高粱Na~+转运蛋白基因SbSKC1的克隆及其在烟草中的抗盐功能鉴定

钠离子转运蛋白基因在植物抵御逆境胁迫中起重要作用,本研究克隆了高粱钠离子转运蛋白基因SbSKC1(XM_002457691.1),其完整开放阅读框包含1497个核苷酸,编码498个氨基酸残基。氨基酸序列比对及进化树分析表明,SbSKC1与玉米(Zea mays)LOC100382359(NP_001162576.1)具有高度相似性。构建pSH-SbSKC1植物表达载体,利用农杆菌介导法将SbSKC1转入烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthin)。转基因植株经PCR验证后进行300 mmol L~(–1)NaCl胁迫处理,转基因植株的存活率高于野生型,其根长显著高于野生型,而且转基因烟草保持了较高的钾钠离子比。盐胁迫后,转基因烟草的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型,而过氧化氢(H_2O_2)含量比野生型烟草低37.7%。根据以上结果推断,过量表达SbSKC1基因能够提高烟草的抗盐性。     

低温胁迫对转高山离子芥CbPLDα、CbPLDβ基因烟草抗氧化酶系统的影响

为研究高山离子芥Cb PLDα、Cb PLDβ转基因烟草对低温胁迫的生理响应,采用4、0℃低温胁迫,揭示了Cb PLDα、Cb PLDβ基因在植物抵抗低温中的作用。结果表明:随着4℃胁迫时间的延长,野生型烟草和转基因烟草的丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)活性均呈增加趋势,过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性则呈先上升后下降趋势。0℃胁迫条件下,野生型烟草和转基因烟草的丙二醛(MDA)含量和过氧化氢酶(CAT)活性以及抗坏血酸过氧化物酶(APX)均先上升后下降,过氧化物酶(POD)和超氧化物歧化酶(SOD)活性呈增加趋势。Cb PLDα、Cb PLDβ转基因活性烟草的MDA含量显著低于野生型烟草植株,而抗氧化酶活性显著高于野生型烟草对照,且转基因烟草对0℃低温胁迫的响应更积极敏感。Cb PLDα、Cb PLDβ基因的导入提高了烟草幼苗的抗低温能力。     

准噶尔无叶豆EsDREB2B基因在烟草中的抗逆功能分析

DREB(dehydration responsive element binding protein)转录因子在植物响应非生物胁迫上具有重要作用,是颇具潜力的植物抗逆育种候选基因。本研究旨在通过烟草体系,验证前期从准噶尔无叶豆中克隆的Es DREB2B基因在种子萌发和成苗成长阶段的抗逆功能,并初步探究其调控的下游靶基因。结果表明:转基因株系在干旱、高盐、冷和热胁迫处理下的萌发率都高于野生型烟草,其中盐和热胁迫下萌发率差异尤为显著;两月大转基因烟草与野生型植株进行干旱、高盐、冷和热胁迫处理后,转基因较野生型植株叶片萎蔫,黄化和伤害程度较轻,在热胁迫下差异最为显著;恢复培养后,大多野生型烟草表现为枯死状态,转基因植株则叶片萎蔫减轻并开始生长,并且转基因烟草存活率显著高于野生型,均达到了野生型的3~4倍。ERD10B和Hsp70基因在四种胁迫后的转基因烟草中的表达量均较野生型高,Hsp90在热胁迫下较野生型表达量升高,而Mn SOD,P5CS等基因的表达量变化不显著。以上结果表明,Es DREB2B基因能提高烟草抗干旱、高盐、冷和热胁迫的能力,是具有潜力的抗逆分子育种候选基因。     

