黑曲霉木聚糖酶基因xynB在大肠杆菌中的表达及重组木聚糖酶的特性

从黑曲霉(Aspergillus niger) mafic-005中克隆得到木聚糖酶基因xynB。序列分析表明，该基因全长745 bp，含有一个67 bp内含子，编码225个氨基酸，理论分子量为24 kD(GenBank登录号:DQ174549)，与已知黑曲霉xynB基因的同源性均较高。将该基因定向插入大肠杆菌(Escherichia coli )表达载体pET-28a (+)上，并转化E. coli BL21 获得重组菌株。经过IPTG诱导，xynB基因获得特异性表达。经SDS-PAGE分析，重组蛋白分子量约为30 kD。该重组蛋白经镍NTA琼脂糖凝胶FF纯化后达到电泳纯。酶学性质分析表明，重组木聚糖酶最适温度为40 ℃，最适pH值为5.0，在酸性和常温条件下具有良好的稳定性。     

草地螟中肠肉碱-脂酰肉碱转位酶基因(LstiSLC25)的克隆及表达

利用甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)围食膜多克隆抗体免疫筛选草螟(Loxostege sticticalis)中肠cDNA表达文库,得到编码肉碱-脂酰肉碱转位酶(LstiSLC25)基因的全长cDNA克隆.该cDNA克隆全长1 474 bp(GenBank登录号EU924506),开放阅读框长897 bp,编码299个氨基酸,预测分子量和等电点分别为32.1 kD和9.46.序列含有3个典型的溶质运转重复结构,具有溶质运载蛋白家族的典型特征.将该基因与pET30载体重组后,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌(Escherichia coli获得了表达.     

地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达

提取地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)基因组，通过PCR克隆了该菌的β-1，3-1，4．葡聚糖酶基因全长。该基因全长818bp,ORF为732bp,编码243个氨基酸，计算分子量为27.35kD，等电点为8．31。经Blast分析，该序列与短小芽孢杆菌(B．pumilus)同源性最高(99％)，而与基因库中地衣芽孢杆菌的同源性为94％，该基因已被GenBank接受(AY225317)。用BamHI和XhoⅠ双酶切目的片断和表达载体pET-30a( )后相连接，构建重组表达载体pET-lic，并导人大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达。酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在27kD左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达67．34U／mL，是出发菌的60倍，最适温度在50℃左右，最适pH在5～6之间。该工程菌可作为材料构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。     

内生解淀粉芽胞杆菌β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因(bglS)的克隆与表达及酶学特性分析

β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶普遍存在于植物内生芽胞杆菌中,为了探讨其功能,以内生解淀粉芽胞杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)TB2菌株基因组为模板,克隆了β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因(bglS).测序结果表明,该基因的ORF全长732 bp,编码一条243个氨基酸的蛋白,理论分子量约为27.33 kD,等电点约为6.89,其ORF序列已登录GenBank(Accession No.EU368224).Blast同源性分析结果表明,该基因的ORF序列与植物互作生防解淀粉芽胞杆菌(B.amyloliquefaciens FZB42,GenBank Accession No.CP000560)的β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因核苷酸序列的一致性达97.3%,氨基酸序列的一致性达97.1%.将β-1,3-1,4-内切葡聚糖酶基因全长克隆至pUC18载体上,利用基因自身的启动子构建重组表达载体pUC-bglS,并导入大肠杆菌(Escherichia coli)BL21菌株中表达.SDS-PAGE分析表明,BL21::pUC-bglS菌株表达了27 kD左右的蛋白;该酶的最适反应温度为55℃,在50℃以下保温60 min后残余80%以上酶活;最适反应pH为6.2,在pH4.4～6.8 4℃保温30 min残余85%以上的酶活;Ca2+和Fe肛可提高β-1,3-1,4-葡聚糖酶的活性,而Cu2+、Zn2+、Mg2+和Mn2+对其活性具有显著的抑制作用.实验结果为进一步研究植物内生解淀粉芽胞杆菌TB2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶的功能和应用打下了基础.     

