重组Taq DNA聚合酶的表达和纯化鉴定

【目的】表达、纯化Taq DNA聚合酶,并检测其扩增性能。【方法】活化含Taq DNA聚合酶基因的菌株JM109,IPTG诱导表达。目的蛋白利用AKTA蛋白纯化系统,依次过Affi-Gel Blue Sepharose,Heparin Sepharose Fast Flow,Q-Sepha-rose Fast Flow,经SDS-PAGE分析,以国外进口Taq酶为标准,采用对比法初略测定酶活性,验证产品质量。【结果】制备的Taq DNA聚合酶具有扩增效率高、纯度高、特异性强、无核酸酶污染、活性稳定等优点。【结论】成功表达纯化Taq DNA聚合酶,其扩增性能达到甚至超过国外同类产品。     

Lactobacillus reuteri PYR8亚油酸异构酶基因在毕赤酵母中的表达

以Lactobacillus reuteri PYR8菌株基因组DNA为模板,利用PCR方法扩增出亚油酸异构酶(linoleate isomerase,LI)基因,将其克隆至酵母表达载体pPIC9K中,电转化至毕赤酵母GS115中.重组菌株GS115/pPIC9K-LI经1%甲醇诱导后,SDS-PAGE电泳表明该基因在酵母中得到表达,即分子量约为67 kD的重组LI蛋白.经SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析、Phenyl Sepharose Fast Flow疏水层析纯化获得了纯度为95%的重组LI蛋白样品.气相色谱分析表明,纯化的重组LI具有亚油酸异构酶的活性,酶的比活力为6.8 U·mg-1.     

甘薯几丁质酶的分离与纯化

以高抗甘薯黑斑病品种南京-92块根为材料,从染菌6 d的甘薯块根中得到粗酶液;经热变性、硫酸铵分级沉淀后,采用高流速二乙基氨基琼脂糖交换剂(DEAE Sepharose Fast Flow)阴离子交换层析,分离出3个蛋白峰,活性检测可知峰2为活性峰;将峰2经葡聚糖凝胶G-75(Sephadex G-75)凝胶层析纯化后得到4个蛋白峰;将具有几丁质酶活性的峰2经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE),凝胶上显示2条蛋白条带,分别割胶纯化测定活性,然后将有活性的条带进行10%、12%PAGE电泳,均显示为单一条带;本试验分离纯化过程中得到了电泳纯级的几丁质酶,为后续的研究奠定了基础。     

海蒿子岩藻聚糖结构特征及其抗流感病毒活性

采用热水提取法从海蒿子中提取粗多糖,再用Q-Sepharose Fast Flow和Sepharose 4B Fast Flow纯化得到一种硫酸化岩藻聚糖,命名为SF0。通过逐步部分酸水解,该岩藻聚糖SF0被进一步分为3种次级多糖SF1、SF2和SF3,硫酸基团的含量和相对分子质量依次降低。通过单糖组成、傅里叶红外光谱(FT-IR)和¹³C-NMR谱分析了4种多糖的结构特征,并探究了其抗甲型流感(H1N1)病毒的活性。结果表明,SF0主要由甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖和岩藻糖组成,摩尔比为10.8∶8.3∶3.0∶21.1∶21.2∶35.6,相对分子质量为628.1 ku,由α-D-1,2-Manp和β-D-1,4-GlcAp双糖重复单元构成核心骨架。抗甲型流感(H1N1)病毒检测表明,4种多糖都可以抑制MDCK细胞中的H1N1病毒复制。低分子量组分SF3比未降解岩藻聚糖抗病毒活性更好。初步认为该岩藻聚糖的抗H1N1病毒活性与其精细结构和分子量有关。     

