家蚕5龄第3天血液蛋白的双向电泳及质谱分析

基于为家蚕血液比较蛋白质组学的研究提供基础信息的目的,利用双向电泳技术对家蚕5龄幼虫的血液蛋白进行分析,并采用基质辅助质量飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对其中一些表达量较高的蛋白进行了肽质量指纹图谱分析鉴定。120μg血液蛋白经过双向凝胶电泳及考马斯亮蓝染色后可以检测出106个蛋白点,60μg血液蛋白经双向电泳及银染后可以检测出126个蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子质量15~80 kD区域,等电点4~7。MALD I-TOF MS鉴定的52个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中成功鉴定了46个蛋白点。在这些蛋白中,不仅包含了SP贮存蛋白和30 K低分子量脂蛋白等家蚕血液蛋白的主要成分,还包含了大量与代谢相关的蛋白酶类、蛋白酶抑制剂、离子转运蛋白、免疫相关因子、分子伴侣等不同种类的蛋白。     

家蚕幼虫消化液蛋白质组学分析

为了研究家蚕幼虫消化液的蛋白质组成情况,用双向电泳(2-DE)技术对家蚕幼虫消化液中的蛋白质进行了分离,随后用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对其中的8个高丰度蛋白进行了鉴定,并用生物信息学方法进行了分析。结果显示:家蚕幼虫消化液中的蛋白质种类较少,分子量小,分布集中;在8个鉴定的蛋白点中,1个是30kP蛋白酶A原,5个是类胰蛋白酶,其它2个是碱性丝氨酸蛋白酶。     

家蚕中肠组织蛋白质组学研究

通过高精度的双向电泳技术对家蚕5龄幼虫的中肠组织进行了研究,利用基质辅助质量飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)对表达量较高的蛋白点进行了肽质量指纹图谱分析,并采用GPMAW软件对家蚕基因组预测的蛋白质数据库进行了本地构库,对所得到的肽质量指纹图谱进行了分析。结果发现,家蚕中肠蛋白质经过双向凝胶电泳和图像分析,银染后可以检测出600个以上的蛋白点,这些蛋白点主要集中在分子量15～80 kD区域,等电点3～8.5之间。MALD I-TOF MS鉴定的36个蛋白点中都有较强的肽质量指纹信号峰,其中32个蛋白点得到了成功鉴定,包括原肌球蛋白以及大量的离子转运蛋白、与代谢相关的酶、与信号传导和细胞凋亡相关的蛋白等。这一结果为进一步认识家蚕中肠组织的生理功能提供了基础信息。     

家蚕幼虫正常个体与眠性变化个体大眠蜕皮前后血液蛋白质差异表达分析

家蚕眠性既受染色体上主基因的控制,又受其它伴性成熟基因的调控,还受环境因素的影响。为了探讨环境因素改变家蚕眠性的分子机制,以四眠蚕品种898黄绿、D92黄绿和三眠蚕品种三眠A为材料,通过催青期或小蚕期温度、湿度、营养等因素的调控诱导眠性变化,利用双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF)技术,对这些家蚕正常个体和眠性变化个体大眠蜕皮前后的血液蛋白质表达差异进行分析鉴定。结果共获得转铁蛋白、胰凝乳蛋白酶抑制剂SCI-I、多聚腺苷酸结合蛋白2、27 kD糖蛋白前体、核糖体蛋白L20和线粒体核糖体蛋白L2等13个上调或下调的可能与家蚕眠性相关的差异表达蛋白,为进一步从蛋白质水平深入了解家蚕眠性变化的机制奠定了基础。     

家蚕孤雌生殖差异脂蛋白30K lipoprotein precursor基因的克隆与生物信息学分析

应用二维凝胶电泳(2-DE)技术分离家蚕孤雌生殖蚁蚕总蛋白,并和正常蚁蚕总蛋白进行比较,得到46个可能与家蚕孤雌生殖相关的差异蛋白点。对这些差异蛋白点进行胶内酶解后基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOFMS)分析,经数据库搜索鉴定,确定其中一个差异蛋白点为脂蛋白30K lipoprotein precursor(30K LPP)。通过5′-RACE技术克隆到30KLPP脂蛋白的全长cDNA序列。生物信息学分析显示该差异蛋白基因全长917bp,编码261个氨基酸,理论分子质量为30.013kD,等电点为7.193;结构域和三级结构预测显示该蛋白包含1个Lipoprotein-11结构域和12个β-折叠。预测其信号肽概率为1.000,定位在1~20aa区域,即可能存在信号肽。细胞定位预测显示该蛋白可能分泌到胞外(SP值为0.934)。分析结果有助于进一步研究30KLPP脂蛋白结构与功能的关系。     

