犬瘟热病毒RT-LAMP检测方法的建立及初步应用

环介导等温基因扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)是一种特异、灵敏、快速的检测方法。为提高犬瘟热病毒(CDV)检测效率、降低检测成本,针对犬瘟热病毒N基因保守区的8个位点设计了6条引物进行RT-LAMP一步法扩增。对反应体系及条件优化,检测特异性、敏感性,扩增产物通过凝胶电泳、显色反应和浑浊度比较进行判定。试验结果表明,该方法特异性强、敏感度高,操作简便、快速、便于观察,适用于门诊和现场检测。     

非洲猪瘟病毒环介导等温扩增快速检测方法的建立

本试验利用环介导等温扩增技术（LAMP）建立了一种快速高效检测非洲猪瘟病毒的方法。整个反应在水浴锅中恒温进行,不需要其他昂贵仪器,30 min即可得到阳性结果,灵敏度是OIE标准PCR方法的100倍,并且与其他常见猪DNA病毒无交叉反应。该方法非常适合在野外现场或缺乏试验条件的边远地区检测非洲猪瘟病毒。     

猪巨细胞病毒环介导等温扩增方法的建立

根据GenBank已登录的猪巨细胞病毒(Porcine cytomegalovirus,PCMV)gB基因的DNA序列设计合成4对特异性引物,通过优化反应条件,以及敏感性、特异性检测,建立了猪巨细胞病毒的环介导等温扩增检测方法(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP);用建立的检测方法对2013年来自四川省雅安、成都、绵阳、眉山、乐山、德阳、遂宁、资阳等市的136份病料进行猪巨细胞病毒检测,将检测结果与常规PCR方法检测结果进行比对。结果显示,本试验建立的方法检测灵敏度可达10拷贝/μL,是常规PCR的10倍;136份病料用LAMP检测,其中有89份样品为猪巨细胞病毒阳性,其阳性率与常规PCR方法检测的阳性相符率为100%。结果表明,本试验成功建立了PCMV的LAMP检测方法,可用于临床上PCMV感染猪的确诊,对PCMV的快速诊断、综合防控等具有重要意义。     

犬细小病毒环介导等温扩增快速检测方法的初步建立

为建立犬细小病毒(CPV)环介导等温扩增(LAMP)检测方法,实现CPV的早期快速诊断,本研究根据GenBank登录的CPV VP2基因序列,在其序列保守区域设计LAMP引物,利用CPV基因组DNA为模板进行扩增。结果表明:LAMP方法检测灵敏度达到10-1TCID50/mL;并且与其它细小病毒等无特异性扩增,表现出良好的特异性。与PCR技术相比,LAMP法操作更加简单方便,更适合基层和实验室的快速检测。     

环介导等温扩增技术快速检测犬细小病毒方法的建立

旨在建立一种利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测犬细小病毒感染的新方法。根据Gen-Bank中犬细小病毒(CPV)VP2基因序列,设计4条LAMP特异性引物,对反应条件、特异性、敏感性、可视化效果和应用效果进行研究。结果显示,在65℃等温条件下、1h内可完成LAMP扩增过程;病毒的最低检出限量为10-2个TCID50/mL;特异性和可视效果良好;对36份临床标本进行检测,阳性检出率为80.5%(29/36),检出率高于普通PCR 72.2%(26/36)。建立的LAMP检测方法,显示了较高的特异性和敏感性,而且兼具高效、快捷、可视化的优势,为临床检测犬细小病毒感染提供了一种快速简便的新方法。     

弓形虫环介导等温扩增快速检测方法的建立

为了建立弓形虫的快速检测方法,本研究建立了一种灵敏、特异、快速的分子生物学检测方法——环介导等温扩增技术(LAMP)。用10倍系列稀释的DNA样品对该检测方法的灵敏度进行了测试,同时通过对扩增产物做内切酶验证;为证明LAMP技术的特异性,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体进行检测。结果显示:利用LAMP技术成功检测到弓形虫基因区,此方法的灵敏度可达到能检测5个拷贝DNA分子水平,酶切分析结果正确,并且特异性强,对新孢子虫、附红细胞体、瑟氏泰勒虫等病原体检测均为阴性。说明LAMP技术可应用于弓形虫的快速检测。     

