微小隐孢子虫TSP3蛋白质的表达与功能

通过对微小隐孢子虫TSP3基因克隆构建原核表达载体,纯化TSP3 His-tag重组蛋白质免疫新西兰家兔,间接ELISA方法检测特异性血清效价并纯化多克隆抗体。纯化TSP3 GST-tag重组蛋白质并与HCT-8细胞进行共孵育,通过Western blot与间接ELISA检测细胞黏附特性。结果表明:成功构建了微小隐孢子虫p ET-TSP3和p GEX-TSP3重组表达质粒,并用亲和层析法成功纯化出较高质量的重组蛋白质。Cp TSP3重组蛋白质具有良好免疫原性,并能与HCT-8细胞黏附。     

恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的原核表达及多克隆抗体的制备

为研究恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)3D7株AP核酸内切酶(AP endonuclease)的功能,通过PCR的方法扩增PF3D7_0305600(292~1 137 bp),构建克隆载体。测序正确后,将该片段插入到pET-28a和p GEX-4T-1,构建重组表达载体p ET-28a-Ae、p GEX-4T-1-Ae。将表达载体转入BL21-Codon Plus表达重组蛋白r-Ae-His和r-Ae-GST,经SDS-PAGE和Western blot鉴定,r-Ae-His免疫家兔制备多克隆抗体,并用ELISA检测抗血清效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明:表达的r-Ae-His分子量约为39 ku,r-Ae-GST分子量约为60 ku。制备的多克隆抗体能够特异性地识别天然蛋白,可用于恶性疟原虫3D7株AP核酸内切酶的后续研究。     

微小隐孢子虫黏蛋白CGD5_2060原核表达及其黏附功能

从微小隐孢子虫c DNA中克隆黏蛋白cgd5_2060基因,并对其蛋白功能相关基序进行预测;构建原核表达载体p ET32a-cgd5_2060,转化至大肠埃希菌Rosetta中,诱导表达并纯化重组蛋白CGD5_2060,制备鼠源多克隆抗体,并通过间接酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)方法测定其抗体效价;将纯化的重组蛋白CGD5_2060及载体对照蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法(Western blotting)与间接ELISA方法检测其细胞黏附特性。结果表明,CGD5_2060蛋白的1~19个氨基酸为信号肽,说明该蛋白是分泌型蛋白。使用PROSITE数据库分析发现:该蛋白含有1个富含苏氨酸的区域TTTTTTKSTTTTTTAVTT,位于510~527个氨基酸处;此外,还有1个与细胞黏附有关的序列RGD(精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸),位于69~71个氨基酸处。上述结果表明,cgd5_2060基因可能与微小隐孢子虫黏附宿主细胞相关。原核表达的重组蛋白CGD5_2060具有良好的免疫原性,获得了较高效价的多克隆抗体。重组蛋白与Caco2细胞共孵育,通过蛋白质印迹法与间接ELISA方法检测发现,CGD5_2060可以与Caco2细胞黏附。本试验为揭示微小隐孢子虫黏附细胞的机制提供了一定的理论基础。     

利用间接荧光抗体技术对微小隐孢子虫Cp16蛋白进行抗原定位

Cp16基因是从核糖体展示文库中筛选的微小隐孢子黏附相关基因,为了确定Cp16蛋白是否是微小隐孢子虫卵囊或子孢子表面抗原,构建了Pet-28 a-Cp16原核表达载体,将其转化至BL21大肠杆菌中进行诱导表达,经纯化获得重组蛋白Cp16。将纯化的重组蛋白免疫BAILB/c小鼠,ELISA方法测定IgG抗体滴度。利用间接荧光抗体技术进行抗原定位的初步研究。结果表明:隐孢子虫卵囊表面及子孢子表面富含Cp16蛋白。     

恶性疟原虫肝素结合蛋白质PF3D7_1104400的原核表达与多克隆抗体的制备

为研究肝素结合蛋白质PF3D7_1104400的功能以及其作为疟疾疫苗候选抗原的可行性,通过PCR方法扩增目的基因,并将其与p ET-28a和p GEX-4T-1表达载体连接构建重组表达质粒。将构建成功的重组表达质粒转化入大肠杆菌BL21-Condon Plus(DE3)-RIPL中诱导表达,利用亲和层析的方法纯化His-tag和GSTtag重组蛋白质。用His-tag重组蛋白质免疫家兔制备多克隆抗体,以该抗体为一抗,利用Western blot检测该抗体的特异性以及PF3D7_1104400蛋白质在虫体内是否表达。结果表明:成功构建重组表达质粒PF3D7_1104400-p ET和PF3D7_1104400-p GEX,诱导表达并纯化出特异性好、纯度高的重组蛋白。制备的多克隆抗体能够特异性识别虫体天然蛋白,PF3D7_1104400蛋白质在恶性疟原虫体内全长表达。     