家蚕5龄第3天幼虫头部组织蛋白质双向电泳及质谱鉴定

家蚕幼虫头部有单眼、触角、口器、脑等取食和感觉的中心器官及坚硬的外壳。提取家蚕5龄第3天幼虫头部组织蛋白质进行双向电泳,经银染检测到654个蛋白点,这些蛋白的分子质量主要分布在15～97 kD之间,等电点(pI)在4～8之间;在pH 3～4和9～10的区域,也有较多的蛋白质被检测到,但该区域高丰度的蛋白质数量较少。对丰度较高的100个蛋白点进行基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析,有52个蛋白质被鉴定,其中有21个酶类相关的蛋白,占被鉴定总蛋白质数的40.4%,其它蛋白质主要包括表皮蛋白、气味结合相关蛋白、肌肉相关蛋白等。研究结果可为家蚕幼虫头部组织的功能分析提供蛋白质水平的信息数据。     

家蚕孤雌生殖差异蛋白——热休克相关蛋白的生物信息学分析

应用双向凝胶电泳(2-DE)技术研究家蚕孤雌生殖蚁蚕和正常蚁蚕的总蛋白质的差异,得到与孤雌生殖相关的差异蛋白点,并对这些蛋白点进行基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOF MS)分析,获得了相关差异蛋白的序列特征。将这些序列与已构建的家蚕cDNA文库及蛋白质数据库进行比对,得到3个差异蛋白为热休克相关蛋白。通过5-′RACE的方法克隆到3个差异蛋白的全基因序列,并对它们进行结构和特征分析,有助于进一步研究其与孤雌生殖的关系。     

家蚕孤雌生殖相关蛋白PGL的鉴定与生物信息学分析

应用二维凝胶电泳(2DE)技术分离有性生殖蚕卵与孤雌生殖蚕卵的差异蛋白,通过基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-TOFMS)分析获得大量小肽的序列特征。与已构建的家蚕cDNA文库及蛋白质数据库进行比对,确定一个在家蚕孤雌生殖过程中表达量显著上调的差异蛋白为磷脂酰肌醇蛋白聚糖(phosphatidylinositol glycan,PGL)。为了探讨PGL蛋白在家蚕孤雌生殖发生中的作用,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术扩增目的基因5′端片段,获得PGL蛋白基因的全长cDNA,生物信息学分析显示该基因cDNA全长1038bp,编码345个氨基酸,其编码蛋白理论分子质量为39.516kD,等电点为5.845,包含1个保守的GPI8结构域,信号肽概率为0.997,可能为分泌型蛋白,预测蛋白功能域包含酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化、N糖基化、蛋白激酶C磷酸化等多个功能位点。依据PGL蛋白的理化性质、结构功能推测其有可能在不同程度上通过细胞信号转导途径参与了家蚕孤雌生殖发生过程并发挥重要作用。     

不同产丝量家蚕品系后部丝腺的蛋白质组学分析

家蚕幼虫后部丝腺是合成和分泌丝素蛋白的重要器官。为从蛋白质水平探究不同家蚕品系产丝量差异的原因,应用蛋白质组学研究方法,选取3个产丝量有较大差异的家蚕品系Ndx、大造和21-872为材料,通过双向电泳和基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对各品系5龄第5天幼虫后部丝腺表达的差异蛋白进行鉴定,查找与丝蛋白合成相关的蛋白质。结果表明,茧丝突变品系Ndx后部丝腺的蛋白质表达水平与普通丝量品系大造和高丝量品系21-872有差异,差异表达蛋白种类主要为应激反应相关蛋白、能量相关蛋白、蛋白质合成相关蛋白和一些酶类,其中核糖体磷酸化蛋白P0和P2、蛋白质二硫化物异构酶、丝素轻链蛋白Fib-L以及丝素蛋白P25等在Ndx后部丝腺的含量明显低于其它2个品系。推测在茧丝突变品系Ndx的后部丝腺中,上述蛋白质表达量的变化可能是导致其不能正常吐丝结茧的原因。     

家蚕现行品种孤雌生殖的研究

运用温汤处理方法对 16个现行家蚕品种进行了孤雌生殖研究 ,调查了不同品种的孤雌生殖发生率 ,提出了适合现行蚕品种的诱导条件及使处女蛾自然产下较多的未受精卵再进行诱导的方法 ,并且初步选育了几个孤雌生殖系。     