烟草转录因子NtNAC080在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

NAC作为植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育、衰老及胁迫响应等生物学过程。为探究烟草NtNAC080在非生物胁迫响应中的功能,利用qRT-PCR技术分析了不同胁迫处理下NtNAC080的表达模式,结果表明,NtNAC080的表达受干旱、高盐胁迫以及ABA、MeJA和SA激素的诱导;以NtNAC080基因的敲除突变体及野生型(K326)烟株为材料,分析敲除株系在高盐和干旱胁迫下抗逆表型。试验表明,与野生型相比,2个敲除株系的耐盐抗旱能力均明显增强;干旱和盐胁迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量显著高于野生型,而丙二醛含量显著低于野生型。相反地,异源表达NtNAC080的转基因拟南芥与野生型(Col-0)相比对盐和干旱的耐受性明显减弱。qRT-PCR分析发现在干旱和盐处理后胁迫相关基因(NtDREB1A、NtKAT2、NtNHX1等)在NtNAC080基因敲除株系中表达水平显著高于野生型。以上结果表明,NtNAC080在烟草的非生物胁迫响应中起负调控作用,这可能是通过调控抗氧化酶活性及胁迫相关基因的表达来实现的。     

转大豆GmPRP和SbPRP基因烟草对非生物胁迫耐受能力分析

为实现PRPs基因在植物抗逆基因工程中的应用,将大豆中的2个脯氨酸富集蛋白基因GmPRP和SbPRP构建到植物表达载体pRI101上,通过叶盘法转化烟草。共获得GmPRP阳性转基因烟草2株,SbPRP阳性转基因烟草4株。对转基因烟草植株进行高盐、干旱和低温胁迫处理。结果表明,高盐处理后,SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量和可溶性糖含量分别显著和极显著高于野生型,丙二醛含量极显著低于野生型。干旱处理对GmPRP和SbPRP转基因烟草脯氨酸含量、可溶性糖含量和丙二醛含量的影响均不明显。低温处理后,GmPRP和SbPRP转基因烟草的脯氨酸含量均极显著高于野生型,丙二醛含量均低于野生型。由此推测SbPRP可以提高转基因烟草的耐盐性和耐寒性,GmPRP可以提高转基因烟草的耐寒性,为后续SbPRP和GmPRP的应用奠定基础。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因的异源表达增强了烟草对干旱、盐及叶斑病的抗性

为明确一年生草本盐生植物费尔干猪毛菜(Salsola ferganica Drob.)病程相关蛋白基因SfPR1a (GenBank登录号为JQ670917)是否参与了植物对逆境胁迫的响应,采用qRT-PCR检测了该基因在不同组织部位和脱落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前体(ACC)等相关激素胁迫及NaCl处理下的表达规律,同时对转基因烟草在盐、旱及丁香假单胞菌等胁迫下的抗性进行了鉴定。结果显示, SfPR1a基因在费尔干猪毛菜根中的表达量显著高于茎叶中,且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的积极诱导;干旱胁迫下,转基因烟草的丙二醛(MDA)含量显著低于野生型烟草,显示出较强的抗旱表型;盐胁迫下,异源表达SfPR1a的转基因烟草幼苗生长显著优于野生型烟草;丁香假单胞菌攻毒后的转基因烟草叶片呈现严重的坏死反应,但植株的整体抗性表型显著优于野生型烟草;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于植物细胞质外体空间。以上结果表明,费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因参与了植物对非生物及生物胁迫的抗性。     

