稳定表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白P815细胞系的建立

应用脂质体介导的基因转染方法,将表达猪圆环病毒2型(porcine circovirus,PCV2)衣壳蛋白的重组质粒pcDNA3.1-orf2转染P815细胞,筛选G418抗性单克隆细胞,并经PCR、RT-PCR和间接免疫荧光鉴定,随后对目的蛋白表达稳定性进行了检测。结果表明PCV2orf2基因已经整合进P815细胞基因组DNA中,ORF2编码的衣壳蛋白在获得的阳性P815细胞中稳定表达,建立了稳定表达PCV2衣壳蛋白的P815细胞系。该细胞系的建立为PCV2新型疫苗的研究提供了必要的实验材料,同时也可为其他病毒疫苗的研究提供有价值的参考。     

猪圆环病毒2型ORF2基因克隆及其在大肠杆菌中的融合表达

猪圆环病毒2型（Porcine　circovirus　type　2，PCV2）是仔猪断奶后多系统衰竭综合征（PWMS）的病原。它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。目前，PCV2己经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。     

表达猪圆环病毒2型衣壳蛋白的重组猪痘病毒的构建及鉴定

为探索猪痘病毒（swinepox virus,SWPV）作为猪圆环病毒2型（porcine circovirus type 2,PCV2）疫苗载体的可行性,本试验以痘苗病毒启动子P11启动绿色荧光蛋白筛选标记,猪痘病毒TK基因为外源基因的插入位点,P28、P7.5启动子启动PCV2 ORF2基因,以猪痘病毒JX20G株为亲本病毒,采用同源重组技术分别构建了两株表达PCV2衣壳蛋白的重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C。结果显示,重组猪痘病毒rSWPV11-28C和rSWPV11-7.5C均成功表达了PCV2衣壳蛋白,表达的蛋白能与PCV2单克隆抗体6E12发生特异性反应;痘苗病毒启动子P28的启动效果明显优于P7.5,P28适合用于启动目的基因;利用重组猪痘病毒制备的PCV2灭活疫苗免疫小鼠后,rSWPV11-28C疫苗组的PCV2抗体水平与某PCV2商品疫苗相当,该重组病毒的成功构建为PCV2相关疾病及其他疫病在猪群中的防控提供了新的方向。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白体外表达研究现状

猪圆环病毒2型(PCV2)是引起猪圆环病毒相关疾病(PCVAD)的主要病原体,会破坏免疫系统,引起多种病毒或细菌的混合感染与继发感染,给养猪业造成了巨大经济损失.目前疫苗免疫仍然是防控PCVAD的有效手段,核衣壳蛋白(Cap)是主要免疫保护性抗原,因此Cap蛋白基因工程疫苗是研究的理想靶抗原,获得大量、可溶性、富有活性...     

猪圆环病毒1型和2型衣壳蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的猪圆环病毒1型(PCV1)和猪圆环病毒2型(PCV2)的衣壳蛋白基因(Cap)分别设计一对引物,利用PCR方法从已知的PCV1和PCV2中各扩增到一条DNA片段.将PCR产物按预定的阅读框架插入表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pCAP-PCV1和pCAP-PCV2,并分别转化大肠杆菌BL21.序列测定表明,所克隆的序列大小均为579 bp,其中PCV1的cap基因与GenBank中的U49186序列一致,PCV2的cap基因与DQ104422序列一致.通过对菌体裂解物的SDS-PAGE分析和Western blot鉴定,证明携带重组质粒pCAP-PCV1或pCAP-PCV2的大肠杆菌均可以表达融合蛋白形式的衣壳蛋白(分别命名为GST-CAPl和GST-CAP2,分子量约为49 ku).通过免疫小鼠制备了GST-CAP1和GST-CAP2多价血清,并通过dot-ELISA进一步证明了PCV1与PCV2的抗原交叉性.猪圆环病毒衣壳蛋白的表达,将为临床检测PCV抗体提供诊断抗原以及为研制PCV单克隆抗体提供材料.     

猪圆环病毒疫苗的研究进展

猪圆环病毒2型(PCV 2)是引起猪断奶后多系统衰竭综合征(PMW S)的主要病原。自1991年在加拿大猪群中暴发以来,PMW S给全世界养猪业造成了巨大的经济损失。PCV 2还与增生性坏死性肺炎、母猪繁殖障碍、猪皮炎与肾病综合征和猪呼吸道疾病综合征相关[1]。据估计,PCV 2相关性疾病(PCV     

猪圆环病毒2型与猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒混合感染的诊治

猪圆环病毒2型自1991年被证实具有致病性以来,已遍布除大洋州外的世界各养猪国家和地区。国内外研究结果表明,猪断奶后多系统衰竭综合征、猪皮炎与肾病综合征及猪呼吸道疾病综合征被认为与猪圆环病毒2型的感染有关。圆环病毒2型感染引起了国内从事养猪生产及猪病研究工作者的高度重视。2005年7月广东省某猪场发生了一种以体温升高,呼吸困难,腹股沟淋巴结高度肿大,颜面部、会阴部及腹部皮肤呈现出血性皮炎及一定程度的黄疸为特征的传染病。经流行病学、临床症状、剖检变化和实验室诊断,确诊为猪圆环病毒2型与猪繁殖障碍与呼吸道综合征病毒混…     

