海洋枯草芽孢杆菌3512A抗真菌脂肽的分离纯化及结构特性鉴定

海洋枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis菌株3512A分离自中国南海柳珊瑚。抗菌谱研究表明,该菌对多种动植物病原菌都有很强的抑制作用。稳定性试验表明该菌株产生的抗真菌活性物质对高温、酸和弱碱具有一定耐受性。利用玉米纹枯病菌Rhizoctonia solani作为靶标菌,结合酸沉淀、快速柱色谱、HPLC等现代色谱手段,对菌发酵液中的抗真菌活性物质进行分离纯化,获得两个活性强的单一化合物,化合物1和3。排油圈试验、甲苯乳化试验、TLC原位酸水解,以及一维核磁共振氢谱1H-NMR等多种研究结果表明,化合物1和化合物3均为脂肽类化合物衍生物。     

内生解淀粉芽孢杆菌BEB17脂肽类和聚酮类化合物的抑菌活性分析

BEB17是本实验室从健康香蕉植株根部中分离得到的一株具有较强抑制真菌活性的内生解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。在本研究中,我们通过PCR检测多个脂肽类和聚酮类化合物的合成相关基因,并结合基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)和液相色谱-质谱联用(LC-MS)分析,发现该菌株能产生表面活性素Surfactin、泛革素Fengycin和伊枯草菌素Iturin三类脂肽类化合物以及Bacillibactin、Difficidin和Bacillaene三类聚酮类化合物。通过比较两种发酵培养基(M9和Landy培养基)和两种提取方法(酸沉淀法和大孔树脂抽提法),结果发现酸沉淀法提取较为高效,Landy培养基更易于BEB17脂肽类和聚酮类化合物的发酵。活性检测表明,两种提取方法提取的粗提物对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4,Foc4)都具有较好的抑制作用,其中大孔树脂抽提法提取的物质抑制效果最好,当其浓度为300μg·m L-1时抑制率可达80.75%,说明该方法制备的粗提物的活性物质含量相对较高。进一步研究表明,该提取物能引起Foc4菌丝膨大和畸形,并抑制其孢子萌发。分析表明,该提取物对Foc4细胞膜具有破坏作用。     

枯草芽孢杆菌脂肽类抗生素发酵和提取条件

以枯草芽孢杆菌G1为出发菌株,研究了发酵过程中不同培养条件和培养基对该菌株产生脂肽类抗生素的影响。结果表明:最有利于脂肽类抗生素产生的发酵条件是初始pH7.0,接种量3%,发酵培养温度30℃,发酵时间38h时,而最佳培养基为Landy培养基。在提取脂肽类抗生素粗提物的过程中发现,加酸至pH4.0时脂肽类抗生素能够完全沉淀。在Landy培养基和上述发酵条件下,最多能产生脂肽类抗生素粗提物6.5g/L。利用HPLC技术对产生的脂肽类抗生素进行定量分析,结果表明产生纯的脂肽类抗生素最高达2.4g/L。     

枯草芽孢杆菌ge25对两种人参病原菌的抑制作用及脂肽类抑菌代谢产物的鉴定

为明确枯草芽孢杆菌ge25抑菌代谢产物的组成,采用层析柱分离结合抑菌活性追踪方法分离、纯化菌株发酵液中的抑菌脂肽,使用UPLC-ESI-Q-TOF对抑菌活性组分进行鉴定.层析柱分离共获得28个组分,其中G23～G27有抑菌活性,且G25和G26的抑菌活性最强;G25和G26经硅胶柱层析及TLC薄层层析分离,共获得3个组分L1、L2和L3,均有显著抑菌活性.UPLC-ESI-Q-TOF分析发现,L2和L3中包括1个fengycinA和6个fengycin B同系物或其衍生物;L1中发现2个化合物,但其分子量及碎片裂解规律与已知脂肽类成分存在明显差异,且未能获得明确的氨基酸裂解顺序,推测其可能不同于已报道的抑菌脂肽.扫描电镜观察发现,菌株ge25分泌的抑菌脂肽严重影响人参黑斑菌和人参锈腐菌菌丝体的正常生长,导致菌丝体形态异常、发育畸形.     