过表达二穗短柄草BdDREB1-like基因提高烟草的抗氧化能力

为了研究二穗短柄草BdDREB1-like基因在转基因烟草中的功能,克隆了该基因,并进行了生物信息学分析。该基因开放阅读框684 bp,编码228个氨基酸,编码蛋白的分子量为24.178 ku,只含有一个典型的AP2结构域,属于AP2/EREBP(APETALA2/ethylene-responsive element binding protein)超家族的DREB家族。多序列比对与进化分析显示它与黑麦ScCBFI的亲缘关系较近。亚细胞定位分析表明,BdDREB1-like基因定位于细胞核。将其构建到植物表达载体上,并通过农杆菌介导法转入烟草中。PCR和RT-PCR筛选鉴定显示BdDREB1-like基因不仅整合到烟草基因组中而且还能稳定表达。过氧化氢胁迫条件下,转BdDREB1-like基因烟草幼苗具有较高的发芽率。为了进一步确定BdDREB1-like基因与氧化胁迫的关系,又对一个月大的转基因烟草进行氧化胁迫(MV,甲基紫精)处理。结果表明,在正常生长条件下,T3转基因株系除了SOD含量外,测定的其他各种生理指标均与野生型无显著差异,T1转基因株系中只有POD和叶绿素含量与野生型中的有显著差异;而在氧化胁迫处理条件下,转BdDREB1-like基因的烟草植株相对于野生型具有较高的过氧化氢酶、过氧化物酶、超氧化物歧化酶和叶绿素的含量和较低的丙二醛和过氧化氢含量。这些结果表明,过表达BdDREB1-like基因增强了植物对氧化胁迫的耐受性。     

水稻ABA生物合成基因OsNCED3响应干旱胁迫

9-顺-环氧类胡萝卜素双加氧酶(NCED)是植物内源脱落酸(ABA)生物合成的限速酶,由NCED基因家族编码,水稻中响应干旱胁迫并以此调节ABA水平的OsNCED基因尚见未报道。本研究发现在水稻已报道的5个OsNCED基因中,OsNCED3的表达受干旱胁迫诱导,复水处理后其表达快速下调,其表达模式与此过程中内源ABA含量变化趋势一致。OsNCED3的RNAi转基因植株表现为干旱敏感,且生物量下降;而过量表达OsNCED3基因增加了水稻的抗旱性。干旱胁迫下过量表达OsNCED3的转基因株系有较高的ABA水平,同时其抗氧化酶超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,以及逆境响应基因脱水素蛋白(Dehydrin)和胚胎发育晚期丰富蛋白(LEA)转录表达均高于野生型。下调表达OsNCED3的转基因株系则呈现相反的变化趋势。因此,OsNCED3是水稻干旱胁迫响应基因,调节了干旱环境下ABA水平和抗逆性。     

水稻OPR基因的克隆及其在烟草中抗镉性分析

12-氧-植物二烯酸还原酶是茉莉酸生物合成途径的一个关键性酶,广泛参与植物生长过程中生物与非生物胁迫。本研究主要探讨OPR基因在植物非生物胁迫中的作用。从水稻中克隆了OPR基因,该基因的cDNA编码区全长1 203 bp,编码400个氨基酸,将其连接到植物表达载体pSH 737上,通过农杆菌介导的方法,将含有目的基因的载体遗传转化烟草,获得31株转基因植株。选取生长状况基本一致的8株不同转基因株系和4株野生型烟草,在非生物胁迫下,用300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液浇灌处理,观察植株生长并对抗镉能力进行初步分析;选取T 1代3个转基因株系(TP 7、TP 8和TP 12)和野生型烟草的种子,放入含有3个不同浓度CdCl_2溶液的滤纸上萌发进行镉胁迫并统计发芽率。在300μmol·L~(-1) CdCl_2溶液胁迫15 d后,种子发芽率比野生型高40%以上,转基因烟草的抗氧化酶活性显著高于野生型,丙二醛的含量显著低于野生型植株。利用RT-PCR方法分析相关基因表达情况,结果表明,在Cd~(2+)胁迫下,OPR,Snakin-2和GRP-2基因表达均上调,因此推测OPR基因的高表达是其具有高抗性的主要原因。OPR基因的过量表达使烟草提高了对重金属Cd~(2+)的抗逆性能力。     

Atfad8叶绿体转基因烟草对冷胁迫的生理响应

摘 要：采用5℃低温处理,研究Atfad8叶绿体转基因烟草对冷胁迫的生理响应。结果表明:随着低温胁迫时间的延长,烟草幼苗的丙二醛(MDA)含量和过氧化物酶(POD)活性呈增加趋势,超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性先上升后下降。 Atfad8叶绿体转基因烟草的MDA含量明显低于对照植株,而抗氧化酶活性明显高于对照植株。Atfad8基因的导入提高了烟草幼苗的耐冷害能力。     

