鳜AKT2在传染性脾肾坏死病毒增殖中的作用

【目的】研究鳜AKT2 (ScAKT2)在传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）增殖中的作用,为鳜ISKNV防控提供参考。【方法】克隆ScAKT2基因开放阅读框,构建原核表达载体,进行原核表达及蛋白纯化。用纯化后的ScAKT2重组蛋白免疫日本大耳兔后制备多克隆抗体,用间接ELISA法检测抗体的效价,用间接免疫荧光和Western blot法测定抗体的特异性。克隆鳜AKT2基因,构建过表达载体pCMV-EGFP-ScAKT2,将其转染至CPB细胞系中构建ScAKT2过表达细胞系,用荧光显微镜检测转染效率,用qRT-PCR法及Western blot法分别测定ScAKT2 mRNA水平和蛋白水平的表达,以鉴定ScAKT2过表达细胞系是否构建成功。将ISKNV接种至ScAKT2过表达细胞系中,用qPCR法及Western blot法分别测定ISKNV病毒拷贝数及ISKNV-MCP蛋白的表达,用qRT-PCR法测定ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA水平的表达情况。【结果】PCR扩增获得1 400 bp的AKT2 ORF片段,成功构建了原核表达质粒,诱导表达出72 ku的重组蛋白。成功制备了ScAKT2多克隆抗体,抗体效价达1∶256 000,纯化后质量浓度约为10 mg/mL。成功构建了pCMV-EGFP-ScAKT2过表达载体和过表达ScAKT2的CPB细胞系,过表达ScAKT2 CPB细胞可极显著抑制ISKNV的增殖,能明显上调ScIRF3、ScIRF7、ScMx、ScIL8、ScTRAF2和ScTRAF3等先天免疫因子mRNA的表达水平。【结论】ScAKT2通过上调先天免疫因子的表达抑制ISKNV的增殖,为鳜ISKNV防控提供了新的潜在靶点。     

DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼传染性脾肾坏死病毒

以ISKNV MCP基因为目的基因,克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中,构建成DNA疫苗pcMCP,对鳜鱼(Siniperca chuatsi)pcMCP DNA疫苗进行浸泡免疫效果研究。结果表明,pcMCP DNA疫苗能够刺激免疫系统,对非特异性免疫和Ig M的表达都具有激活作用。免疫后血液中白细胞含量、白细胞吞噬能力和SOD活力都显著提高,14 d时均达到最大。IgM和Mx基因的mRNA表达研究显示,72 h大量表达,96 h达到最大,分别是对照组的3.05倍和2.02倍。攻毒试验显示,浸泡免疫能够有效保护ISKNV感染的鳜鱼,在第11天,浸泡免疫组的累计死亡率仅为40%,而对照组死亡率都达到了100%,pcMCP浸泡免疫降低了ISKNV感染的鳜鱼死亡率。     

鳜弹状病毒与传染性脾肾坏死病毒双重PCR检测方法的建立

【目的】建立鳜弹状病毒(SCRV)和传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)的双重PCR检测方法。【方法】分别针对SCRV N基因和ISKNV MCP基因的保守区域设计特异性引物,通过优化退火温度和引物用量(μL)比,建立SCRV和ISKNV的双重PCR检测方法,并对该方法的敏感性和特异性进行检验。应用建立的双重PCR方法对20份临床样品进行单一和双重PCR检测,比较单一和双重PCR的检测结果。【结果】成功建立了SCRV和ISKNV双重PCR方法,该法特异性较强,对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)、锦鲤疱疹病毒(KHV)、神经坏死病毒(NNV)、鲤春病毒血症病毒(SVCV)、新加坡石斑鱼虹彩病毒(SGIV)、罗非鱼湖病毒(TiLV)等鱼类常见病毒无扩增;敏感性较好,对2种病毒DNA的检测下限均为0.01 ng/μL。20份临床样品的双重PCR样品检测结果显示,3份为SCRV阳性,11份为ISKNV阳性,2份为SCRV和ISKNV混合感染,结果与单一PCR检测结果一致。【结论】建立的SCRV和ISKNV双重PCR检测方法特异性较强,敏感性较好,可用于鳜鱼SCRV与ISKNV的快速鉴别诊断和分子流行病学调查。     