猪圆环病毒PCR检测方法的建立

猪圆环病毒PCV属于圆环病毒科,根据国外已经报道的猪圆环病毒的序列,设计了下面的一对引物,上游引物和下游引物(upper:5'-TTTTTATCACTTCGTAATGGTTTTT-3'lower:5'-GGCCCCCTTCCTCCGTG-GATTGTTC-3'),提取DNA,对PCV-2进行PCR试验.然后对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳.结果显示,从美国进口的种毒中扩增出了长为1768bp的基因片段.本试验可以从病料或全血中检测出PCV,且该方法能区分PCV-1和PCV-2,快速、敏感、特异性强,适合于PCV的检测.     

猪圆环病毒病的防治措施

猪Ⅱ型圆环病毒（Porcine Circo Viras type2,PCV2）可引起断奶仔猪断奶后多系统衰竭综合征（Post-weaning Multisystemic Wasting Syndrome,PMWS）、猪的繁殖障碍、断奶仔猪和育肥猪的呼吸道疾病[3]、猪皮炎与肾病综合征[4]、幼龄仔猪的先天性震颤[5]等疾病,其中PMWS引起的损失最大,引起了广泛的关注。     

远离猪圆环病毒2型感染

随着该病的不断出现．人们越来越注意到猪圆环病毒2型的危害性。它不仅是断奶仔猪多系统衰竭综合征的罪魁祸首,也是其他传染病的诱因之一。正是圆环病毒2型破坏了免疫系统．才加剧了诸如猪繁殖与呼吸综合征．猪细小病毒病及其他病毒病的发生和流行。因此．有必要对该病进行全面的了解。     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

应用PCR技术诊断猪圆环病毒2型与猪伪狂犬病病毒混合感染

猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）是从猪断奶后多系统衰竭综合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）病猪中分离的猪圆环病毒口，又称PMWS相关PCV。一般由PCV-2单独引起的疾病比较轻微，但常常由于并发或继发细菌或病毒感染而使死亡率大大增加，病死率可达25％以上。     

猪圆环病毒（PCV-2型）病与喘气病混合感染的诊治

猪圆环病毒（PCV-2型）病又称为“猪断奶后多系统衰竭综合征”或“断奶仔猪衰竭综合征”，是由圆环病毒2型感染所致的病毒性疫病。此病是一种新型的传染病，最早发现并且被确诊于1996年加拿大的西部猪场。十年来在世界各地被陆续发现和报道。由于PCV-2的致病性独特，现阶段对于圆环病毒还没有完全研究清楚，也不可能在短时间内研制出有效的疫苗和治疗药物，但是目前猪群带毒感染情况非常普遍。     

兔抗猪圆环病毒Ⅱ型ORF2重组蛋白抗体的研制

猪圆环病毒Ⅱ型(Porcine circovirus 2,PCV2)是仔猪断奶后多系统衰竭综合征(PWMS)的病原.目前,PCV2已成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一,给世界各地的养猪业造成了巨大的经济损失.衣壳蛋白(ORF2)是编码PCV2的主要结构蛋白,具有免疫原性,且不发生血清学交叉反应,是病毒刺激机体产生中和性抗体的重要蛋白.近年来的研究证实,猪圆环病毒Ⅱ型ORF2(PCV2-ORF2) 重组蛋白是良好的免疫原,但国内的相关研究报道较少.试验以家兔为试验动物,以PCV2-ORF2重组蛋白为免疫原,探索兔抗PCV2-ORF2重组蛋白抗体的制备方法,以期建立新的动物试验模型,为进一步深入研究PCV奠定基础.     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白优势B细胞表位重组蛋白免疫原性研究

猪圆环病毒2型(PCV-2)衣壳蛋白(Cap)是研制基因工程疫苗和血清抗体检测方法的主要候选抗原。为筛选免疫原性强的Cap抗原表位,将定位在Cap上的6个B细胞线性表位的编码基因序列重新组合,命名为R1234、R1235、R1236、R2345、R2346和R3456,然后克隆至pET32a原核表达载体,转化到大肠埃希菌中进行诱导表达。通过对表达和纯化条件的优化,最终获得6个多抗原表位串联体的重组蛋白。Western blot和间接ELISA结果显示,6组重组表位蛋白均能被PCV-2阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。将其与完整Cap分别免疫Balb/c小鼠,检测免疫后血清中特异性抗体和细胞因子水平以及脾脏淋巴细胞中CD4^+和CD8^+T淋巴细胞的比例。结果表明,R2346组合刺激机体产生的特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4的水平明显高于其他组,脾脏淋巴细胞中CD4^+和CD8^+T淋巴细胞含量与对照组相比显著增加(P<0.05),说明该重组蛋白能够刺激体液免疫和细胞免疫反应。因此,筛选获得的R2346重组表位蛋白可以作为研制PCV-2多表位基因工程疫苗和血清抗体诊断方法的候选抗原,用于PCV-2的预防和控制工作中。     