马铃薯StWRKY15在转基因烟草的耐寒性分析

WRKY转录因子在植物的正常生长发育以及逆境生长过程中起着重要作用.本研究以4℃作为低温胁迫水平,对'青薯9号'马铃薯组培苗进行胁迫处理.通过RT-qPCR技术对马铃薯的5个WRKY转录因子基因进行表达分析,筛选出对低温响应的基因,构建表达载体遗传转化烟草,初步分析基因的功能.结果 显示,4℃低温胁迫下,马铃薯中的StWRKY15基因上调显著(P＜0.05);STRING预测分析StWRKY15编码蛋白的互作蛋白,主要包括StWRKY72编码蛋白、StGRAS6编码蛋白、c2结构域QUIRKY蛋白;通过双酶切方法成功获得重组质粒PRI101-StWRKY15;冻融法介导转化烟草,过表达StWRKY15基因显著提高了转基因烟草的耐寒性.4℃低温胁迫下,StWRKY15基因的过表达明显增加了脯氨酸、可溶性糖及总蛋白含量,降低了丙二醛含量;胁迫10d时,转基因烟草的长势优于野生型烟草.综上所述,可推断出StWRKY15对低温胁迫有响应,在逆境胁迫下可减轻植株受到的损伤,在一定范围内增强转基因烟草的耐寒性.本研究为进一步了解马铃薯WRKY转录因子的功能提供了理论依据.     

转PvP5CS1基因拟南芥植株对干旱和盐胁迫的反应

为探索普通菜豆脯氨酸合成酶基因P5CS1在植物渗透胁迫中的作用,本研究应用农杆菌介导法,将PvP5CS1基因转入拟南芥,获得6株阳性转基因株系;通过检测转基因植株与野生型植株在干旱和盐胁迫下种子发芽率,幼苗脯氨酸含量、株系电导率、相对根长和成株死亡率,分析了PvP5CS1基因的表达对改善拟南芥抗渗透胁迫的效应。结果表明,在150 mmol L^-1 NaCl和150 mmol L^-1甘露醇渗透胁迫下,转基因植株平均相对发芽率分别是野生型的1.6倍和1.62倍;150、250 mmol L^-1甘露醇和150 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因拟南芥植株平均脯氨酸含量分别是野生型的2.68、1.30和1.30倍;平均相对电导率分别是野生型植株的85%、77%和85%;平均相对根长分别是野生型植株的1.2、1.3和1.2倍;300 mmol L^-1 NaCl处理下,转基因植株的平均死亡率为42%,显著低于野生型(90%)(P<0.05);干旱胁迫下,转基因植株的平均死亡率为56%,显著低于野生型(70%)(P<0.05),说明PvP5CS1基因在拟南芥中的表达明显改善了转基因植株的抗旱性和耐盐性。     

转枯草芽孢杆菌纤溶酶基因对烟草氧自由基和保护酶系统的影响

除个别时期外,转枯草芽孢杆菌纤溶酶(Bacillus subtilis fibrinolytic enzyme,BSFE)基因及其信号肽和前肽序列烟草叶、茎、根氧自由基含量、超氧化物歧化酶活性均显著高于野生型烟草植株,抗坏血酸过氧化物酶活性也较野生型烟草植株高,但二者差异不显著。推测氧自由基含量的变化与BSFE的蛋白水解活性有关;超氧化物歧化酶和抗坏血酸过氧化物酶活性变化可能与该转基因烟草植株对外源BSFE基因表达和产物累积产生的逆境适应有关。     