高寒草甸根围拮抗芽孢杆菌筛选鉴定及脂肽化合物分析

本研究通过平板对峙法分别从青海日月山及达日地区高寒草甸根围分离菌株中筛选到8株对油菜菌核病菌Sclerotinia sclerotiorum及水稻白叶枯病菌Xanthomonas oryzae pv.oryzae均具有明显拮抗效果的芽孢杆菌菌株RYS41、RYS42、RYS43、RYS44、DR1、DR2、DR3及DR20。生理生化、脂肪酸甲脂、16S rDNA及gyrB基因测序等分析结果表明,菌株RYS41、RYS42、RYS43、RYS44为解淀粉芽孢杆菌Bacillusamyloliquefaciens;菌株DR1、DR2、DR3、DR20鉴定为短小芽孢杆菌B.pumilus。MALDI-TOF-MS质谱分析结果表明,菌株RYS41产生脂肽类化合物Surfactin、Bacillomycins D和Fengycin,菌株DR20产生脂肽类化合物Surfactin、IturinA和Fengycin,推断可能与对油菜菌核菌及水稻白叶枯病菌的拮抗作用有关。     

内生拮抗枯草芽孢杆菌BS-2菌株的发酵条件

内生拮抗细菌BS 2菌株在以黄豆粉为原料的 3号培养基中生长速度快 ,发酵滤液对辣椒炭疽病菌的抑制作用强 ,菌液对辣椒果炭疽病的防效最好。培养基初始 pH值、培养时间、温度、通气量等对菌株生长及其抗菌物质的分泌有明显影响。结果表明 ,以黄豆粉培养基、初始 pH值 6 .7(灭菌后 )、2 8℃、培养 4 8h、并尽量增大培养通气量 ,为菌株的最佳发酵条件。     

枯草芽孢杆菌B2菌株产生的抑菌活性物质分析

枯草芽孢杆菌B2菌株产生的胞外物质经盐酸沉淀，甲醇抽提获得粗制备物。利用HPLC系统将粗制备物过Xterra RPl8层析柱分离，共获得120管收集液。以抑制小麦赤霉病菌分生孢子萌发为指标对各管收集液的抑菌活性进行了测定。通过LC-MS分析，结果表明B2菌株胞外存在3种抑菌物质，即脂肽类抗生素表面活性素、多烯类和一种分子量为564的结构未知的新物质。     

内生解淀粉芽胞杆菌BEB33脂肽类化合物分析及对香蕉枯萎病菌拮抗作用研究

为解析内生解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens BEB33的生防机理,检测了该菌株脂肽类化合物合成相关基因,利用基质协助激光解吸附离子化-飞行时间质谱分析了该菌株脂肽类化合物的种类,评价了脂肽类粗提物对香蕉枯萎病菌（FOC4）形态、镰刀菌酸合成的影响,以及粗提物对香蕉枯萎病的生防潜力分析。结果显示,BEB33基因组中编码有surfactin、fengycin、iturin和bacillomycin D 4种脂肽类物质合成酶基因。使用M9培养基发酵能产生surfactin、fengycin和bacillomycin D 3种脂肽类物质;脂肽类粗提物可导致香蕉枯萎病菌菌丝细胞膨大,细胞膜穿孔,镰刀菌酸产量降低70%;并发现脂肽类粗提物对香蕉枯萎病具有明显的防治效果。在不同处理中,枯萎病发病率分别降低47.67%、23.22%和36.56%,病情指数分别降低38.09、28.56和35.87。本文所获研究结果为进一步利用该菌株进行香蕉枯萎病生防制剂的研发提供理论基础。     