草地螟中肠运载蛋白LstiSLC25基因的克隆及表达

利用甜菜夜蛾Spodoptera exigua（Hübner）围食膜多克隆抗体免疫筛选草地螟（Loxostege sticticalis L．）中肠cDNA表达文库,得到编码运载蛋白LstiSLC25的全长cDNA克隆。该cDNA克隆全长1399bp(GenBank登录号EU924506),开放阅读框长897 bp,编码299个氨基酸,预测分子量和等电点分别为32.1kD和9.46。序列含有三个典型的溶质运转重复结构,具有溶质运载蛋白家族的典型特征。将该基因与pET30载体重组后,经IPTG诱导,蛋白在大肠杆菌中获得了表达。     

嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶基因(KerF)的克隆及其在大肠杆菌中的表达

为研究嗜麦芽窄食单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)降解羽毛的机理,本研究克隆了嗜麦芽窄食单胞菌角蛋白酶基因(KerF),并获得其全长基因序列1981 bp,含有1个1743 bp的开放阅读框,编码580个氨基酸(GeneBank登陆号HM590650),将角蛋白酶KerF基因连入表达载体pET28a(+)中,构建重组表达质粒pET28-KerF并转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),获得重组工程菌.采用金属Ni+螯和层析柱对所表达的角蛋白酶进行纯化,获得分子量为50 kD的重组角蛋白酶KerF.该酶的最适温度为50℃,最适pH值为9.0.金属离子Mn2+、Co2+、Mg2+、Ni+、Ba2+、Zn2+、Ca2+、Fe3+及蛋白酶抑制剂二苯基甲基磺酰氟(PFSM)能强烈抑制该酶活性,乙胺四乙酸(EDTA)对该酶活具有促进作用.本研究结果表明,嗜麦芽窄单胞菌角蛋白酶基因在大肠杆菌中获得成功表达,重组角蛋白酶KerF为碱性丝氨酸蛋白酶.     

菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因的克隆与生物信息学分析

菌寄生真菌的几丁质酶有很强的降解几丁质能力,在控制植物病害方面起着重要的作用.为克隆和研究菌寄生真菌黄蓝状菌(Talaromyces flavus)几丁质酶基因(tfchi1),本研究根据真菌几丁质酶基因的保守序列设计扩增基因中间片段的简并引物,采用RT-PCR、3'-RACE及5+-TAIL的方法获得了该基因的DNA和mRNA序列(GenBank:GU361769,GU361770).tfchi1长为2 561 bp,具有6个内含子,长度分别为129、78、68、65、53和59 bp,包含1 194bp的ORF,编码一个由397个氨基酸组成的蛋白.推导的tfchi1氨基酸序列以及蛋白质结构生物信息学分析表明,该蛋白具有典型的几丁质酶催化区保守序列SXGGW和DGXDXDWE,属于糖苷水解酶18家族几丁质酶,与柄篮状菌(Talaromyces stipitatus ATCC 10500)几丁质酶(XP_002480365)氨基酸序列同源性为96％,分子量为43.47kD,等电点为4.97.该蛋白无信号肽序列,有15个潜在的N-糖基化位点,Tfchi1的二级结构以无规卷曲和α-螺旋为蛋白的主要结构元件,三级结构中有(α/β)8的圆桶形结构.tfchi1转化毕赤酵母(Pichia pastoris )GS 115,酵母工程菌可分泌具几丁质酶活性的表达产物,重组蛋白的分子量与理论值相符.结果说明,本研究已从T.flavus中正确克隆了1个糖苷水解酶18家族几丁质酶基因.     

嗜水气单胞菌丝氨酸羟甲基转移酶基因的克隆及酶学分析

以嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）基因组DNA为模板,通过PCR方法首次克隆了该菌的丝氨酸羟甲基转移酶基因（glyA）。将该基因插入到表达载体pGEX-6p-1中,转化大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α,获得含有重组质粒pGEX-glyA的重组菌株。核苷酸序列测定表明该基因（GenBank登录号：FJ797607）全长1254bp,编码417个氨基酸。重组菌株IPTG诱导表达后,经过GST-tag亲和层析纯化,得到约45kD的目的蛋白。对纯化的丝氨酸羟甲基转移酶进行酶学性质分析表明,该酶的最适反应为pH8.0,最适反应温度为20℃,Cu^2＋和Mn^2＋对该酶有激活作用,而Zn2＋和SDS对该酶有抑制作用。由于该酶的最适反应温度是20℃,使得它在工业上具有一定的应用价值,同时有助于对低温酶机制的研究。     

蜡样芽胞杆菌M22Mn-SOD基因的分子改造及在毕赤酵母中的表达

根据毕赤酵母(Pichia pastons)密码子的偏好性,以氨基酸序列不变为原则,对源于蜡样芽胞杆菌(Bacillus cernes)M22的Mn-SOD基因进行分子改造,设计、合成了新的基因序列Mn-SOD-2.构建酵母表达载体pPICZαA/Mn-SOD-2,并整合至毕赤酵母GS115染色体.结果表明,所构建的重组体经0.5%甲醇诱导表达后,Native-PAGE检测证实有清晰单一活性条带;SDS-PAGE检测证实重组蛋白的分子量24 kD.酶活分析表明,外源蛋白的活性较改造前增加了2.2倍,且表达稳定性良好.     

