不同地理株柔嫩艾美耳球虫(E.tenela) 杂交虫株(F1)的培育

通过用单卵囊接种技术培育了山东株(S)和黑龙江株(H),然后将山东株(S)和黑龙江株(H)的柔嫩艾美耳球虫的孢子化卵囊同时喂给雏鸡,收获卵囊,提取基因组DNA,再利用RAPD技术对它们基因组DNA进行分析,分析了19株柔嫩艾美耳球虫卵囊的DNA分子,确定了1株为山东株和黑龙江株的杂交株(F1)。这一研究结果为深入研究球虫的免疫机制奠定了基础。     

鸡柔嫩艾美耳球虫广西株的分离与鉴定

目的建立一种简单、实用的单卵囊分离方法，并对一株广西柔嫩艾美耳球虫进行分离。方法采用电泳制胶槽来制作琼脂块进行球虫单卵囊的分离，单卵囊实验感染9只1日龄雏鸡，感染后收集粪便，用饱和盐水漂浮法进行卵囊检测。纯种卵囊经口感染10只1日龄雏鸡，观测卵囊寄生部位、最短孢子化时间，以及其潜在期和排卵高峰期。结果2只雏鸡粪便中检出卵囊，单卵囊感染成功率为22％。通过对其中一株球虫的研究，根据其卵囊的形状、大小、寄生部位、潜在期、卵囊最短孢子化时间、排卵高峰期等生物特征，鉴定该株球虫为柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）。结论本研究成功建立一种单卵囊分离技术，可作为球虫单卵囊分离的常规方法。     

不同地理株及其杂交株柔嫩艾美耳球虫细胞免疫水平研究

本文首先培育了5个不同虫株柔嫩艾美耳球虫(Emeria tenella):3个不同地理株吉林株[J]、山东株[S]、黑龙江株[H]和2个杂交株F1(山东株×黑龙江株)、F2(F1×吉林株).将300只AA肉鸡鸡雏随机分成6组,每组50只,12日龄时分别用不同株柔嫩艾美耳球虫进行免疫,首免剂量为1 × 104卵囊.24日龄时攻虫,剂量为1×104卵囊.攻虫后10日龄时翼下静脉采血1 mL检测学液中的CD4 ,CD8 的数量,以此判断柔嫩艾美耳球虫的细胞免疫功能,结果证明:杂交株柔嫩艾美耳球虫CD4 ,CD8 的数量远远高于其它组,F2组更高.各组的CD4 ,CD8 的数量依次为F2＞F1＞S＞H＞J. CD4 ,CD8 的数量的比值也不同.即各组的细胞免疫功能不同,从数值上反应出,F2株细胞免疫水平最高,其次是F1,再次是山东株,黑龙江株和吉林株最低.     

不同地理株柔嫩艾美耳球虫对地克珠利敏感性试验

进行了3个不同地理株的柔嫩艾美耳球虫(吉林株、山东株、黑龙江株)对地克珠利饮水剂的敏感性试验.分别给予试验组鸡1×105个孢子化柔嫩艾美耳球虫卵囊,感染后饮水给予地克珠利药物治疗.结果表明,3株球虫的敏感性不同,其敏感顺序为:山东株＞黑龙江株＞吉林株.由此可见,柔嫩艾美耳球虫不同地理株间存在对地克珠利的敏感性差异.     

鸡艾美耳球虫哈尔滨株的分离与鉴定

为研究鸡艾美耳球虫哈尔滨株单一虫种的生物学特性,本研究利用单卵囊分离技术分离了6种鸡艾美耳球虫哈尔滨株,用分离的单卵囊接种雏鸡,同时应用PCR方法对收集的单卵囊分离株进行球虫种类鉴定并进行同源性和系统进化分析.结果显示,分离得到的6株鸡艾美耳球虫分别为柔嫩艾美耳球虫、毒害艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、早熟艾美耳球虫、和缓艾美耳球虫和布氏艾美耳球虫,PCR结果表明单卵囊分离株确为该6种纯株.本研究表明毛细吸管单卵囊分离法简便易行,使接种难度降低,提高了接种成功率,为球虫的分子生物学研究奠定了基础.     

