鸭肝炎病毒分子流行病学分析

为了解我国鸭病毒性肝炎(DH)的流行情况,本研究用标准DH病毒(DHV)Ⅰ型(DHV-1)抗血清和新型DHV(N-DHV)抗血清对国内分离的7株DHV进行了血清中和试验。结果表明,PLK株和YB3株为DHV-1;YB1、YB2、YB5、HY2和HY3株为N-DHV。同时,对国内分离的9株病毒的抗原相关VP1基因进行RT-PCR扩增和测序,对VP1基因的核苷酸与推导的氨基酸序列分析的结果表明,3株DHV-1的氨基酸序列同源性为95%左右,6株N-DHV的氨基酸同源性为98%左右;DHV-1分离株与N-DHV分离株间氨基酸同源性为72%～77%。参照同属微RNA病毒的人肠病毒的血清型分型标准,通过对DHV VP1基因序列同源性比较,判定9株病毒的血清型。依据VP1基因序列同源性进行的血清型分型结果与根据抗原性鉴定进行的血清型分型结果一致。同血清型病毒株间的VP1基因变异很小,表明DHV的抗原性稳定。同型不同毒株间VP1基因的差异可以导致病毒在致病力、细胞感染能力等方面的差异。研究结果表明,目前我国存在DHV-1和N-DHV两种独立的血清型,但尚未见血清亚型的流行。     

新型鸭肝炎病毒全基因组序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(DHV)基因组变异情况,本研究将广东地区分离到的1株,山东地区分离到的2株与1型DHV(DHV-1)无抗原交叉性的新型DHV(N-DHV)全基因组序列测定的结果进行了分析。结果表明,N-DHV基因组全长7786nt～7788nt,仅有一个ORF,其结构具有典型的微RNA病毒科病毒基因组特征。ORF编码一个2251aa的聚合蛋白,该蛋白经3Cpro切割产生3个结构蛋白(VP0、VP3、VP1)和8个非结构蛋白(2A1、2A2、2B、2C、3A、3B、3C、3D)。与其他N-DHV毒株及DHV-1的抗原性相关VP1蛋白氨基酸序列比对表明,3株病毒之间及与国内分离的N-DHVG株的同源性均在98%以上,与韩国N-DHV同源性均大于92%,与中国台湾地区N-DHV同源性为80.1%～80.9%,与DHV-1的同源性为76.9%～77.3%。3株病毒与韩国N-DHVVP1氨基酸差异位点主要集中在C-端的高变异区。依据微RNA病毒科人肠病毒属血清型分型标准,GD株、SD01株、SD02株与韩国N-DHV和G株属于同一血清型,而与DHV-1和中国台湾地区新型DHV属于不同的血清型。     

3株鸭肝炎病毒Ⅰ型结构基因VP1的克隆及序列分析

通过RT-PCR方法扩增鸭肝炎病毒DHV-1:161/79/V、YH、HN株的VP1基因的核苷酸序列.系统发育分析表明,3株病毒与已发表的DHV-1结构基因VP1核苷酸和氨基酸的同源性分别为92.7%～96.9%和95.4%～96.6%,与DHV-1变异株核苷酸和氨基酸序列的相似性均分别低于75%和88%,表明3株病毒属于DHV-1,与变异株是不同的血清型.强毒DHV-1:161/79/V的VP1蛋白第49和第183位氨基酸为T和H,弱毒DHV-1:YH、HN为S和Q,推测这2处位点的改变可能与病毒的强弱有关;DHV-1和其变异株的VP1蛋白均没有保守的RGD序列;变异株N-DHV:90D、04G在第50和51位比DHV-1多2个氨基酸(Q和D),在第147和185位各缺失1个氨基酸(E和L),而在变异株DHV:AP-03337、AP-04009、AP-04114、AP-04203的第145和146位比DHV-1多了2个氨基酸(G、G);不同血清型的鸭肝炎病毒在46-64位、95-149位、180-223位抗原指数差别较大,推测这些位点的改变可能影响病毒的生物学特性.     