人肥胖基因在大肠杆菌中的表达及生物学活性检测

肥胖基因(ob)编码的瘦蛋白可以反映机体脂肪含量信息,在发育、繁殖、造血及体重调节等方面具有重要功能。利用PCR方法扩增去除信号肽的人肥胖基因cDNA序列,并将位于基因5!端的CCC转变为大肠杆菌(Escherichiacoli)常用密码子CCG,扩增片段经测序证实后,克隆到原核表达载体pET5a,重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.1mmol/LIPTG诱导,获得分子量约为16kD的特异蛋白表达带,表达量最高占菌体蛋白总含量的55%。重组蛋白纯化后,注射昆明白小白鼠,小白鼠体重明显下降,说明纯化的重组蛋白具有生物学活性。     

嗜热子囊菌光孢变种cbh1基因的cDNA克隆及在毕赤酵母的高效表达

以嗜热子囊菌光孢变种(Thermoascus aurantiacus var. levisporus)总RNA为模板，通过RT-PCR克隆出外切纤维二糖水解酶基因cbh1片段，采用RACE方法获得全长cDNA克隆，其全长为1 710 bp，编码一种由457个氨基酸组成的单肽，推导的氨基酸序列中1～19位为信号肽序列，GenBank的登录号为AY840982。将该片段克隆到毕赤酵母(Pichia pastoris)分泌型表达载体pPIC9K上，获得表达重组质粒pPIC9K/cbh1，转化毕赤酵母GS115，所得重组子经PCR验证后进行诱导表达，筛选出一重组子GSp-15,经144 h诱导后，外切纤维二糖水解酶表达量为1.17 mg/mL，产酶活力为20.3 U/mL。     

拟南芥Alpha-dioxygenase2(AtDOX2)在毕赤酵母中的表达、纯化及活性鉴定

为了获得具有生物活性的拟南芥(Arabidopsis thaliana)alpha-dioxygenase2(AtDOX2),将其对应基因AtDOX2编码区克隆到酵母表达载体pPIC9k中,获得重组表达载体pPIC9k-AtDOX2,将线性化的重组载体电击转化入毕赤酵母(Pichia pastoris)表达菌株GS115,经G418筛选、PCR鉴定和甲醇诱导时间优化,获得重组AtDOX2的高效表达菌株GS115/pPIC9k-AtDOX2。SDS-PAGE分析结果显示,0.5%甲醇诱导96h重组蛋白表达量最高,其表达量占胞外总蛋白的15%。重组AtDOX2的表观分子量约为70kD,经Ni-NTA柱亲和层析可获得纯度大于80%的重组蛋白。2,2′-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)(ABTS)法测定结果表明重组蛋白具有过氧化物酶活性,且其活性受Ca2+和Mg2+激活,受EDTA、咪唑和Mn2+抑制;2,4-二硝基苯肼(2,4-DNP)法测定结果显示,重组AtDOX2具有双加氧酶活性,Ca2+对其双加氧酶活性也有激活作用。结果说明利用酵母表达系统获得...     

益母草抗菌蛋白LJAMP2的表达及抗菌活性分析

LJAMP2是一种分离自益母草(Leonurus japonicus Houtt.)种子的非专一性脂转移蛋白类抗菌蛋白.将编码成熟的LJAMP2蛋白的基冈(GenBank Accession No.AY971513)插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pas-toris)表达载体pPIC9K中;重组质粒pPIC9K-LJAMP2经线性化后,用电转化法导入毕赤酵母菌株GS115(his-/mut+)中.转化子用含1.75 mg/mL G418的YPD平板筛选获得多拷贝Mut+转化子.将1%甲醇诱导LJAMP2表达后的发酵液,经进一步浓缩、凝胶过滤脱盐、CM FF阳离子交换色谱和反相HPLC进行纯化,获得纯度90%以上的LJAMP2菌株诱导24 h即有LJAMP2的表达,诱导168 h表达量达到最高;表达的LJAMP2蛋白对黑曲霉(Aspergillus niger)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、镰刀菌(Fusarium graminearum)真菌表现出抑制活性.     