2种阴离子交换柱对α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果

【目的】比较Q-Sepharose Fast Flow和DE-52 2种阴离子交换柱对1株脂环酸芽孢杆菌Alicycloba-cillus contaminans发酵产生的α-葡萄糖苷酶的分离纯化效果,为α-葡萄糖苷酶的规模化生产提供技术支持。【方法】采用硫酸铵分级沉淀法对发酵液中的蛋白质进行沉淀,以分离纯化后的蛋白质含量和酶活为指标,对2种阴离子交换柱的分离纯化效果进行评价。【结果】经过Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱分离得到的α-葡萄糖苷酶有1个酶活吸收峰,最大酶活为6.99×103 U,在这个吸收峰内蛋白质的含量稳定在26.25μg/mL左右;经过DE-52阴离子交换层析柱分离,α-葡萄糖苷酶的酶活范围较大,最大酶活为5.56×103 U,在酶活吸收峰内,蛋白质含量为21.25～232.5μg/mL,变化范围较大。【结论】Q-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析柱对α-葡萄糖苷酶的分离效果优于DE-52层析柱。     

中药蒲黄纤溶蛋白的分离纯化及部分性质

用DEAE Sepharose Fast Flow离子交换层析从中草药蒲黄中分离纯化一种纤维蛋白溶解酶,用纤维蛋白板检测分离后组分的纤溶蛋白活性,天然电泳检测分离效果,分离后得到了比活力为25.29的单一组分,SDS电泳确定该组分的表观分子量为31 000 D,同时比较了不同蛋白酶抑制剂对该组分的抑制作用。结果表明:该组分的纤维蛋白水解酶活性被PMSF、亮抑肽素、抑肽酶、大豆胰蛋白酶抑制剂以及苯甲脒强烈抑制,表明该粗提物中的蛋白酶属于丝氨酸蛋白酶家族。     

具几丁质酶抑制活性的中性蛋白酶的筛选与纯化

利用平板快速筛选法,从土壤中筛选到一株细菌Bacillus Sp.2108,其代谢物对几丁质酶具有较强的抑制活性.对其发酵液离心,用硫酸铵盐析后,经Sephadex G-25脱盐柱脱盐、DEAE Sephrose Fast Flow阴离子交换柱层析和低压液相色谱Superdex G 75凝胶过滤层析等步骤进行分离纯化,最后通过SDS-PAGE检测,得到一条单带.纯品经SDS-PAGE,转膜,测序,及序列比对,初步判定此抑制物是一种中性蛋白酶.     

鸭肝蛋白酶的分离纯化及其部分性质研究

经Tris-HCl缓冲液抽提、硫酸铵分级沉淀、DEAE-Sepharose Fast Flow 离子交换层析、Sephacryl S-200凝胶过滤层析,得到鸭肝蛋白酶电泳纯制品. 纯化倍数为650.16倍,回收率为19.23%. 经SDS-PAGE和凝胶过滤测得该酶的分子量为35 kD. 该酶在pH 6.0～11.0,温度低于25 ℃稳定,当温度上升到55 ℃时活性迅速下降. 该酶在pH 10和60 ℃时达到最高活性. 进一步研究得知: Cu2+离子对该酶有明显促进作用,而Mn2+却使酶几乎失活. 以酪蛋白为底物,在pH 10.0、37 ℃时测得米氏常数Km值为1.33%.     

马铃薯多酚氧化酶的分离纯化及酶学特性研究

为控制马铃薯在贮藏和加工过程发生的酶促褐变,对马铃薯多酚氧化酶进行分离纯化,并研究其酶学特性。采用缓冲液提取、低温离心得到马铃薯多酚氧化酶(PPO)粗酶液,粗酶液经硫酸铵分级盐析、Sephadex G-25分子凝胶柱层析脱盐处理、DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换柱层析和Sephadex G-75分子筛凝胶过滤层析分离纯化得到马铃薯PPO,进一步对其部分酶学特性进行研究。结果显示：纯化后的马铃薯PPO其比活力为283.0 U·mg^-1,回收率为16.8%,纯化倍数为18.6倍;该酶最适反应温度为30℃,最适反应pH为6.5;以邻苯二酚为底物时,最适底物浓度为50 mmol·L^-1。该酶对焦性没食子酸、间苯二酚的底物亲和性较强,对4-甲基儿茶酚、咖啡酸、没食子酸、对苯二酚、邻苯二酚、绿原酸的底物亲和性较低,对N-BOC-酪胺、愈创木酚亲和性很低。     