脂肽类化合物bacillomycin L抗真菌活性及其对水稻病害的防治

生防菌Bs-916对水稻纹枯病具有很好的防治效果,分泌的脂肽类化合物bacillomycin L是其抗真菌活性的关键因子之一.Bacillomycin L抑菌活性的定性及定量分析结果表明:其对常见的12种病原真菌的菌丝生长均有抑制作用,但其对不同病原真菌的毒力存在显著差异.Bacillomycin L对番茄灰霉Botrytis cinerea和稻瘟病菌Magnaporthe oryzae的毒力最强,抑制中浓度(IC50)分别为0.28μg·mL-1和0.35μg·mL-1;对大多数病原真菌IC50在1～3μg·mL-1;对水稻恶苗病菌Fusarium fujikuroi和串珠镰刀菌F.moniliforme毒力最差,IC50分别为28.99μg·mL-1和45.92μg·mL-1.显微观察表明bacillomycin L能致畸病原真菌菌丝和抑制孢子萌发.Bacillomycin L对稻瘟病和水稻纹枯病都有一定的防治效果,当使用浓度为500μg·mL-1时,对水稻纹枯病和苗瘟的防效分别为70.8%和56.3%.研究结果表明,bacillomycin L具有广谱高效的抗真菌活性,具有开发为环境友好型生物农药的潜力.     

拮抗内生芽孢杆菌BEB17分离鉴定及其挥发性物质抑菌活性分析

 项目组从健康香蕉植株根部中分离得到一株对多种植物病原真菌具有抑菌活性的内生细菌。结合形态特征观察、生理生化分析及分子鉴定,鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens),命名为BEB17。双皿对峙实验结果表明,该菌株产生的挥发性有机物(Volatile organic compounds, VOCs)可抑制多种病原真菌生长,其中对香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. cubense race 4,Foc4)抑制效果最强,抑制率达66.86%±0.90%,并能抑制其孢子萌发。用BEB17产生的挥发性物质做熏蒸处理后,Foc4菌丝发生缢缩膨大,细胞膜被破坏。采用顶空法固相微萃取结合气质联用(HS-SPME-GC-MS)对BEB17产生的挥发性有机物(VOCs)进行收集鉴定,得到10类33种单体有机物组分。     

特基拉芽孢杆菌JN-369的分离鉴定及其抑菌物质分析

为筛选可用于防治由稻瘟病菌所致水稻稻瘟病的生防菌株资源,采用稀释涂布平板法,从感病水稻品种湘早籼24号的健康植株茎叶中分离获得了1株拮抗细菌JN-369,结合形态学观察、生理生化鉴定及16S rDNA序列分析对其菌种进行了鉴定,采用平板对峙法研究了JN-369菌株的抑菌谱,并初步测定了JN-369中挥发性有机物 (VOCs)、蛋白类粗提物及脂肽类粗提物对稻瘟病菌的抑制作用。结果表明:JN-369菌株为特基拉芽孢杆菌Bacillus tequilensis,其对稻瘟病菌具有显著抑制作用,对菌丝生长的抑制率达80.46% ± 0.83%;同时该菌株对供试的辣椒胶孢炭疽菌、烟草赤星病菌及黄瓜疫病菌等植物病原真菌和卵菌均有抑制作用;但对供试病原细菌则均无抑制作用;1 × 108 cfu/mL 的 JN-369菌悬液产生的挥发性有机物对稻瘟病菌的抑制效果最强,抑制率达72.92% ± 3.01%,1.454 mg/mL的蛋白类提取物和1.026 mg/mL 的脂肽类提取物对稻瘟病菌的抑制率分别为24.68% ± 0.80%和14.34% ± 1.08%。研究表明,菌株JN-369具有一定的开发应用潜力。     

云木香内生细菌的分离鉴定及其对大丽轮枝菌的抑制作用

从药用植物云木香中分离得到41株内生细菌, 采用细菌16S rRNA基因测序的方法对这些菌株进行鉴定, 结果显示, 这些云木香内生细菌分别属于6个属, 其中假单胞菌属Pseudomonas和拉恩氏菌属Rahnella为优势菌属。采用对峙培养方法对这些菌株进行筛选, 发现其中12株内生细菌对大丽轮枝菌Verticillium dahliae具有抑制作用, 其中有2株属于拉恩氏菌属Rahnella, 7株属于假单胞菌属Pseudomonas, 3株属于沙雷氏菌属Serratia。12株内生细菌对棉花黄萎病的温室防效评估结果表明, 假单胞菌属菌株R1-6、R1-13和S1-2对棉花黄萎病的温室防效达到55%以上, 具有潜在的生产利用价值。     