甘蓝SRK激酶结构域编码区分子特性及其与THL1相互作用检测

以甘蓝‘E1’为材料，采用PCR和RT-PCR技术，扩增SRK激酶结构域（记为SRKE1）编码区DNA和cDNA序列，得到片段长度分别为1711bp和1241bp，序列分析表明该序列由五个内含子和六个外显子组成，编码407个氨基酸；构建了SRKE1原核表达质粒pET43.1-SRKE1和真核表达质粒pPIC9K-SRKE1，分别在表达宿主菌大肠杆菌BL21和毕赤酵母GS115中进行表达。用我们表达的THL1与SRKE1孵育，结果显示SRKE1可与THL1结合并形成稳定的复合体。     

在毕赤酵母中利用口蹄疫病毒(FMDV)2A实现dTomato和串联MagaininⅡ基因的共表达

抗菌肽(antibacterial peptides)是生物体内经诱导产生的一种具有生物活性的多肽,是天然免疫的重要组成部分.为了提高抗菌肽的表达量以及很方便地检测抗菌肽的表达情况,本研究利用口蹄疫病毒(Foot-and-mouth disease virus,FMDV) 2A将荧光蛋白dTomato基因和3个串联的MagaininⅡ基因融合到一个开放阅读框中(open reading frame,ORE),融合的基因被置于pPIC9K载体醇氧化酶基因(AOX1)启动子的下游,构建分泌型重组酵母表达载体pPIC9K-dTomato -2A-3M,将线性化的重组酵母表达载体通过电击法转入毕赤酵母(Pichia pastoris )GS115中,经G418筛选和PCR鉴定得到阳性转化子,然后将其转至摇瓶,在30℃、0.5％甲醇的条件下进行诱导表达,连续诱导3d.SDS-PAGE电泳图谱显示,在31 kD(dTomato)和9.5kD(3M)处有蛋白条带出现,在荧光显微镜下观察酵母表达上清发出红色荧光,对大肠杆菌(Escherichia coli)和金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)抑菌试验结果表明,重组抗菌肽串联的MagaininⅡ具有明显的抑菌效果.结果表明,由2A连接的融合基因(荧光蛋白dTomato和串联的MagaininⅡ)在毕赤酵母中成功的进行了表达,FMDV 2A在其C端剪切多聚蛋白,得到dTomato和串联的MagaininⅡ两个独立而有活性的蛋白,为小分子抗菌肽的表达提供一个高效的检测方法.     

草鱼leptin基因的分离鉴定及在巴斯德毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术扩增出草鱼(Ctenopharyngodonidellus)的leptin基因,将leptin基因克隆至真核表达载体pPIC9K,电穿孔转化GS115菌株,经G418筛选和甲醇诱导后,对表达产物进行SDS-PAGE琼脂糖凝胶电泳和Westernblot分析。结果表明,草鱼leptin基因cDNA序列由438个核苷酸组成,编码146个氨基酸组成的多肽(GenBank登陆号AY551335),与鲤鱼(Cyprinuscarpio)leptin基因相比,核苷酸和氨基酸的同源性为99%;与人、猪和鼠相比,核苷酸同源性分别为84%、86%和95%,氯基酸的同源性分别为84%、82%和96%;与河豚(Takifugurubripes)相比,氨基酸具有较大的差异,仅有9%的同源性,表明leptin在物种的进化上具有一定的差异;实现了草鱼leptin基因在毕赤酵母(Pichiapastoris)中的表达,表达蛋白的分子量约为16kD,Westernblot分析表明,表达产物具有一定的免疫学活性。     

里氏木霉RUT-C30内切β-甘露聚糖酶基因在毕赤酵母中的分泌表达

摘要：以里氏木霉（Trichoderma reesei）RNA为模板，采用RT-PCR扩增的方法获得不带自身信号肽man1基因的cDNA片段。构建了重组表达载体pPIC9K-man1，重组质粒SacⅠ线性化后用PEG（聚乙二醇）法导入毕赤酵母Pichia pastoris菌株GS115中，通过PCR和表型鉴定表明man1基因已经整合到毕赤酵母染色体上。经大量筛选，获得高效分泌表达甘露聚糖酶的毕赤酵母工程菌株RMAN23。将此菌株在5L发酵罐中进行高密度发酵，测定酶活最高达470IU /mL，同时对重组甘露聚糖酶的性质进行了初步研究。     