鸭肝炎病毒地方株VP1基因的序列测定及分析

从湖北某发病鸭场分离到一株鸭肝炎病毒DHV/HB98,通过RT-PCR方法扩增该毒株的VPI基因的核苷酸序列.系统发育分析表明,DHV/HB98株的基因组序列与已发表的DHV-1 E53和ZJ的结构基因VP1亲缘关系最近,核苷酸的同源性为98.6％和98.3％,氨基酸序列的同源性为98.3％和98.7％,分析DHV/HB98与发表的变异株90D和04G核苷酸同源性为65.4％和66.7％,氨基酸同源性为69.5％和74.8％.推断该毒株属于DHV-1,与变异株是不同的血清型;DHV/HB98与DHV-1 ZJ具有相近的遗传关系,推断DHV/HB98也为强毒株.     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定及VP1基因序列分析

为了解新型鸭肝炎病毒(N-DHV)的变异情况,本实验从广西、河南、山东临床发病鸭体内分离到3株病毒.通过RT-PCR检测为N-DHV.将分离株进行鸭胚传代培养,并测定鸭胚毒的ELD50为10-3.29/0.2 mL～10-465/0.2 mL.以1型和N-DHV阳性血清分别与分离株进行血清交叉中和试验,结果表明,Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-1)阳性血清对分离株无保护性.动物回归试验表明,分离株致死雏鸭的临床症状和病变与DHV-1相同,分离株的致死率为30％～70％.将分离株接种鸡胚,不产生任何病变,在鸡胚成纤维细胞中连续传5代后,细胞产生明显、规律的病变.扩增3株分离株的VP1基因,并进行氨基酸序列比对,结果表明3个分离株与DHV-C的同源性最高,与DHV-A的同源性最低,并存在氨基酸的插入和缺失.本实验表明3个分离株与韩国N-DHV属于同一血清型.     

鸭肝炎病毒浙江分离株全基因组测序及其VP1基因的序列分析

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术及RACE方法扩增得到鸭肝炎病毒(DHV)浙江分离株Z10的全基因(5',3'末端序列用RACE法扩增)及4株DHV分离株的VP1基因.结果表明,分离株Z10的全基因片段长7689 bp,有1个大的开放读码框(ORF),ORF位于626～7326位核苷酸,编码2249个氨基酸.Z10分离株全基因序列与GenBank登录的6株具有代表性的DHV核苷酸序列比对,同源性94.5%～98.4%;所测得的DHV分离株的VP1基因的序列与目前GenBank上发表的具有代表性的DHv-Ⅰ VP1基因进行比对分析,结果4株Ⅰ型DHV的VP1基因cDNA长度均为714 bp,编码238个氨基酸.4株DHV-Ⅰ之间VP1基因的核苷酸序列同源性为93%～99.7%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;与参考毒株VP1基因的核苷酸序列同源性为92.2%～100%,氨基酸序列同源性为95.0%～100%;表明各分离毒株的亲缘关系较近,属于同一基因群.     

新型鸭肝炎病毒的分离鉴定

对从广东地区流行鸭肝炎病例中分离到的1株病毒(命名为"GD株")进行了鸭胚(DE)传代培养.DE2～DE6代鸭胚毒的ELD50在10-5.17/0.2 mL～10-6.38/0.2 mL之间.DE6代毒回归雏鸭后可以产生与1型鸭肝炎病毒(DHV)相同的临床症状和解剖病变.鸭肝组织毒对4日龄、8日龄和16日龄雏鸭的LD50分别为10-6.5/0.5 mL、10-5.38/0.5 mL和10-4.83/0.5 mL.病毒对氯仿、乙醚和胰酶不敏感,能够耐受pH3.0酸处理,62℃30 min不能被完全灭活.病毒核酸类型鉴定为RNA病毒.生物学和理化学特性鉴定结果表明,GD株为强毒DHV.使用标准1型DHV阳性血清进行的交叉中和试验和交叉被动保护试验表明,GD株病毒在抗原性上与1型DHV无关.对DHv抗原相关的VP1基因序列分析和同源性比较表明,GD株与DHV-1的VP1核苷酸序列同源性为69.82%,氨基酸序列同源性为71.77%.GD株属于一种在我国流行的新型DHV强毒(暂命名为"CN-DHV").     