猪圆环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立与应用

以猪圆环病毒2型为材料,设计了3对引物,构建了猪圆环病毒2型环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环病毒2型的LAMP检测方法,可以采用琼脂糖凝胶电泳、颜色变化、生成的沉淀等现象判定反应结果,为猪圆环病毒2型的现场快速检测提供了一种更加简便快速的方法,可以满足现场检疫的需要。     

新城疫病毒逆转录环介导等温扩增检测方法的建立

为建立一种新城疫病毒(NDV)的简便、快速、高灵敏度的检测方法,本研究根据NDV融合蛋白基因(F基因)设计合成6条特异性引物,在恒温水浴中进行核酸扩增反应,对反应温度、反应时间以及反应液中Mg2+浓度进行优化,获得最佳反应条件,结果经凝胶电泳分析并在可见光下直接观察.整个RT-LAMP检测用时0.5 h,检测敏感度比RT-PCR高100倍,对禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒和鸡传染性喉气管炎病毒无交叉反应.本研究建立的NDV RT-LAMP检测方法速度快、不需要高精密的仪器,而且具有灵敏度高、特异性强,操作简单等特点,有望在核酸扩增检测方法中取代RT-PCR技术.     

猪圆环2型病毒环介导等温扩增实时检测方法的建立与评价

以猪圆环2型病毒为材料,设计了2对引物,构建了猪圆环2型病毒实时环介导等温扩增（LAMP）检测方法,并进行敏感性和特异性确定。建立的猪圆环2型病毒实时LAMP检测方法,通过应用实时浊度仪可以对猪圆环2型病毒进行快速检测。     

猪细环病毒2型环介导等温扩增检测方法的建立

为了能快速、特异的检测猪细环病毒2型(TTSuV2),本研究针对TTSuV2全基因序列的非编码区域和第1个开放性阅读框前端设计了2对引物,建立了TTSuV2的环介导等温扩增(LAMP)检测方法并对反应成分和条件进行了梯度摸索。试验结果显示,该LAMP检测方法最佳反应条件为64 ℃恒温90 min,可特异性检测TTSuV2,与猪细环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪博卡病毒无交叉反应,病毒最低检出限为100拷贝/μL。结果表明,建立的LAMP方法具有快速、特异且灵敏的特点,可在TTSuV2快速检测方面提供一定的技术支持。     

犬流感病毒RT-LAMP快速检测方法的建立

为了建立一种便捷、灵敏的犬流感病毒(CIV)检测技术,本研究根据CIV相对保守的M片段设计3对特异性引物,建立CIV的RT-LAMP检测方法,对反应体系中的MgSO4、Betaine、Bst DNA PoLymerase、dNTP、引物浓度等分别进行了优化,并进行敏感性和特异性试验。结果表明:所建立的反应体系在恒温水浴锅中作用45min即可得到其特有的阶梯状条带,而且对犬细小病毒、犬瘟病毒和犬副流感病毒的扩增结果均为阴性。该方法对CIV RNA的最小检测限为0.1pg,灵敏性高于一步RT-PCR方法。RT-LAMP和普通RT-PCR方法检测临床样品的符合率为93.02%。该方法为犬流感病毒的临床检测提供了一种简便、实用的方法,为基层检疫提供了方便。     

狂犬病病毒LAMP检测方法的建立及初步应用

针对狂犬病病毒基因Ⅰ型核蛋白保守区设计4条识别靶序列上6个位点的特异性引物,在链置换聚合酶(Bst酶)作用下,60℃恒温1 h内完成扩增。反应特异性强、灵敏度高。扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应或浊度比较进行判定。通过对反应条件的优化,病毒基因的的最低检出量可达到101拷贝数。该方法可用于狂犬病病毒的实验室检测和临床初步诊断。     