利用单孢子囊接种技术建立鸡柔嫩艾美耳球虫克隆

利用显微操作从柔嫩艾美耳球虫长春株、河北株、山东株(由单卵囊接种建立)挑选出单孢子囊接种于雏鸡,接种成功率为17.8%。传代后提取DNA,用7条随机引物PCR扩增,鉴别RAPD图谱及特异条带,结果获得柔嫩艾美耳球虫长春株2个克隆、河北株2个克隆、山东株1个克隆。     

青岛地区球虫虫株的分离及其鉴定

为获得纯种的球虫虫株,取病料镜检,经过离心,用饱和食盐水漂浮法收集鸡球虫卵囊,培养48h后得到混合的孢子化卵囊.用玻璃纸法进行单卵囊分离,并接种雏鸡,获得两株纯种球虫虫株,试验感染率为20%,经鉴定均为柔嫩艾美耳球虫属虫株.     

鸡柔嫩艾美耳球虫YL株多次传代后的致病性研究

为研究多次传代后的鸡柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)YL株的致病性,分别以不同剂量的36代次柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊感染7日龄雏鸡,通过临床症状、死亡率、血便程度、潜隐期、盲肠病变、平均增重及每克粪便卵囊数(OPG)对其致病性进行评价.结果显示,不同剂量孢子化卵囊感染雏鸡均在感染后3d～4d出现血便,球...     

柔嫩艾美耳球虫广西南宁株的分离及鉴定

利用从南宁市郊养鸡场球虫病鸡粪便中收集的球虫混合种卵囊感染小鸡,再应用单卵囊分离感染技术,从感染鸡盲肠中收集的卵囊分离纯化获得1株纯种球虫,经鸡体传代增殖,对该虫株的卵囊大小和卵形指数、潜在期、排卵高峰期、最短孢子化时间、寄生部位、致病性等指标进行观察和测定。结果测得该虫株卵囊的平均大小为(25.743±1.94126)μm×(21.4±1.85985)μm,平均卵型指数为1.2067±0.07;潜在期为140 h;其排卵囊峰期在第6～9天,最高峰在第7天;最短孢子化时间为19 h;寄生部位在盲肠;对两周龄的艾维茵鸡,当使用5×104的孢子化卵囊感染剂量时死亡率为7.5%。根据这些测定和观察到的指标综合鉴定该分离株球虫为柔嫩艾美耳球虫,并命名为柔嫩艾美耳球虫广西南宁株(Eimeria.tenella-GXNN),该研究结果为进一步研究本地区鸡球虫病的药物治疗和免疫预防等奠定了基础。     

鸡球虫混合种和柔嫩艾美耳球虫分离株对常用抗球虫药的耐药性检测

为了解鸡球虫混合种和柔嫩艾美耳球虫分离株的耐药一致性,验证不同种属球虫耐药性检测方法的可靠性,试验利用抗球虫指数(ACI)、最适抗球虫活性百分率(POAA)、病变计分减少率(RLS)和相对卵囊产量(ROP)4项指标综合评价了田间分离的山东XYP种,以及利用单卵囊分离技术从中分离的艾美耳球虫D1、D2和D3株,分别进行了11种临床常用抗球虫药的耐药性。结果显示:山东XYP种对11种抗球虫药均表现为完全耐药,而从中分离的柔嫩艾美耳球虫D1、D2和D3株对11种抗球虫药呈现出完全不同的耐药性,说明临床分离的鸡球虫对常用的抗球虫药物都存在严重的耐药性,柔嫩艾美耳球虫分离株与其来源混合种的耐药检测结果存在差异,而且不同分离株之间的耐药性综合评价结果也不一致。提示基于单卵囊分离的不同种属鸡球虫药物敏感性检测方法存在局限性,有待进一步完善。     