美洲商陆抗病毒蛋白真核表达载体的构建及在毕赤酵母中的表达

摘要：从美洲商陆（Phytolacca americana）叶片中通过异硫氰酸胍法提取出了总RNA,经RT-PCR扩增出缺失突变型抗病毒蛋白PAP基因,将该基因克隆于分泌型真核表达载体pPIC9K,然后导入毕赤酵母(Pachia pastoris )菌株GS115细胞。在甲醇的诱导下,经过酵母高密度发酵进行PAP的表达,经SDS-PAGE分析。结果表明,在培养基上清液中含有一明显的特异性蛋白条带,大小为34 kD,经Western-blotting分析,该蛋白与法国PAP抗血清有特异性反应,体外活性检测表明该蛋白对病毒的侵染性具有高度的抑制性,表明该基因在毕赤酵母GS115中得到了表达。     

弹性蛋白酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

本研究以一株产弹性蛋白酶的铜绿假单胞菌基因组DNA为模板,经PCR扩增得到的弹性蛋白基因,与GenBank中的序列对比发现同源性为99%。将弹性蛋白酶基因连入到表达载体pPIC3.5K中,经过酶切和测序鉴定证实弹性蛋白酶基因已插入到载体启动子下游,成功构建了质粒pPIC3.5K/PAE。将pPIC3.5K/PAE线性化,通过电转化将目的基因转入毕赤酵母KM71中,利用MD培养基筛选到近400个转化子,再经G418抗性的筛选,获得48株含高拷贝的重组毕赤酵母转化子并用PCR和弹性蛋白平板验证。经过甲醇诱导表达得到高表达的重组酵母菌株,酶活为1060U/mL是出发菌株的26倍。本研究成功克隆到铜绿假单胞菌弹性蛋白酶基因,为实现活性弹性蛋白酶的高效表达奠定了基础。     

Enzymatic synthesis and properties of highly branched rice starch amylose and amylopectin cluster

We enzymatically modified rice starch to produce highly branched amylopectin and amylose and analyzed the resulting structural changes. To prepare the highly branched amylopectin cluster (HBAPC), we first treated waxy rice starch with Thermus scotoductus alpha-glucanotransferase (TSalphaGT), followed by treatment with Bacillus stearothermophilus maltogenic amylase (BSMA). Highly branched amylose (HBA) was prepared by incubating amylose with Bacillus subtilis 168 branching enzyme (BBE) and subsequently treating it with BSMA. The molecular weight of TSalphaGT-treated waxy rice starch was reduced from 8.9 x 10(8) to 1.2 x 10(5) Da, indicating that the alpha-1,4 glucosidic linkage of the segment between amylopectin clusters was hydrolyzed. Analysis of the amylopectin cluster side chains revealed that a rearrangement in the side-chain length distribution occurred. Furthermore, HBAPC and HBA were found to contain significant numbers of branched maltooligosaccharide side chains. In short, amylopectin molecules of waxy rice starch were hydrolyzed into amylopectin clusters by TSalphaGT in the enzymatic modification process, and then further branched by transglycosylation using BSMA. HBAPC and HBA showed higher water solubility and stability against retrogradation than amylopectin clusters or branched amylose. The hydrolysis rates of HBAPC and HBA by glucoamylase and alpha-amylase greatly decreased. The k cat/ K m value of glucoamylase acting on the amylopectin cluster was 45.94 s(-1)(mg/mL)(-1) and that for glucoamylase acting on HBAPC was 11.10 s(-1)(mg/mL)(-1), indicating that HBAPC was 4-fold less susceptible to glucoamylase. The k cat/ K m value for HBA was 15.90 s(-1)(mg/mL)(-1), or about three times less than that for branched amylose. The k cat/ K m values of porcine pancreatic alpha-amylase for HBAPC and HBA were 496 and 588 s(-1)(mg/mL)(-1), respectively, indicating that HBA and HBAPC are less susceptible to hydrolysis by glucoamylase and alpha-amylase. HBAPC and HBA show potential as novel glucan polymers with low digestibility and high water solubility.