棉花黄萎病菌拮抗细菌TYG-2抑菌蛋白的分离纯化

拮抗细菌TYG-2是从根际土壤中分离得到的一株芽孢杆菌,其菌株发酵液产生的抑菌物质对棉花黄萎菌具有较强的抑制作用。为了得到它的抑菌活性组分,将TYG-2菌株去菌体发酵液经硫酸铵沉淀,得到的沉淀物脱盐后经DEAE-Sepharose Fast Flow分离得到4个组分,经抑菌活性测定得到一个抑菌活性组分,再通过Sephacry S-100凝胶过滤分离得到两个组分P1和P2,经检测表明P1组分对V.dahliae的菌丝生长具有抑制作用,为有效抑菌活性组分。经SDS-PAGE电泳纯化为单一蛋白带,分子量约为30kDa。     

Q Sepharose FF分离藻红蛋白的工艺研究

[目的]建立Q Sepharose FF分离藻红蛋白的工艺方法并验证其放大可行性。[方法]通过对洗脱条件、上样体积以及洗脱流速的优化,确定最佳分离工艺条件;在确定的工艺条件下,将上样体积与柱体积等比例放大。[结果]Q Sepharose FF分离藻红蛋白的最佳工艺条件为:将30 ml坛紫菜提取液加载到8 ml Q Sepharose FF柱上,以1 ml/min的流速使用添加0-0.10-0.35-1.00 mol/L NaCl的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH 6.0)分步洗脱,收集0.35 mol/L NaCl溶液洗脱时的色谱峰。在此条件下R-藻红蛋白的回收率和纯度系数(A565/A280)分别为44.3和1.15。按照该工艺,将75 ml藻红蛋白提取液加载到20 ml Q Sepharose FF柱上进行分离,发现分离效果没有发生明显变化。[结论]使用Q Sepharose FF介质能够分离坛紫菜提取液中的藻红蛋白且该工艺易于放大。     

抗猪链球菌戊糖乳杆菌素的纯化及特性研究

对分离自健康未断奶仔猪粪便的抗猪链球菌的戊糖乳杆菌LPL1—5所产细菌素进行提取、纯化,以及理化和生物学特性研究。戊糖乳杆菌LPL15所产细菌素经饱和度为80％的硫酸铵盐析、葡聚糖凝胶树脂G-10层析和SPSepharoseFastFlow阳离子树脂交换层析可得到纯化的细菌素,其比活力为1732．16AU／mg,纯度较发酵液提高了26．37倍;Tricine—SDS-PAGE凝胶电泳及活性检测试验结果显示,3313～5856u范围内存在1条活性蛋白带;纯化后细菌素特性分析发现,该细菌素具有良好的热稳定性、酸耐受性及溶解性,并基本确定其等电点为8．7;胃蛋白酶、胰蛋白酶、中性蛋白酶和蛋白酶K处理可使细菌素完全失活;该细菌素抑菌谱较广,不仅对猪链球菌（Sreptococcussuis）、单核细胞增生李斯特氏菌（Listeriamonocytogenes）、金黄色葡萄球菌（sfnphylococcus aereu）等革兰氏阳性菌有明显抑制作用,同时对大肠杆菌（Escherichiacoli）及假单胞菌（Pseudomonasspp．）等革兰氏阴性菌也表现出抑菌活性,具有作为食品防腐剂良好的应用前景。     

具几丁质酶抑制活性的中性蛋白酶的筛选与纯化

利用平板快速筛选法,从土壤中筛选到一株细菌BacillusSp.2108,其代谢物对几丁质酶具有较强的抑制活性。对其发酵液离心,用硫酸铵盐析后,经Sephadex G-25脱盐柱脱盐、DEAE Sephrose Fast F low阴离子交换柱层析和低压液相色谱Superdex G 75凝胶过滤层析等步骤进行分离纯化,最后通过SDS-PAGE检测,得到一条单带。纯品经SDS-PAGE,转膜,测序,及序列比对,初步判定此抑制物是一种中性蛋白酶。     