恶性疟原虫裂殖子新型蛋白质(PF3D7_0811600)的表达纯化及其多克隆抗体的制备

利用大肠杆菌原核表达并纯化恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600,免疫家兔制备特异性多克隆抗体,通过对虫体天然蛋白的识别,分析PF3D7_0811600在虫体内的表达。采用PCR技术从恶性疟原虫3D7株总DNA中获得PF3D7_0811600基因的目的片段,连接到p MD18-T克隆载体,得到的克隆质粒经EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建重组原核表达质粒p ET-PF3D7_0811600和p GEX-PF3D7_0811600,通过优化表达条件,分别在大肠杆菌中得到高效表达,并用亲和层析柱纯化目的蛋白质。用纯化的His标签重组蛋白质免疫家兔,用Western Blot方法检测制备的特异性多克隆抗体。结果表明:成功纯化并获得重组蛋白质,用间接ELISA方法检测多抗效价达到1∶16 000,用Western Blot检测结果表明制备的多克隆抗体具有良好的特异性,能够识别虫体天然蛋白。恶性疟原虫3D7株裂殖子新型蛋白质PF3D7_0811600在虫体晚期表达,说明该蛋白在虫体发育的晚期发挥重要作用,猜测其可能与裂殖子入侵宿主红细胞有关。     

猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒非结构蛋白nsp1α的表达及活性检测

为获得具有活性的猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白1α(nsp1α),以BJ-4PRRSV nsp1α真核表达质粒pc DNA3.1-nsp1α为模板扩增nsp1α,克隆到原核表达载体p ET-28a,1 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导含有重组质粒的大肠杆菌BL21(DE3)。SDS–PAGE结果显示,nsp1α以包涵体形式高效表达,重组蛋白大小约为20 ku;Western blot结果显示,表达的重组蛋白能与小鼠抗His标签单克隆抗体反应;包涵体蛋白复性后,ELISA方法检测结果显示,重组蛋白能与1∶6 400稀释的PRRSV阳性血清反应。表明成功表达了nsp1α蛋白,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

微小隐孢子虫TSP3蛋白的定位分析

通过对微小隐孢子虫TSP3氨基酸序列进行生物信息学分析设计多肽片段,偶联KLH载体蛋白免疫家兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA方法检测血清效价并利用特异性亲和层析的方法纯化抗体。以该抗体作为一抗,利用Western blot检测虫体天然蛋白质在体内的表达情况,通过间接免疫荧光方法进行亚细胞定位分析。结果表明:制备的多克隆抗体能够特异性识别虫体天然蛋白,亚细胞定位发现其位于子孢子以及裂殖子的顶端。     

新城疫病毒xx08株HN蛋白主要抗原区的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立检测新城疫病毒(NDV)抗体的间接ELISA方法,构建了新城疫(ND)xx08株HN基因抗原表位集中区基因片段的重组表达质粒p ET28a-r HN,加入IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定表明,表达的重组蛋白大小约为28 ku。Western blot分析表明,该重组蛋白具有良好的反应性。以纯化的HN蛋白为包被抗原建立检测NDV抗体的间接ELISA方法,优化试验条件后,抗原最适包被浓度为5μg/m L,血清最适稀释比例为1∶80,与HI试验结果符合率较高,且与鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病(IBV)、鸡禽流感病毒(AIV)和鸡马立克氏病毒(MDV)等标准阳性血清无交叉反应。表明建立的间接ELISA方法可以用于临床新城疫抗体的检测。     

大鲵虹彩病毒主要衣壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

根据大鲵虹彩病毒(Chinese giant salamander iridovirus,GSIV)主要衣壳蛋白(Major Capsid Protein,MCP)基因设计引物,PCR扩增得到MCP基因编码框全长序列1 392 bp,将其克隆到原核表达载体p ET-32a中,构建了重组原核表达载体p ET-32a-MCP,并在大肠杆菌BL21中得到了表达,融合表达的重组蛋白分子量约为70 ku,与预期大小一致,主要以包涵体的形式存在。对IPTG浓度,诱导温度等诱导表达条件进行优化,确定0.5 mmol/L的IPTG于37℃的条件下诱导6 h重组蛋白的表达量最佳。纯化GSIVMCP重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备了GSIV-MCP多克隆抗体,ELISA检测抗体效价大于1∶50 000。Western blot检测显示该抗体可以特异性识别重组蛋白。间接荧光免疫结果表明,该多克隆抗体可与由GSIV感染引起细胞病变的EPC细胞(GICB)发生特异性的结合。研究为建立GSIV免疫诊断方法以及为研究GSIV MCP基因编码蛋白的功能奠定了前期基础。     