传染性脾肾坏死病毒、鳜鱼蛙病毒和鳜弹状病毒三重PCR检测方法的建立

【目的】建立可同时检测传染性脾肾坏死病毒（infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）、鳜鱼蛙病毒（Siniperca chuatsi ranairidovirus,SCRIV）和鳜弹状病毒（Siniperca chuatsi rhabdovirus,SCRV）的三重PCR检测方法,为鳜鱼等养殖品种流行病学调查提供方法支撑。【方法】根据ISKNV MCP基因、SCRIV MCP基因和SCRV N基因设计3对特异性引物,对PCR扩增反应中的退火温度和引物用量进行优化,建立可同时检测 ISKNV、SCRIV和SCRV的三重PCR方法。为验证该方法的敏感性和特异性(备测病毒为IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV和SVCV),对22份疑似感染ISKNV、SCRIV和SCRV的样品分别进行单一和三重PCR检测。【结果】成功建立了三重PCR检测方法,利用该方法可同时检测ISKNV、SCRIV和SCRV,特异性较好,对IPNV、GCRV、KHV、SGIV、NNV、TiLV、SVCV等无扩增;该方法敏感性好,对3种病毒核酸的检测下限均为0.01 ng/μL;利用该方法和3种病毒单一PCR方法同时对22份临床样品进行检测,结果显示2种方法吻合率为100%,其中ISKNV阳性率为27%、SCRIV 阳性率为41%、SCRV阳性率为9%、ISKNV和SCRIV混合感染阳性率均为9%,无ISKNV、SCRIV和SCRV混合感染。【结论】建立的三重PCR检测方法具有特异性强、灵敏度高等特点,可对这3种病毒进行快速鉴别诊断。     

传染性脾肾坏死病毒(ISKNV)ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备

[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。     

中医方药调控肾纤维化相关信号通路的研究进展

肾纤维化相关研究的信号转导通路包括TGF-β1/Smad通路、Wnt/β-catenin信号通路、mTOR信号通路、Sonic Hedgehog通路、ERK1/2通路、P38 MAPK信号通路和HGF/c-met信号通路等。大量实验研究表明,中医方药可通过多环节、多途径、多靶点调节相关信号通路的表达,干预肾纤维化进程。基于此,本文就中医药干预肾纤维化相关信号通路研究进展进行综述,以期为中医药防治肾纤维化疾病提供循证依据。     

传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的表达·纯化及其抗体的制备

[目的]构建传染性脾肾坏死病毒（ISKNV）ORF086基因的融合表达载体,制备抗体为进一步研究ORF086蛋白的免疫保护性提供前提条件。[方法]PCR扩增目的基因,构建重组质粒,经酶切鉴定,PCR和核酸序列分析后,IPTG诱导表达,Ni-柱纯化,注射新西兰白兔获得抗血清。[结果]扩增出ORF086基因,成功构建了重组质粒pET32a-ORF086,SDS-PAGE电泳和Western-blot分析显示,获得一条36.0 kD的融合蛋白。[结论]成功构建了原核表达载体,融合蛋白主要以包涵体的形式存在,经柱层析纯化蛋白,纯度达90%以上。     

mTOR信号通路在调控猪繁殖与呼吸综合征病毒复制中的作用

[目的]为阐明哺乳动物雷帕霉素靶点(mammalian target of Rapamycin,mTOR)信号通路在调控猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)复制过程中的作用,探索防控该病传染的新途径.[方法]PRRS...     

姜黄素调控Notch1信号通路诱导结肠癌SW480细胞株凋亡

目的 从Notch1信号通路探讨姜黄素诱导结肠癌SW480细胞株凋亡的分子机制。方法 （1）利用流式细胞技术检测不同浓度姜黄素（0,7.5,15,30,60 μmol/L）处理结肠癌SW480株24 h和48 h后的细胞凋亡情况。（2）通过RT-PCR检测不同浓度姜黄素（0,7.5,15,30,60 μmol/L）处理结肠癌SW480细胞株24 h和48 h后,Notch1信号通路中膜受体基因Notch1及下游靶基因Hes-1 mRNA表达情况,观察姜黄素对Notch1信号通路中Notch1及Hes-1基因mRNA表达的影响。结果 （1）姜黄素能诱导结肠癌SW480细胞株凋亡;（2）姜黄素能一定程度上下调Notch1信号通路中Notch1及Hes-1基因mRNA的表达（P＜0.05）。结论 姜黄素能一定程度上诱导结肠癌SW480细胞株凋亡,这种对结肠癌SW480细胞毒性作用可能与调控Notch1信号通路中膜受体基因Notch1及下游靶基因Hes-1转录有关。     

