达蛋白的免疫反应活性进行鉴定。[结果]HBKM2毒株的0R刀基因长约372bp;序列分析表明与高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒的同源性达99％以上;SDS—PAGE表明克隆的0R几基因在大肠杆菌中获得了高效融合表达：Western-blot分析表明,重组蛋白GST—N能够与PRRSV高免猪血清发生特异性的免疫反应。[结论]成功地扩增了ORF7基因。且GST-N融合蛋白能在大肠杆菌中高效表达。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的克隆与原核表达

采用RT-PCR方法扩增了猪繁殖与呼吸综合征病毒临床分离株(HBKM2)的ORF5全基因,并进行了测序分析,根据0RF5的结构特点,进一步扩增了截去N端信号肽序列的ORF5(nsORF5),并将其克隆到pGEX-KG原核表达载体,构建了重组质粒pKG-ns5,经酶切和测序鉴定后,转化到大肠杆菌BL21(DE3)进行IPTG诱导表达,经SDS-PAGE和Western-blot分析表明,克隆的nsORF5基因与谷胱甘肽转移酶(GST)基因获得了高效融合表达,表达的融合蛋白GST-nsGP5分子量约为43kD,并具有反应活性,这为进一步研究PRRSV GP5蛋白的功能及新型疫苗、血清学诊断方法的研制奠定了基础.