鸭肝炎病毒Js株VP1基因克隆及序列分析

摘要：通过PCR技术,从自行分离的鸭肝炎病毒Js株基因组中扩增出病毒衣壳蛋白VP1完整基因片段,并对该片段进行序列测定及分析。结果显示Js—VP1与DHV—A的VP1基因序列酸核苷酸同源性在92．7％～99．7％之间,与DHV—B的VP1基因序列酸核苷酸同源性在58．5％～58．7％之间,与DHV—C的VP1基因序列酸核苷酸同源性在61．6％-63．9％之间,分析表明Js株为鸭肝炎病毒基因A型,血清型分型为血清1型。进化树表明Js株与E53、X、R、AV2111株的亲缘关系较进。     

番鸭源鸭肝炎病毒CH12株的分离与全基因组序列分析

从浙江省某疑似鸭病毒性肝炎的发病番鸭群分离到1株鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus,DHV）CH12株,分离毒株经动物回归试验、ELD50测定、中和试验等确定为DHV-1（基因A型DHV）。通过RT-PCR方法对DHV CH12株的全基因组序列进行分段扩增并测序。结果表明,CH12株的全基因组长度为7690 bp（不包括PolyA）,包括626 bp的5′UTR,6747 bp的ORF和317 bp的3′UTR。CH12株各基因均与基因A型DHV毒株的序列相似性较高,与基因B型和基因C型DHV毒株的序列相似性较低。全基因组核苷酸、多聚蛋白、VP0、VP3、VP1、2C和3D基因的进化分析均显示,CH12株均与基因A型DHV在同一进化分支上,亲缘关系较近,属于基因A型DHV。     

一株广西新型鸭肝炎病毒的分离与初步鉴定

从广西南宁疑似鸭病毒性肝炎（DVH）的发病鸭群中分离到1株鸭肝炎病毒（DHV）,命名为GX—NN201201株,其鸭胚半数致死量（ELD50）为10-4.5／0．2mL。对分离毒株GXNN201201进行了DHVRT—PCR诊断、部分片段基因的克隆、序列测定与动物回归试验,结果表明：分离病毒的核酸能被韩国新型DHV特异性引物扩增,而不能被DHV-1的特异性引物扩增。GXNN201201分离株与韩国新型DHV及其他类韩国新型DHV之间的核苷酸序列同源性高达94．0％～98．9％,而与DHV-1疫苗毒株及台湾新型DHV之间的同源性则较低。遗传进化关系分析结果进一步表明该分离株与韩国新型DHV分布在同一分支上,并且与国内类韩国新型DHVGD株的遗传关系最近,属于基因C型DHV。人工感染的病死鸭可见典型的DVH临床特征,与临床发病表现相似。因此,初步确定GX—NN201201为广西新型DHV。     