转GhMAPK基因烟草植株的获得及其耐盐性分析

促丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是普遍存在于真核生物中的一类保守的丝氨酸/苏氨酸类蛋白激酶,在植物生长发育和多种生物、非生物胁迫信号转导过程中起着关键作用.GhMAPK是首个在棉花(Gossypium hirsutum)中克隆的MAPK基因,为了进一步研究其功能,本研究利用农杆菌介导法将GhMAPK转入本氏烟草,Northern杂交和Western杂交分析证实,在转基因植株中GhMAPK能够高效表达.烟草耐盐性分析显示,在高盐胁迫下,转基因植株种子萌发率高于野生型烟草,苗期转基因株系能正常生长;进一步试验证明,转基因植株中的抗氧化酶(POD、SOD)活性也有明显提高.这些结果表明,GhMAPK过表达的转基因植株可以通过有效清除活性氧来提高植物对盐胁迫的抗性,GhMAPK可能参与了植物高盐胁迫信号传递过程.     

转入反义ScP5CS基因烟草植株对PEG和NaCl处理的反应

以转入甘蔗脯氨酸合成酶基因ScP5CS反义片段的转基因烟草与野生型烟草为材料,研究PEG6000与NaCl处理对转基因与野生型烟草植株生长及其T0代种子萌发的影响。结果表明,在17mmol/L NaCl与1%PEG6000胁迫下转入ScP5CS反义基因片段的烟草植株矮小,叶片容易发黄,根系发育迟缓,根长缩短;转基因烟草T0代种子在200mmol/L NaCl胁迫时其发芽率明显受到抑制,并随着盐胁迫处理时间达到第55天时,在50mmol/L NaCl胁迫下其叶片严重黄化,而野生型与转入空载体株系则相反。PEG6000处理对转基因烟草T0代种子萌发影响不大。可见,甘蔗ScP5CS基因在烟草中的反义表达,部分抑制了烟草P5CS基因的活力。     

过表达截形苜蓿液泡膜H~+-PPase基因提高马铃薯的抗旱性

本研究以过表达截形苜蓿类型ⅠH~+-焦磷酸酶编码基因MtVP1的转基因马铃薯为材料,对其抗旱性进行了检测。结果显示:(1)在正常生长条件下,与野生型植株相比,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量、丙二醛含量和超氧化物歧化酶活性差异均不显著,而脯氨酸含量均高于野生型植株,其中OE2株系脯氨酸含量显著高于野生型植株。随着干旱胁迫的持续,两个转基因株系的叶片相对含水量、叶绿素含量的下降趋势平缓,其含量均显著高于野生型对照,且两个转基因株系的脯氨酸含量和SOD活性显著高于野生型对照,而转基因株系的MDA含量显著低于野生型植株。(2)转MtVP1马铃薯表现出表皮毛增多的新表型,茎和叶表面的表皮毛明显比野生型植株多。以上结果表明,Mt VP1基因的过表达提高了马铃薯的渗透调节能力,从而增强了马铃薯的抗旱性;还表明植物类型ⅠH~+-焦磷酸酶基因可能参与调控其他的代谢通路,具有更复杂的生理功能。     

超表达OsPup1基因可提高烟草低磷胁迫及减轻铝毒性

磷是植物生长的必需元素之一,对植物生长发育、生理代谢、产量与品质形成起着十分重要作用。研究耐低磷植物,有助于提高作物产量,降低化肥用量,提高化肥利用率。本研究通过在不同供磷条件下对转OsPup1基因植株的形态进行研究,阐明该基因在不同供磷水平对植株生长特性的影响。通过农杆菌介导法将OsPup1基因遗传转化烟草,经抗性筛选和PCR鉴定获得转基因植株。对不同转基因烟草株系,设置4个磷水平处理进行耐磷性及铝毒性分析。结果显示,转OsPup1基因烟草以0.25 mmol/L KH2PO4作为低磷处理较适合,与野生型植株相比,转基因株系植株根系数量增多,主侧根增加。在低磷胁迫及三氯化铝(Al Cl3)处理条件下转OsPup1基因烟草的生长情况明显优于野生型植株。说明转OsPup1基因对环境中的低磷胁迫逆境能产生明显应答,初步推断OsPup1基因的表达,具有增加植株根系,改善植株生长状态和延缓铝毒的生物学功能。本研究表明,OsPup1基因在介导植株不同供磷水平下的根叶形态建成发挥着重要作用。     