二斑叶螨几丁质酶基因的原核表达及多克隆抗体制备

以制备的二斑叶螨c DNA为模板,克隆二斑叶螨几丁质酶Se Chi基因功能结构域催化区片段,大小为786 bp。将该序列片段克隆到表达载体p ET-32a(+)中,获得多克隆原核表达载体p ET-32a-Tu Chi。重组质粒经酶切测序鉴定后转化大肠杆菌BL21(DE3),经0.6 mmol·L-1IPTG诱导4 h后高效表达约45 ku可溶性重组蛋白;经His亲和层析洗脱和浓缩获得高纯度的重组蛋白免疫新西兰大白兔制备Tu Chi多克隆抗体。制备的多克隆抗体经Western Blot证实能特异性地识别几丁质酶而不与非特异性蛋白结合。ELISA分析表明制备的抗体效价达1??80 000,效价较高,为进一步研究二斑叶螨几丁质酶相关功能奠定基础。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

猪伪狂犬病毒gB和gC蛋白B细胞表位编码序列的融合表达及活性测定

依据猪伪狂犬病毒g B和g C蛋白的B细胞表位编码序列,分别设计g B和g C蛋白B细胞表位编码序列的融合扩增引物,利用融合PCR技术,将g B和g C蛋白B细胞表位编码序列有机地融合为g B-C表位编码序列。将融合基因片段插入到原核表达载体p ET28a,并转化大肠杆菌BL21(DE3),1.0 mmol/L异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE结果显示,融合蛋白g B-C能够高效表达,重组蛋白的分子质量约为38 ku;经Western blot鉴定分析,小鼠抗His标签单克隆抗体和PRV阳性血清均能识别表达的重组蛋白。表明成功表达了融合蛋白g B-C,且表达的重组蛋白具有较好的免疫学活性。     

水稻矮缩病毒非结构蛋白Pns6和外壳蛋白P8多克隆抗体的制备及其应用

利用RT-PCR的方法从感染水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)的水稻中克隆该病毒的运动蛋白基因S6和外壳蛋白基因S8,通过Gateway系统进行原核表达,获得表达载体p DEST17-Pns6和p DEST17-P8,将表达载体转化E.coli Rosetta,经IPTG诱导表达后获得分子质量约为59和46 ku含HIS标签的融合蛋白.以诱导表达的目的蛋白为抗原,免疫注射新西兰大白兔制备多克隆抗体.结果表明,Western blot检测制备的Pns6和P8抗体可特异性检测RDV,间接ELISA测定Pns6和P8抗体的效价均约为6 400倍,并建立了可靠、灵敏、特异的Dot-blot ELISA方法检测RDV.以上研究表明,RDV运动蛋白和外壳蛋白抗体均可应用于该病毒在田间的大规模调查和检测.     

非洲猪瘟病毒UBCv1的原核表达及多抗制备

[目的]为研究非洲猪瘟病毒(ASFV)泛素结合酶(UBCv1)的生物学功能及致病机制奠定基础.[方法]以p3XFLAG-CMV-7.1-I215L质粒为模板,利用PCR方法扩增非洲猪瘟病毒I215L基因,将其克隆至原核表达载体pET-28a,构建pET-28a-I215L重组质粒,并将其转化大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞,经IPTG诱导表达重组蛋白.重组蛋白经His柱层析纯化后免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,采用ELISA方法检测抗体效价,Western blot检测抗体特异性.[结果]成功构建了重组质粒pET-28a-I215L,重组菌经IPTG诱导后能够可溶性表达重组蛋白,产物约28 kDa,与预测大小一致.用纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备多克隆抗体,ELISA测定抗体效价为1∶7290000;Western blot结果显示抗体具有较好的特异性.[结论]成功表达纯化了ASFV的泛素结合酶并制备其多克隆抗体,为后期解析ASFV泛素结合酶的结构、功能及病毒相关致病机制提供了重要的生物材料.     