宁夏地区苦豆子内生真菌的分离与初步鉴定

为了探讨宁夏地区苦豆子内生真菌类群的多样性,以宁夏地区苦豆子草为试验材料,采用组织分离法从其根、茎、叶中分离内生真菌,依据形态进行初步鉴定。结果表明,从宁夏地区苦豆子875个表面消毒的根、茎、叶组织块中,共分离出内生真菌115株。其中根中分离出18株,占15.7%,茎中分离出41株,占35.7%,叶中分离出56株,占48.6%,分布规律为叶、茎、根依次递减,叶组织中的内生真菌多样性较高。对产孢的113株进行初步鉴定,分类为2纲3目5科7属,其中青霉属(Penicillium)3株,占2.6%,黑葱花霉属(Periconia)4株,占3.6%;链格孢属(Alternaria)45株,占39.1%;镰孢霉属(Fusarium)9株,占7.8%,曲霉属(Aspergillus)10株,占8.7%,枝梗茎点霉属(Dendrophoma)30株,占26.1%,根霉属(Rhizopus)9株,占7.8%;其中链格孢属(Alternaria),枝梗茎点霉属(Dendrophoma)为优势种群。宁夏地区苦豆子内生真菌多样性丰富,同时不同部位内生菌的数量、种类及分布存在差异。     

解淀粉芽胞杆菌HRH317抗菌蛋白的分离纯化及其抗菌作用

为探究解淀粉芽胞杆菌Bacillus amyloliquefaciens HRH317菌株所产抗菌蛋白物质对禾谷镰孢菌Fusarium graminearum的抑制机理,采用硫酸铵分级沉淀菌株发酵液,DEAE Sepharose Fast Flow柱和Sephadex G-200柱层析分离纯化抗菌蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳检测抗菌蛋白分子量;并采用平板计数法和扫描电子显微镜观察病原菌孢子萌发和菌丝生长情况。结果表明,硫酸铵饱和度为50%时HRH317菌株发酵液的抑菌活性最大,抑菌圈直径可达2.02 cm,显著大于其它饱和度处理;2次柱层析可纯化出抗菌蛋白,分子量约为36.0 k D。禾谷镰孢菌经该抗菌蛋白处理后12h,病原菌孢子萌发率为55.8%,显著低于对照,且2~12 h间其孢子萌发率平均下降了57.3%;该抗菌蛋白还可造成病原菌菌丝变细、畸形与扭曲,且末端膨大等现象。表明解淀粉芽胞杆菌HRH317菌株产生的抗菌蛋白对禾谷镰孢菌孢子萌发和菌丝发育具有较强的抑制作用。     

烟嘧磺隆降解菌株的筛选及其降解特性初探

为得到烟嘧磺隆的高效降解菌株,并了解其降解特性,从烟嘧磺隆生产厂家污水处理池中筛选得到1株可高效降解烟嘧磺隆的菌株ND1,经形态学观察及生理生化、16S rDNA鉴定,该菌株为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis。在30℃、150 r/min条件下,该菌株3 d内可将200 mg/L的烟嘧磺隆降解98%以上;进一步通过高效液相色谱-串联质谱仪(HPLC-MS/MS)检测其降解产物,发现该菌株可作用于烟嘧磺隆的磺酰脲键,使其桥键发生断裂而产生降解产物2-氨基-4,6-二甲氧基嘧啶和磺酰胺。     

高寒草地青藏苔草拮抗内生细菌筛选、鉴定及其促生作用测定

为从青藏苔草Carex moorcroftii内生细菌中开发优势拮抗菌种资源,采用对峙培养法测定其叶片内生细菌对黄瓜枯萎病菌Fusarium oxysporum、马铃薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes、孜然根腐病菌F. solani等9种病原真菌的拮抗作用,对所筛选的优良拮抗内生细菌进行形态学及16S rDNA和gyr-B基因序列分析鉴定,并将其经固体发酵制成菌剂,采用生防菌剂接种方法测定其对黄瓜和辣椒的促生作用。结果显示,从青藏苔草叶片中共分离得到14株内生细菌;以黄瓜枯萎病菌作为指示菌初筛得到8株具有拮抗作用的菌株,其中菌株1Y4、1Y5、和1Y7的抑菌率均为57.53%,菌株1Y11的抑菌率为58.44%,均高于平均抑菌率56.73%;菌株1Y4具有广谱抑菌活性,对孜然根腐病和马铃薯炭疽病菌的抑菌率分别达73.33%和71.43%,且具有固氮作用;结合形态学和分子生物学鉴定,确定菌株1Y4为西姆芽胞杆菌Bacillus siamensis;以0.5%1Y4发酵菌剂处理黄瓜和辣椒,株高分别增加153.06%和117.33%,促生效果显著。表明青藏苔草内生细菌1Y4的防病促生作用良好,有开发为微生物菌剂的潜力。     