一株鸭肝炎病毒的分离与鉴定

从山东某养殖场送检的疑似鸭病毒性肝炎病料中分离到一株病毒（暂命名为SD株）,分别用鸭胚、雏鸭进行传代和病毒含量测定,E1-E8代鸭胚适应毒的ELD50在1015^-5.0-10^-6.0／0．1mL之间,E1、E2代鸭肝组织毒的LD50分别为10^-5.5／0．1mL、10^-6.7／0．1mL。动物回归试验结果表明,SD株鸭胚适应毒E2对4日龄雏鸭的致死率为100％;雏鸭毒力测定试验结果表明SD株雏鸭肝组织毒E,代对12日龄内雏鸭具有较高致死率,12日龄后随着日龄的增大,雏鸭的死亡率逐渐降低;理化特性鉴定结果表明,SD株为无囊膜病毒,对脂溶剂（乙醚和氯仿）、胰酶、酸、热均不敏感,且无血凝性。血清交叉中和试验和交叉保护试验结果表明,在血清型上,SD株与DHV-1无关。通过对SD株与韩国N-DHVVP1基因的序列比对和进化树分析,发现二者同源性在99％以上。结果证实,SD株是新型鸭病毒性肝炎病毒,而不是DHV-1。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒VP1的原核表达与免疫学检测

本研究采用原核表达载体pCold-HF在大肠杆菌中表达I型鸭肝炎病毒（Duck hepatitis virus type Ⅰ,DHV-Ⅰ）弱毒株FC64株的VP1蛋白,经超声波裂解结果显示：VP1融合蛋白呈现可溶性表达。利用His-bindResin试剂盒纯化该产物,作为免疫原免疫小鼠,制备特异性抗体,进行免疫学检测。结果表明：该抗体与原核表达产物、DHV感染的SPF尿囊液总蛋白呈现特异性反应,这为DHV-Ⅰ快速诊断方法的建立奠定了基础。     

2007-2009年华南地区鸭肝炎病毒流行病学调查及分离株的VP1基因变异分析

为了分析华南地区鸭肝炎病毒（Duckhepatitisvirus,DHV）的遗传进化情况,本试验对2007～2009年华南地区各鸭场发病雏鸭进行DHV的病原学检测以及VP1基因扩增、克隆和测序,并运用生物信息学软件对VP1基因进行了序列分析。结果表明：所分离的R、SS1、ZJ株为DHV-A、VP1与DHV-A参考毒株核苷酸序列相似性分别为93．8％～100％、93．7％-99．6％、91．7％-98．9％,氨基酸序列相似性分别为94．5％～100．0％、94．1％-99．2％、95．0％-99．2％。其余15株DHV-C分离病毒株与台湾新型DHV核苷酸和氨基酸序列相似性均在71．4％～72．0％和78．2％-79．0％之间,与韩国新型DHV相似性在94．0％-95．1％和91．6％-93．3％之间,与国内分离的新型DHV相似性均在97．9％～100．0％和97．5％～100．0％之间。VPl氨基酸序列比对分析表明：VP1的高变区主要分布在46-64、95-149、180-223位,尤其是C’末端,存在点突变或连续变异。在第145-146位,15株新型DHV毒株此3株I型DHV多2个氨基酸（G和G）。小RNA病毒科的VPl蛋白中保守的RGD基序,在DHV中分别显示为SGD和QSD。结果表明,危害华南地区鸭场的DHV已经发生变异,且存在两种基因型毒株的流行。     

鸭肝炎病毒分子生物学研究进展

鸭病毒性肝炎(DVH)是由鸭肝炎病毒(DHV)引起雏鸭的一种以肝脏为主要病理变化的急性、高度致死性、接触性传染病。目前,该病在世界范围内流行,给养鸭业带来了巨大的经济损失,许多地区频频出现DHV免疫鸭群暴发鸭肝炎的报道,严重制约了养鸭业的健康发展。论文就鸭肝炎病毒的生物学特性与病毒基因组结构、分子生物学诊断方法、序列分析与基因分型、结构蛋白VP1、VP3等分子生物学研究进行综述,以期为合理制定鸭肝炎病毒的免疫方法与免疫程序提供参考,为鸭病毒性肝炎的综合防控提供依据。     

鸭肝炎病毒GD-B株生物学特性测定及多聚蛋白基因序列分析

根据Ⅰ型鸭肝炎病毒(DHV-I)基因组序列设计并合成引物,通过RT-PCR方法分段扩增鸭肝炎病毒GD-B株多聚蛋白基因并克隆测序,构建多聚蛋白核苷酸系统进化树,并测定GD-B株部分生物学特性.结果表明,GD-B株多聚蛋白基因核苷酸序列与DHV-Ⅰ型GFS99广东株同源性最高(99.5％),属Ⅰ型鸭肝炎病毒,其EID50...     