家蚕感染浓核病毒(镇江株)晚期的中肠和血液组织蛋白变化

为了进一步探明家蚕浓核病毒(镇江株)对家蚕的致病机制,通过蛋白质双向电泳技术对家蚕感染浓核病毒晚期的中肠和血液组织蛋白进行了分析。结果表明,感受性蚕品种在感染浓核病毒晚期,其中肠、血液组织蛋白量急剧下降,有近30%的蛋白点消失,其余蛋白点的含量也大幅下调达50%以上。由此说明由于浓核病毒侵染破坏了家蚕中肠上皮组织以及中肠的消化吸收功能,阻断了营养物质的输入,进而极大地减少了蚕体自身组织蛋白的合成。     

家蚕黄血近等基因系差异蛋白组学分析

为了获取与家蚕黄血基因(Y)协同作用的相关蛋白的基础信息,通过双向电泳技术对家蚕黄血近等基因系5龄起蚕黄血个体和白血个体的中肠蛋白进行分离并作图像分析,发现分离出的较为清晰的蛋白点主要集中在14～80kD区域,等电点(pI)4～9。采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)技术对其中一些差异明显的蛋白点进行鉴定,鉴定结果较为可信的5个蛋白点包括参与能量代谢、蛋白质合成等功能蛋白,这些蛋白可能与家蚕黄血性状的形成有关。采用实时定量PCR方法,对质谱鉴定出的质子转移ATP合酶β亚基2编码基因在家蚕黄血近等基因系黄血个体和白血个体5龄不同发育时期的相对表达量进行分析,结果表明该基因在2种个体中的表达均呈现明显上升的趋势,并且在黄血个体中的表达量明显较白血个体高,5龄第1-2天的相对表达量高7倍左右,提示该基因可能与家蚕的黄血性状有关联。     

家蚕雌性附腺分泌蛋白的双向电泳分离及质谱鉴定

采用24 cm的双向电泳可以分离出家蚕雌性附腺分泌的70多种蛋白或多肽,其中有30多个蛋白或多肽的表达量较大。从这些蛋白斑点在凝胶中的分布位置上看,大多数分布在等电点pI 4~7的范围内,主要蛋白的分子量较大。对其中表达量相对较高的33个蛋白点进行胶内酶解后质谱分析,并根据检索到的蛋白质的功能进行分类,最多的是核糖体蛋白家族,占蛋白质总量的30.4%,另外还有2个热休克蛋白。除此之外,还有一些如RNA结合蛋白、转录延长因子等功能性蛋白质。这些蛋白质共同组成了具有特殊物理性质的分泌物。     

家蚕雌性附腺及其分泌物的蛋白质双向电泳分析

家蚕雌性附腺由分泌部和贮存部组成,化蛾前期分泌大量胶状粘液蛋白,产卵时胶状粘液蛋白将蚕卵固定在外界物质上。对雌性附腺分泌部及胶状粘液的蛋白质进行提取,并用双向电泳进行分离和分析,结果表明用裂解缓冲液可以得到丰度较高的蛋白质混合物,利用双向电泳技术可以获得高分辨率、高重复性的蛋白质图谱。     

家蚕雌蚕单性生殖无性繁殖系的配合力研究

运用不完全双列杂交法 ,以经 7～ 8代孤雌生殖选育初步育成的雌蚕单性生殖无性繁殖系及其原两性繁殖系 ,分别与平衡致死雄蚕、常规品种雄蚕配制一代杂种 ,在相同条件下比较各组合的生产性能 ,结果表明许多雌蚕单性生殖无性繁殖系的配合力超过其原系统 ,具有较强的杂种优势。因此 ,若利用雌蚕单性生殖无性繁殖系与平衡致死雄蚕组配杂交种 ,将为降低雄蚕品种的制种成本开辟了一条新的途径     

二化性家蚕卵低温和常温催青的胚胎期蛋白质表达差异分析

家蚕二化性品种的滞育性受上代胚胎期环境条件调控,查找家蚕胚胎期滞育关联蛋白,可为最终阐明家蚕滞育的分子机制提供实验依据。以家蚕二化性品种秋丰的蚕卵为材料,分别在25℃常温和18℃低温条件下催青,提取胚胎不同发育时期蚕卵的易溶性和难溶性蛋白,采用蛋白质双向电泳(2-DE)和图像分析技术,研究蚕卵在胚胎不同发育时期的蛋白质差异表达谱。在易溶性和难溶性蛋白图谱中分别检测到5个和7个差异显著的蛋白点。对这些差异蛋白点进行质谱鉴定,有8个蛋白点得到可信的最佳匹配蛋白报告,共鉴定出卵特异蛋白、卵黄原蛋白、表皮蛋白和丙酮酸脱氢酶激酶4种蛋白。这些差异表达蛋白可能导致蚕卵胚胎中物质代谢和能量代谢的不同,据此推测低温和常温催青可能在蚕卵胚胎中诱导了不同的生理生化反应。