3种兔球虫ITS-1序列测定与系统发育分析

从河北省兔场分别单卵囊分离孢子化大型艾美耳球虫卵囊、黄艾美耳球虫卵囊及肠艾美耳球虫卵囊,接种无球虫兔后获得纯种卵囊,CTAB法提取孢子化卵囊基因组DNA。利用艾美耳属球虫18SrDNA和5．8SrDNA保守引物,PCR扩增3种兔球虫ITS-1片段,产物纯化后测序。将3种球虫ITS-1测序结果与GenBank发布的兔球虫ITS-1序列进行比对和遗传距离比较,绘制系统发育树。结果表明,大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾美耳球虫河北株分别扩增出424、455、434bp的ITS-1片段。大型艾美耳球虫、黄艾美耳球虫及肠艾关耳球虫河北株与GenBank中发布的同种兔球虫ITS-1序列相似性分别为97．4％、97．9％和96．9％。系统发育树显示兔球虫ITS-1序列形成1个单系群,该单系群根据寄生部位分为2个姊妹群。     

吉林市城区鸡球虫病的流行病学调查

通过对吉林城区具有代表性的鸡场进行鸡球虫病的感染情况调查,采集鸡新鲜粪便,用饱和盐水漂浮法收集卵囊,制片镜检,观察卵囊和孢子化卵囊的形状、颜色,测量卵囊的大小,鉴定出艾美耳属球虫3种,即柔嫩艾美耳球虫、堆型艾美耳球虫、巨型艾美耳球虫,其中柔嫩艾美耳球虫为优势种,其主要侵害鸡的盲肠,导致贫血、消瘦甚至死亡,发病多为15～40日龄的雏鸡,为有效预防鸡球虫病提供参考.     

鸡柔嫩艾美耳球虫西宁株生物学特性研究

为了解柔嫩艾美耳球虫西宁株的生物学特性,采用费勒鹏氏法收集西宁某鸡场鸡粪中的球虫卵囊,经单卵囊收集和繁殖法扩繁柔嫩艾美耳球虫西宁株,并进行了该虫株卵囊形态、卵囊形状指数、孢子化时间、潜隐期和繁殖指数的观察和测定.结果表明,虫株卵囊为长卵圆形,平均大小为20.08 μm×16.55 μm,卵形状指数为1.21,最短孢子化时间为18 h,潜伏期为114 h,每个卵囊的繁殖指数为6.34.以平均增重、病变记分和死亡率为指标进行了该虫株的致病性研究,显示该虫株有致病性,感染组与不感染对照组的体重相比有显著差异(P<0.05),各感染组平均病变记分与不感染对照组的相比,差异极显著(P<0.01).     

鸡巨型艾美耳球虫单卵囊分离及雏鸡扩增试验

采用饱和食盐水漂浮法收集就诊病死球虫阳性鸡小肠中段内容物中的球虫卵囊,恒温培养至孢子化后,用2%琼脂薄板进行球虫单卵囊分离,分别感染7只5日龄雏鸡,对据形态学鉴定为巨型艾美耳球虫的分离株进行2代单卵囊分离和雏鸡感染,取其后代以每只1.0×10⁴个卵囊感染10只10日龄雏鸡进行卵囊扩增,获得大量纯种巨型艾美耳球虫卵囊。结果表明,刀片切割琼脂薄板单卵囊分离法操作简便,单卵囊感染成功率较高,准确率达100%,适用于纯种卵囊的分离与扩增。     

柔嫩艾美耳球虫对禽流感疫苗的免疫增强作用研究

为了研究柔嫩艾美耳球虫对雏鸡免疫禽流感疫苗的免疫增强作用,试验将7日龄AA肉鸡随机分为4组,每组20只,1组试验鸡皮下注射柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,同时免疫禽流感H5亚型灭活疫苗;2组试验鸡皮下注射柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊,同时免疫磷酸盐缓冲液;3组试验鸡皮下注射磷酸盐缓冲液,同时免疫禽流感H5亚型灭活疫苗;4组试验鸡皮下注射磷酸盐缓冲液,同时免疫磷酸盐缓冲液。在免疫后第7,14,21,28天,各组随机取5只鸡采血、称重,采集胸腺、脾脏、法氏囊,计算免疫器官指数,采用血凝抑制试验检测血清中禽流感抗体效价。结果表明:各组试验鸡的平均体重差异不明显,柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊与禽流感灭活疫苗共免疫不会影响试验鸡的日增重;柔嫩艾美耳球虫与禽流感疫苗联合免疫可以促进雏鸡免疫器官的生长发育,提高雏鸡免疫器官指数和禽流感抗体效价。说明柔嫩艾美耳球虫可以调节机体对疫苗的免疫反应,促进雏鸡的体液免疫应答。     