HP—PRRS纯化灭活疫苗免疫效力研究

为提高目前高致病性蓝耳病（HR—PRRS）灭活疫苗的免疫效果，将经Marc-145细胞培养收获的HP-PRRS病毒原液超滤浓缩50倍，再经灭活后用Sephamse 4 Fast Flow分子筛柱层析，收集完整的病毒粒子，加油佐剂制成纯化HP—PRRS灭活疫苗。纯化后疫苗的攻毒保护率达到415以上，血清抗体检测阳转率达86％以上，均高于同批病毒液制成的未纯化灭活疫苗，且差异显著。试验证明，HR—PRRS病毒液经浓缩纯化制成疫苗后，增强了免疫效果。     

海芋凝集素的纯化及其对4种昆虫细胞的毒杀作用

通过离体昆虫细胞培养研究海芋凝集素(Alocasia macrorrhiza lectin,AML)的毒杀作用。采用MTT法研究了提取自海芋叶0~30%、叶30%~80%、块茎0~30%、块茎30%~80%盐析段海芋凝集素粗品对4种昆虫细胞[草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda Smith细胞(简称Sf-9细胞)、甜菜夜蛾Spodoptera exigua Hübner细胞(简称Se 301细胞)、粉纹夜蛾Trichoplusia ni Hübner细胞(简称Hi5细胞)和美洲棉铃虫Heliothis zea Boddie细胞(简称Hz细胞)]的毒杀作用,结果表明,海芋叶、块茎上述盐析段的粗提物均对4种昆虫细胞有明显的毒杀作用,其中以块茎30%~80%的样品毒杀活力最高:在2%浓度处理24 h条件下,上述4种细胞的相对死亡率分别为91.40%、91.62%、97.13%和82.30%。用Q Sepharose Fast Flow柱(2.6 cm×30 cm)对海芋块茎30%~80%的盐析物进行分离纯化,用最大活性峰样品对Sf-9细胞的毒杀作用进行研究,得到处理24 h的毒力回归方程,LC50为0.79%。     

鸡α-干扰素在毕赤酵母中的分泌表达、纯化及其抗病毒活性测定

本试验将已构建的鸡α-干扰素重组酵母表达质粒pPIC-ChIFNα克隆至Pichia pastorisGS115基因组中,从阳性转化子中筛选出2株能高效表达鸡α-干扰素的重组酵母菌株,并对表达产物进行了纯化和抗病毒活性的测定。结果表明,Pichia pastoris表达的重组ChIFNα具有较高的抗病毒活性,其活性单位为570×104U/ml,结合蛋白定量计算其比活性为2 980×104U/mg。     

Q Sepharose FF分离藻红蛋白的工艺研究(英文)

[目的]建立Q Sepharose FF分离藻红蛋白的工艺方法并验证其放大可行性。[方法]通过对洗脱条件、上样体积以及洗脱流速的优化,确定最佳分离工艺条件;在确定的工艺条件下,将上样体积与柱体积等比例放大。[结果]Q Sepharose FF分离藻红蛋白的最佳工艺条件为:将30ml坛紫菜提取液加载到8ml Q Sepharose FF柱上,以1ml/min的流速使用添加0-0.10-0.35-1.00mol/LNaCl的NaH2PO4-Na2HPO4缓冲溶液(pH6.0)分步洗脱,收集0.35mol/LNaCl溶液洗脱时的色谱峰。在些条件下,R-藻红蛋白的回收率和纯度系数(A565/A280)分别为44.3和1.15。按照该工艺,将75ml藻红蛋白提取液加载到20ml Q Sepharose FF柱上进行分离,发现分离效果没有发生明显变化。[结论]使用Q Sepharose FF介质能够分离坛紫菜提取液中的藻红蛋白且该工艺易于放大。     

Bacillus subtilis Z-3菌株纤溶酶的分离纯化研究

为获取微生物源溶栓药物,从土壤中获得产纤溶酶活性较高的1株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Z-3。从Z-3菌株的发酵液中提取纤溶酶,利用DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析和聚丙烯酰凝胶电泳等方法,对纤溶酶进行分离纯化。分离纯化得到1个单一组分(BSFE-1),SDS-PAGE电泳检测为单一条带,BSFE-1表观分子量为48 kDa,等电点为10.5,属丝氨酸蛋白酶类,纤维蛋白平板法检测纤溶酶活性BSFE-1的比活力为4 494.099 U/mg,BSFE-1在4~50℃和pH 4~11之间活性较稳定。