拮抗马铃薯晚疫病菌的高寒草地牧草内生细菌的鉴定及其生物功能测定

为获得对马铃薯晚疫病菌Phytophthora infestans具有拮抗效果的内生细菌,采用平板对峙法对21株分离自东祁连山高寒草地牧草的内生细菌进行抑菌能力测定,并结合形态学特征和16S r DNA基因序列同源性分析对拮抗菌株进行鉴定。结果表明,分离的21株内生细菌对马铃薯晚疫菌均有一定的抑制作用,其中262AY11、262AY6和264AY2抑菌效果最好,抑菌率分别为78.41%、78.03%和75.38%,根据16S r DNA基因序列分析将其分别鉴定为韦氏芽胞杆菌Bacillus weihenstephanensis、解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens和枯草芽胞杆菌B.subtilis,在Gen Bank中的登陆号分别为KC414703、KC441759和HQ202817。262AY11和262AY6具有固氮能力;262AY6具有分泌IAA能力,在不含和含色氨酸的金氏培养基中产IAA的量分别为9.94 mg/L和14.79mg/L,且对马铃薯坏疽病菌Phoma foveata、马铃薯枯萎病菌Fusarium avenaceum和马铃薯炭疽病菌Colletotrichum coccodes的抑菌率分别为70.25%、62.38%和81.75%;264AY2对3种病原菌的抑菌率分别为67.09%、50.75%和75.99%。表明芽胞杆菌262AY11、262AY6和264AY2能有效抑制马铃薯晚疫病菌的生长,具有固氮和产IAA的生物学功能,且对另外3种马铃薯病原真菌也具有一定的生防潜力,可作为生防菌进行开发和利用。     

群体感应调控因子ComA对枯草芽胞杆菌NCD-2抑菌物质产生和生物膜形成的影响

为明确群体感应系统在枯草芽胞杆菌NCD-2菌株抑菌活性和生物膜形成中的作用,通过同源重组技术对群体感应系统中的comA基因进行定位缺失突变,分别比较了NCD-2菌株和comA基因突变子在胞外酶合成、抑菌活性、脂肽抗生素(丰产素)产生以及生物膜形成上的差异,并进一步利用实时荧光定量RT-PCR技术比较了二者生物膜基质编码基因epsA和tasA的表达情况。结果表明,通过同源重组技术获得了comA基因突变子MA-4,同菌株NCD-2相比,其在胞外蛋白酶和纤维素酶的合成能力、对番茄灰霉菌Botrytis cinerea的抑菌活性、丰产素的合成量和生物膜的形成能力上均明显下降;生物膜基质编码基因tasA的表达量下降了70%,而epsA的表达量变化不明显。表明ComA是NCD-2菌株脂肽抗生素和生物膜形成中的重要调控因子。     

植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌株对葡萄灰霉病菌的抑菌活性

通过室内皿内对峙抑菌试验、分生孢子萌发抑制试验、离体果实接种试验以及电镜技术,研究测定了分离自小麦根部的植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌液对葡萄灰霉病菌Botrytiscinerea Pers.的抑制作用及抑菌机理。结果表明:用Em7菌液处理葡萄灰霉病菌后,在PDA培养基上形成了明显的抑菌圈,直径达2.81 cm;菌液对分生孢子萌发的抑制率达到88.65%;经Em7菌液处理后,离体果实病情指数明显低于空白对照,相对防治效果达到78.92%。电镜观察发现,处理组菌丝生长异常,体表凹凸不平,局部膨大成结或缢缩,分枝变多,菌丝体内液泡增多,细胞壁增厚,细胞膜透性发生变化。表明植物内生枯草芽孢杆菌Em7菌株对葡萄灰霉病菌有良好的抑制作用,并且可以有效控制葡萄灰霉病的发生。