木薯钙调蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备

钙调蛋白(CaM)作为重要的抗逆信号转导蛋白,在调控木薯抗逆境和块根采后生理腐烂中起重要作用,为给快速检测木薯在不同生长环境中CaM蛋白的表达水平提供优良抗体,克隆木薯CaM基因并将目的基因插入原核表达载体,经Escherichia coli表达并纯化,用纯化的融合蛋白ACP-CaM免疫Balb/C小鼠,间接ELISA测定小鼠血清效价后,取小鼠脾细胞与SP2/0细胞融合,筛选能产生抗CaM单克隆抗体的杂交瘤细胞株,用Western blot、ELISA等方法对制备的单克隆抗体进行初步鉴定。Western blot分析结果显示原核表达重组质粒在E.coli中能高效表达CaM,免疫小鼠后取效价高的2#小鼠脾细胞和SP2/0细胞融合,共获得7株效价均达到106以上、能稳定分泌抗CaM抗体的细胞株,这7株单抗与淀粉磷酸化酶、His、BSA均无交叉反应,4D5株与标签蛋白ACP有交叉反应,表明其余6株均为CaM特异性抗体;抗体亚型鉴定结果显示7株单抗均为IgG型抗体。     

牛微小隐孢子虫子孢子表面抗原p23基因的克隆及原核表达

从已构建的牛微小隐孢子虫子孢子cDNA文库中,用PCR方法扩增出子孢子表面抗原p23基因,将其插入到编码谷胱肽转移酶(GST)的质粒(pGEX-4T-2)多克隆位点,构建原核表达载体pGEX-p23。重组质粒经EcoRI/Sal I酶切、测序鉴定后转入大肠杆菌BL21中,IPTG诱导表达目的蛋白,SDS-PAGE和Western blot鉴定表达蛋白。结果成功构建了pGEX-p23原核表达载体,经IPTG诱导,转化的大肠杆菌表达出分子质量为47kDa的GST融合蛋白,且该蛋白能与抗p23抗体发生特异性结合反应。本研究为进一步研究p23的生物学功能和临床应用奠定了基础。     

猪瘟E2基因多克隆抗体的制备及其特性分析

以CSFV FJ-1株为模板对猪瘟E2基因的主要抗原表位进行PCR扩增,得到大小为370bp的目的片段,将其连接到pET-32a表达载体,转化BL21后利用IPTG诱导其表达,SDS-PAGE和Western blot分析表明,目的蛋白成功获得表达,大小约33.5ku融合蛋白。利用Ni-NTA agarose纯化蛋白、重组蛋白与弗氏完全佐剂充分乳化后免疫新西兰兔,多克隆抗体效价经间接ELISA检测可高达1∶6400。Western blot结果表明该重组蛋白具有良好的反应原性,试验结果表明已成功获得猪瘟E2基因的多克隆抗体且能识别CSFV FJ-1毒株。     

尼罗罗非鱼Hsc70的原核表达和多克隆抗体制备

通过原核表达系统表达尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,纯化该蛋白并制备其多克隆抗体。对尼罗罗非鱼热休克蛋白进行生物信息学分析,设计特异性引物,扩增出Hsc70基因,通过双酶切与pET-28a构建重组质粒表达载体,并转入大肠埃希菌B21中通过诱导剂IPTG进行原核诱导表达,表达产物用SDS-PAGE鉴定并用镍柱进行纯化。将纯化后的重组蛋白免疫日本大耳兔制备多克隆抗体,用ELISA测定抗体效价,Western blot检测抗体特异性。结果表明,原核表达系统成功表达了尼罗罗非鱼热休克蛋白Hsc70,重组蛋白分子量约为75 ku,主要以包涵体形式表达。经镍柱纯化得到高纯度的Hsc70;该蛋白免疫日本大耳兔获得特异性多克隆抗体,效价为1∶2 048 000;Western blot检测到一条75 ku的特异性条带,表明该抗体能特异性地识别尼罗罗非鱼Hsc70蛋白。尼罗罗非鱼Hsc70蛋白在大肠埃希菌中成功表达,制备的重组蛋白和多克隆抗体为深入研究尼罗罗非鱼Hsc70的功能提供了分子工具。     

牛朊蛋白在COS-7细胞中的表达

为研究重组蛋白pCI-PrP27-30在COS-7细胞中的表达,用pCI-PrP27-30重组表达载体转染COS-7细胞后,经不同浓度的G418筛选后获得稳定的细胞系,然后用间接免疫荧光、间接ELISA和Western blot技术检测目的蛋白的表达。结果表明目的蛋白在COS-7细胞中成功表达。