猪圆环病毒2型感染的流行病学与病因

从2002年开始,猪圆环病毒病渐渐走进了我国养猪人的视线,当时给我国特别是华南地区的养猪业造成了很大的危害。随着研究的深入,我们认识到,猪圆环病毒2型可导致多种疾病,如猪繁殖障碍、猪呼吸道疾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征、生长育肥猪的皮炎肾病综合征等各生长阶段的猪发病。最严重的是猪被圆环病毒2型感染后,可破坏猪体的免疫系统,造成免疫抑制,继发和并发其他病原体感染,使疾病复杂化,并难于控制和治疗,使之成为当前需要重点防控的猪病之一。     

猪圆环病毒与相关猪病研究进展

猪圆环病毒早在1974年就被德国专家首先发现，但在全球真正引起重视是近些年的事（在一些养猪业发达的国家和地区也只是近二、三年以来）。我国也是近年才对猪圆环病毒加以重视，但是，对于猪血清中猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）抗体所作的回顾性检测以及对猪组织样本所作的回顾性检测结果表明PCV2抗体至少从1969年起就已经存在于猪群中了，在西班牙和英格兰自1986年就已经定性散发病例。这些年PCV2与其它许多相关综合征的报道时有发表，1996年以后，PMWS和其他PCV2相关的猪病在全球都被确认，PCV2与PMWS的联系是结论性的，而PCV2在其它综合征中的作用需要进一步澄清。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白(Cap)在293T细胞中的亚细胞定位

猪圆环病毒2型(PCV2)ORF2基因编码病毒的核衣壳蛋白(Cap),该蛋白属于病毒保护性抗原,具有重要免疫功能。本研究以PCV2871毒株基因组为模板,用特异性上下游引物扩增获得ORF2基因,利用真核表达载体构建了表达PCV2Cap蛋白的重组质粒pCAGGS-ORF2。采用脂质体将pCAGGS-ORF2转染至293T细胞,用抗PCV2-Cap单克隆抗体对重组质粒转染细胞进行了免疫活性分析和免疫荧光检测,表明Cap蛋白在细胞中获得表达;利用共聚焦显微镜对Cap蛋白在293T细胞中的亚细胞定位观察结果表明,转染24h后可见Cap蛋白的表达随培养时间延长显著增多,72h达到高峰,表达的Cap蛋白主要分布在细胞核中。构建的pCAGGS-ORF2真核表达重组质粒在293T细胞中的表达,为进一步PCV2基因疫苗的研制奠定了基础。     

疑似感染猪圆环病毒2型病例的确诊

山东省诸城市某猪场送检了一起临床疑似感染猪圆环病毒2型的仔猪，临床表现为消瘦，腹部甚至全身皮肤表面有硬币大小的斑块；呼吸急促困难；个别仔猪存在腹泻。通过临床剖检发现全身淋巴结肿大，切面白色多汁；肝硬变；肺脏肿胀间质增宽；肾脏水肿，苍白，被膜下有大小不一的白斑，髓质部有点状出血。分别采集病猪腹股沟淋巴结、部分肺脏和部分肾脏研磨后取上清，行了PCR鉴定。根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型基因序列设计合成的一对引物，经过PCR鉴定，扩增片段与目的片段大小相符，进一步证实该猪场的病猪感染了猪圆环病毒2型病毒。德国人于1974年在PK-15细胞系中发现了一种与细小病毒类似的颗粒，当时被认为是一种细胞污染物。1982年，有人通过对这种细胞污染物进行提纯镜检及核酸鉴定，最后确定为一种新的病毒，并命名为猪圆环病毒（PCV）。根据圆环病毒的致病性、抗原性及核苷酸序列的差异，将PCV划分无致病性的PCV1和有致病性的PCV2两个基因型。PCV2与断奶仔猪多系统衰竭综合征密切相关，PCV2主要侵害机体得免疫系统，能造成免疫抑制，常常与PRRSV、PPV等造成混合感染，严重影响猪体的健康及生产性能。目前我国许多地区都有PCV2存在，该病给我国及世界各国的养猪业造成了巨大的经济损失，被世界公认为重要的猪传染病。     

北京地区规模化猪场猪圆环病毒2型感染的血清学调查与分析

猪圆环病毒2型（porcine circovirus type2，PCV2）作为一种近年来新被发现和重新认识的猪致病病原，已广泛受到了人们的重视。断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）是一种由PCV2引起的主要影响断奶仔猪和早期生长猪的新猪病，临床表现为进行性消瘦、呼吸困难和皮肤苍白，有时表现为黄疸。