快速诊断伪狂犬病毒的LAMP方法的建立

采用LAMP技术建立了一种针对伪狂犬病毒的可视、快速、灵敏、特异的检测方法。应用PrimerExplorerV4软件,根据伪狂犬gE基因的保守序列设计了4条引物,优化了反应体系与反应时间,检测了特异性与灵敏性。发现该方法只需要40 min就能检测出结果,具有良好的特异性,灵敏度为普通PCR的100倍,最低可检测出质量浓度为6.2×10-9mg/L的病毒DNA。该方法的建立为伪狂犬病的快速诊断提供了新的思路。     

布鲁杆菌环介导等温扩增快速检测方法的建立

研究针对布鲁杆菌保守的OMP25基因设计了4条LAMP的特异性引物,通过优化反应条件,建立了布鲁杆菌的LAMP快速检测方法.特异性和敏感性试验结果显示,该方法能够特异地检测布鲁杆菌,其最低检测限为5 copies/μL.扩增产物可通过琼脂糖凝胶电泳、显色反应进行判定.LAMP可以快速、直观、准确地检测布鲁杆菌,是一种适合基层现场应用的检测方法.     

猪圆环病毒2型LAMP检测方法的建立与评价

根据猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)Rep和Cap基因保守区设计2对引物,1对外引物和1对内引物;利用设计的4条引物,在Bst大片段聚合酶的作用下,对PCV2 DNA进行恒温扩增;扩增条件为63℃恒温反应1h;建立了PCV2环媒恒温扩增技术(LAMP)检测方法。对检测方法特异性评价表明,检测方法只能检测PCV2 DNA,对猪圆环病毒1型(Porcine circovirus type 1,PCV1)、猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)及猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies virus,PRV)检测无交叉反应。灵敏度评价表明,该检测方法可以检测到样品中10个拷贝的PCV2 DNA含量。     

环介导等温扩增(LAMP)检测禽脑脊髓炎病毒方法的建立

根据已发表的禽脑脊髓炎病毒的VP2基因序列,设计并合成了6对特异扩增禽脑脊髓炎病毒VP2基因片段的引物,通过条件优化,成功建立了针对禽脑脊髓炎病毒的环介导等温扩增(LAMP)检测法,并测定其特异性和敏感性,对采集的禽临床样品的核酸分别进行了检测.结果表明,该法只检出禽脑脊髓炎病毒.敏感性扩增结果表明,Lamp检测禽脑脊髓炎病毒为100fg的RNA模板.该LAMP方法有简便、快速和特异性高的优点,可用于临床上对禽脑脊髓炎病毒的快速检测.     

猪流行性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立与应用

针对猪流行性腹泻病毒(PEDV)的M基因设计LAMP引物,对反应体系的条件优化并进行特异性及敏感性等试验。结果显示:该方法在60℃下恒温扩增60min,使PEDV的M基因得到了高效率特异性扩增。本试验方法特异性好,与猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRSSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)及猪伪狂犬病病毒(PRV)等无交叉反应,同时也具有较好的灵敏性,最低检测分子拷贝数为1.0×102 copies/μL。反应结束后加入SYBR GreenⅠ在紫外灯下观察颜色变化,结果显示阳性扩增产物呈现绿色荧光。结果表明:该LAMP检测方法特异性强,灵敏度高,操作便捷,适于临床检测PEDV。     

沙门菌LAMP检测方法的建立

建立了一种沙门菌环介导等温扩增(LAMP)检测方法。依据GenBank公布的沙门菌属fimY基因序列,利用Primer Explorer V5软件设计LAMP扩增所需引物,通过LAMP反应条件的优化,建立沙门菌LAMP快速检测方法,并对其特异性和敏感性进行了评价。结果表明,针对fimY基因建立的LAMP方法具有较强的特异性,最低可检出浓度为56×102CFU/mL,灵敏度高于PCR方法 10倍。