连翘酯苷对人工感染传染性支气管炎病毒雏鸡肺组织JAK/STAT信号通路的调节作用

探讨连翘酯苷对人工感染传染性支气管炎病毒雏鸡的肺组织JAK/STAT信号通路的调节作用,分别设连翘酯苷预防组高、中、低和治疗组高、中、低6个剂量组,并设利巴韦林阳性对照组、空白对照组和病毒对照组。提取雏鸡肺组织总RNA,用相对荧光定量RT-PCR的方法测定雏鸡体内干扰素-α,JAK,STAT-1mRNA的相对表达量。结果表明连翘酯苷预防组高剂量100 mg/kg、中剂量50 mg/kg和治疗组中剂量100 mg/kg对雏鸡体内干扰素-α的mRNA水平表达有诱生作用（P〈0.01）,治疗组中剂量显著上调JAK及STAT-1的表达,与JAK/STAT信号通路一些因子的上调相关,其机制部分与肺组织的JAK/STAT信号通路激活和相关信号的表达有关,这是连翘酯苷发生抗病毒作用的机制之一。     

脑心肌炎病毒VP1蛋白抑制Ⅰ型IFN信号通路和促进病毒体外增殖

脑心肌炎病毒是一种重要的人畜共患病病原,为了初步研究EMCV介导的天然免疫反应的分子机制,将VP1蛋白克隆至真核表达载体pCMV-HA,转染HEK293细胞后,使其在细胞内过表达,通过ELISA和实时荧光定量PCR检测VP1过表达对IFN-β表达和RLRs信号通路相关因子,以及下游刺激基因表达的影响。结果表明,VP1蛋白可显著抑制IFN-β的表达。进一步研究发现,VP1可显著抑制EMCV引起的RLRs信号通路相关因子mRNA水平(P<0.01),并且随着VP1的表达,MAVS蛋白的表达明显减少,但对MDA5表达无影响。实验数据初步表明,VP1蛋白可以通过抑制MAVS的表达,进而抑制Ⅰ型IFN基因的表达并阻断其下游信号通路发挥作用。     

健脾、补肾与健脾补肾三法对慢性乙型肝炎患者外周血T细胞功能的影响

目的比较健脾法、补肾法和健脾补肾法对慢性乙型肝炎患者外周血T细胞功能的影响、方法收集24例慢性乙型肝炎患者和10例健康人的抗凝外周静脉血,分离外周血单个核细胞(PBMCa),进一步分离提取培养T细胞,采用大鼠健脾、补肾和健脾补肾药物血装进行千预检%}}J T细胞亚群CD3'',CD4'',CD8+及CD28+分子的表达结果3组药物血装千预后CD4+分子表达率升高}P<0.05), CD8+分子表达率降低}P<0.05),补肾组药物血装千预后CD3+表达率升高(P<0.05),补肾组和健脾补肾组药物血装千预后CD28+分子表达率升高(P<0.05)〔结论健脾法、补肾法和健脾补肾法均能调节慢性乙型肝炎患者T细胞免疫功能,补肾法对慢乙肝患者T细胞功能的影响更为显著、     

传染性造血组织坏死病毒糖蛋白基因的原核表达及抗原性分析

应用RT-PCR方法扩增了传染性造血组织坏死病毒IHNV-ZYX株编码的糖蛋白(G)基因,将G基因克隆至原核表达载体pET30b,并在大肠杆菌Rosetta( DE3)中得到了表达.SDS-PAGE分析表明,重组菌诱导后得到了预期大小的G蛋白.提取G蛋白的包涵体,并制备抗血清.间接ELISA和Western-blott...     

虹鳟传染性胰脏坏死病毒的分离鉴定及聚类分析

为研究传染性胰脏坏死病毒(IPNV)感染虹鳟Oncorhynchus mykiss的病理特性,取云南省某养殖场大规模死亡的虹鳟稚鱼进行了病原的分离与鉴定,试验中利用鲑鳟鱼常见病毒敏感细胞大鳞大麻哈鱼胚胎细胞(Chinook salmon embryo cells,CHSE-214)、鲤上皮瘤细胞(Epitheliaoma papulosum cyprinid,EPC)和虹鳟性腺细胞(Rainbow trout gonad cell line,RTG-2)对虹鳟稚鱼无菌组织悬液进行病毒培养,并对产生细胞病变的上清进行病毒RNA提取及鲑鳟鱼常见病毒的RT-PCR检测,利用敏感细胞进行病毒分离株的噬斑培养及滴度测定,并对病毒形态进行透射电镜观察。结果表明:细胞培养显示,该组织悬液能使CHSE-214和RTG-2细胞产生明显的细胞病变;RT-PCR结果显示,检测样本呈IPNV阳性,传染性造血器官坏死病毒(IHNV)呈阴性;该IPNV分离株(命名为Ch Rtm213)在CHSE-214、RTG-2和EPC细胞上的病毒滴度分别为10~(5.2)、10~(3.2)、10~(2.3) TCID_(50)/m L,在CHSE-214细胞上培养4 d即可形成肉眼可见的病毒噬斑;在透射电镜下清晰可见大量病毒粒子呈晶格状排列于细胞质内;Ch Rtm213分离株与西班牙毒株2310(AY489225)VP2相似度较高,核苷酸序列一致性为96.4%;聚类分析结果显示,Ch Rtm213分离株与参考毒株加拿大Jasper(ATCC:VR-1325)聚为一簇,属于Gengroup 5基因型。研究表明,Ch Rtm213分离株异于已报道的IPNV分离株,具有不同的血清型及病毒毒力,可为传染性胰脏坏死病毒的检测及防控提供参考。     