黄艾美耳球虫单卵囊分离及PCR鉴定

为了获得纯种黄艾美耳球虫,从张家口某兔场的兔粪中分离黄艾美耳球虫孢子化卵囊,单卵囊接种无球虫兔,以饱和盐水漂浮法收集子代卵囊,利用CTAB法提取黄艾美耳球虫卵囊基因组DNA,并根据Gen Bank中发表的艾美耳属球虫保守序列设计引物,PCR扩增ITS并测序,设计特异性引物鉴定黄艾美耳球虫。结果表明:黄艾美耳球虫ITS1序列长330 bp,5.8S r DNA序列长157 bp,ITS2序列长522 bp。在黄艾美耳球虫ITS1/2序列高变区设计种特异性引物,与大型艾美耳球虫和肠艾美耳球虫无交叉反应。说明建立的鉴定黄艾美耳球虫的PCR方法灵敏、特异。     

和缓艾美耳球虫保定株的分离鉴定与致病性研究

采用单卵囊分离技术,从河北省保定市暴发球虫病的某鸡场鸡粪便中成功分离出1株和缓艾美耳球虫(Eimeria mitis),并对其生物学特性和致病性进行了研究。该虫株主要寄生于小肠后段,潜隐期为97 h,孢子化时间为22 h,卵囊呈球形,平均大小为15.9μm×14.4μm,卵囊指数为1.10,PCR鉴定为纯种的和缓艾美耳球虫,将其命名为和缓艾美耳球虫保定株。该虫株排卵期为感染后第4～10天,其中第5～6天为高峰期。SPF鸡分别感染5×10~4个、1×10~5和2×10~5个和缓艾美耳球虫保定株孢子化卵囊后,均出现精神不振、排水样粪便等球虫病引起的临床症状,且各组相对增重率分别为78.5%、63.5%和59.3%,明显低于空白对照组,该虫株具有一定的致病性,表现为发病和减重。     

白头翁不同提取物及复方抗鸡柔嫩艾美耳球虫研究

以存活率、相对增重率、盲肠病变记分、卵囊值和抗球虫指数为判定指标,考察白头翁不同提取物及复方对鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊致病性的影响(体外试验)和抗鸡柔嫩艾美耳球虫感染效果(体内试验)。体内、体外试验结果均表明,白头翁不同提取物及复方均能提高相对增重率,降低盲肠病变计分和卵囊值。抗球虫指数(ACI)检测表明,白头翁不同提取物及复方对球虫孢子化卵囊有微弱的抑杀效果,对鸡柔嫩艾美耳球虫感染预防效果较差,不宜作为鸡柔嫩艾美耳球虫病的预防和治疗药物。     

柔嫩艾美耳球虫的分离鉴定与致病性测定

本实验采用单卵囊分离技术分离纯化球虫,并根据其临床病理变化、潜隐期、最短孢子化时间等指标综合判定其为柔嫩艾美耳球虫。用纯化所得球虫卵囊进行致病性试验,结果表明:该柔嫩艾美耳球虫致病力较强,半数致死量为7.52×104个/只。     

堆型艾美耳球虫与柔嫩艾美耳球虫卵囊最短孢子发育时间的测定

将收集到的新排出的堆型艾美耳球虫(E.acervulina)与柔嫩艾美耳球虫(E．tenella)卵囊于29℃静态系统中孢化。以30min为间隔，对卵囊孢子发育的4个阶段在显微镜下进行观察。以1h为间隔，用发育中的卵囊连续接种无球虫鸡，以确定最短孢子发育时间(MST)。对影响孢子发育的外部因素进行了初步探讨。用堆型艾美耳球虫比较不同卵囊浓度，不同悬液深度在卵囊孢化过程中第20h时子孢子形成的卵囊百分率。E.acervulina与E.tenella的MST分别为11b与18b。卵囊浓度和悬液深度与孢子发育时间呈明显反比关系。