鸭病毒性肝炎病毒、禽流感病毒和新城疫病毒三重PCR诊断方法的建立及应用

根据GenBank中已登录的鸭病毒性肝炎病毒（DHV）、禽流感病毒（AIV）和新城疫病毒（NDV）的基因序列,设计了3对特异性引物,建立了DHV、AIV和NDV的多重PCR鉴别诊断技术,并对体系进行了优化和特异性、敏感性试验。结果表明,该体系所扩增的3种病毒基因片段大小分别为174bp（DHV）、264bp（AIV）和362bp（NDV）,且特异性、敏感性良好,能够分别检出1pg AIV、10pg DHV和10pg NDV的病毒RNA。对鸭临床样品的检测结果表明,该方法与病毒分离鉴定符合率90%以上,可用于临床样品的快速检测。     

鸭肝炎病毒GD株的全基因组序列测定与分析

为了给在分子水平上研究鸭肝炎病毒(DHV)的致病机理奠定基础,进一步丰富DHV的遗传变异和进化信息,试验采用RT-PCR方法分段克隆获得DHV-1 GD株的全基因组序列并进行序列分析。结果表明:GD株的基因组全长7 690 nt[不含Poly(A)尾],5’端和3’端非编码区长度分别为626 nt和314 nt,单一开放阅读框架(ORF)为627～7 376 nt,编码2 249个氨基酸;GD株与DHV-1参考株比较,其核苷酸和氨基酸同源性分别为94.8%～99.7%和97.7%～99.6%;与中国台湾和韩国新型DHV(DHV-N)相比同源性分别为72.7%～73.2%和81.8%～83.4%;GD株与DHV-1参考株遗传进化关系较密切,处于同一分支,而与DHV-N遗传关系较远,处于不同分支。     

Identification and molecular analysis of the highly pathogenic duck hepatitis virus type 1 in Hubei province of China

Duck hepatitis virus types 1 (DHV-1) JX strain was isolated from infected ducklings with clinical symptoms from Hubei province of China. These isolated strains showed high pathogenicity to both duck embryo and duckling in Duck embryo neutralization assay and animal infection experiment. The complete genome of JX strain was sequenced. Comparative genome analysis with other available strains in GenBank indicated that JX strain shared 94–99% similarity at the nucleotide level and 95–99% at amino acid level with other DHV-1 strains. Sequence results showed that mutations of nucleotide and amino acid were mainly distributed in VP1 genes. Our result implied that the VP1 probably was the major virulent determinant of DHV-1. In addition, 13 DHV-1 strains from different area were analyzed in phylogeny and they can be grouped into four distinct lineages. The new-identified JX strain was grouped into one lineage with A66 and C80 strains, which were also isolated from China.     

Identification and molecular analysis of the highly pathogenic duck hepatitis virus type 1 in Hubei province of China

Duck hepatitis virus types 1 (DHV-1) JX strain was isolated from infected ducklings with clinical symptoms from Hubei province of China. These isolated strains showed high pathogenicity to both duck embryo and duckling in Duck embryo neutralization assay and animal infection experiment. The complete genome of JX strain was sequenced. Comparative genome analysis with other available strains in GenBank indicated that JX strain shared 94-99% similarity at the nucleotide level and 95-99% at amino acid level with other DHV-1 strains. Sequence results showed that mutations of nucleotide and amino acid were mainly distributed in VP1 genes. Our result implied that the VP1 probably was the major virulent determinant of DHV-1. In addition, 13 DHV-1 strains from different area were analyzed in phylogeny and they can be grouped into four distinct lineages. The new-identified JX strain was grouped into one lineage with A66 and C80 strains, which were also isolated from China.