传染性造血器官坏死病毒毒株核蛋白基因片段的克隆及序列分析

利用RTG～2细胞对传染性造血器官坏死病毒（IHNV）的敏感性对IHNV-DL进行扩增,采用TR—Izol法提取病毒RNA,用IHNV核蛋白基因的一对通用引物进行RT-PCR扩增,将扩增出的一条786bp的基因纯化、克隆至pMD18－T载体中进行序列测定,并与国内外已公布的病毒核蛋白基因进行比对和分析。结果表明：此病毒的核酸序列与标准毒株RB－1、代表毒株WRAC的同源性分别为96．3％和93．6％;翻译出的氨基酸序列与标准毒株RB－1、代表毒株WRAC的同源性分别为96．1％和93．5％。系统进化树分析结果表明,此毒株与中国近期公布的毒株zyx有密切的亲缘关系。     

胆固醇对鸡传染性支气管炎病毒感染鸡胚肾细胞的影响

胆固醇是维持细胞膜脂筏稳定结构重要组分。一些囊膜病毒感染过程依赖胆固醇。研究利用Real Time PCR和病毒滴度试验,分析细胞膜和病毒囊膜胆固醇是否影响鸡传染性支气管炎病毒(IBV)感染鸡胚肾(CEK)细胞。结果表明,胆固醇萃取剂甲基-β-环糊精去除细胞膜胆固醇后,可抑制IBV感染CEK细胞并呈剂量依赖性,补充外源性胆固醇后,IBV感染力部分恢复,说明IBV感染依赖细胞膜胆固醇;去除细胞膜胆固醇可影响IBV感染侵入和释放过程。去除病毒囊膜胆固醇对IBV感染力无显著影响。IBV感染CEK细胞时依赖细胞膜胆固醇,而非病毒囊膜胆固醇。     

唇?成鱼脾和肾的解剖学与组织学特征

采用解剖、石蜡切片及HE染色技术研究了唇?脾脏、头肾及中肾的解剖学与组织学特征。结果显示,唇?脾脏单个,暗红色,呈扁平椭圆形,脾实质被起自被膜的结缔组织隔膜分隔成许多小叶,小叶内红髓与白髓界限不明显,含红细胞、淋巴细胞及黑色素巨噬细胞等,血管丰富。肾脏可明显的分为头肾和中肾。头肾位于体腔前端的心腹隔膜上方,分左右两叶,对称分布。头肾实质部分无肾单位,主要由淋巴组织构成,分红细胞聚集区和白细胞聚集区,内含丰富的红细胞、淋巴细胞、粒细胞及一定数量的黑色素巨噬细胞,在细胞组成上与脾脏有类似特征。中肾位于鱼体的胸腹段,紧贴体腔背部脊椎两侧,实质部分主要由肾单位、集合管及淋巴组织等构成;淋巴组织在细胞组成上与头肾有相似之处,含红细胞、淋巴细胞、粒细胞及黑色素巨噬细胞。研究结果表明,唇?脾脏、头肾是机体重要的免疫和造血器官,中肾除了泌尿功能外,在免疫及造血中也发挥重要作用。     

欧鳗脾和肾中黑色素巨噬细胞中心的形态学与细胞化学研究

应用组织化学与电镜技术对欧鳗脾脏和肾脏中黑色素巨噬细胞中心(MMCs)进行研究。结果表明:脾脏和肾脏中均存在MMCs,它们呈圆形、卵圆形或不规则形状;脾脏MMCs有邻血管分布的特点,而肾脏MMCs的分布无此特点;脾脏和肾脏中的MMCs均含有铁血黄素、黑色素及脂褐质3种色素,但脾脏MMCs以铁血黄素为主,肾脏以黑色素和脂褐质为主;脾脏MMCs中存在色素颗粒和细胞碎片。初步推测,欧鳗脾脏MMCs与肾脏MMCs的功能有可能是不相同的。