氮素缓解花生干旱胁迫的生理和转录调控机制

干旱胁迫下氮素施用对植物生长发育具有重要的影响。为明确氮素提高花生抗旱性的生理和转录调控机制,本研究对施氮、干旱及旱氮同存处理下的花生生理指标和根系转录组进行了测定。结果表明,旱氮同存处理提高了干旱胁迫下花生生物量和叶片相对含水量。施用氮肥增加了干旱胁迫下花生根系的总酚和类黄酮含量,提高其过氧化物酶(POD)和过氧化氢酶(CAT)活性,降低其丙二醛(MDA)含量,提高花生抗旱性。转录组分析表明,施用氮肥产生5396个差异表达基因,这些基因主要参与谷胱甘肽代谢、氮代谢和碳代谢相关过程及应激和防御反应。干旱处理和旱氮同存处理下,次生代谢物生物合成、运输和分解代谢及碳水化合物运输和代谢这两类功能差异表达基因富集。旱氮同存处理下酚类代谢物质相关的3种途径中有51个差异基因上调表达, 207个基因下调表达。由此表明,施用氮肥通过调控花生次生产物代谢、碳水化合物代谢等途径提高干旱胁迫下花生植株的抗氧化能力,从而提高花生的抗旱性。     

玉米胁迫诱导表达基因ZmSNAC1的功能分析

NAC转录因子是具有多种生物功能的植物特异转录调控因子,在植物生长发育、器官建成、激素调节和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用。我们之前分离得到1个受干旱、盐、冷等非生物逆境胁迫和植物激素ABA诱导显著上调表达的玉米NAC家族成员ZmSNAC1,过表达转基因株系在苗期的耐脱水能力较野生型株系明显提高。在此基础上,本研究进一步对ZmSNAC1过表达转基因株系在植株生殖生长发育时期的抗旱性和耐盐性进行功能鉴定。结果表明,在干旱胁迫条件下,野生型株系相比转基因株系较存活率提高50%~52%,相对电导率降低17%~21%,叶绿素含量提高36%~47%,脯氨酸含量提高了17%~23%;在300mmol L^-1 NaCl胁迫条件下,转基因株系的存活率提高36~40%。ZmSNAC1可能作为一个正向调控因子在逆境胁迫信号转导过程中发挥重要作用。     

amiRNA技术沉默C-3氧化酶编码基因StCPD对马铃薯抗旱性的影响

CPD (constitutive photomorphogenesis and dwarf)基因编码C-3氧化酶, 为油菜素内酯(brassinosteroid, BR)生物合成途径中的限速酶, 在植物响应逆境胁迫过程中具重要调控作用。本研究利用人工microRNA (artificial microRNA, amiRNA)技术, 构建马铃薯CPD基因(StCPD)的干扰表达载体pCPB121-amiRcpd, 通过根癌农杆菌介导法将其转入马铃薯栽培品种“紫花白”, 获得转基因植株(Ci1~Ci5), 其中Ci1和Ci3的StCPD基因干扰程度分别为78%和90%。基因组织表达特异性分析表明, StCPD在马铃薯试管苗叶片中表达量最高, 是茎和根中表达量的3.05倍和1.65倍。转基因植株株高、茎粗、根长、鲜重及薯的大小和鲜重等指标均较非转基因(NT)植株显著下降, 表明StCPD基因干扰表达后, 植株的长势明显受到抑制。模拟干旱胁迫处理下, 转基因植株叶片中丙二醛(malondialdehyde, MDA)含量显著高于NT植株, 而脯氨酸含量显著低于NT植株。转基因和NT马铃薯中, StCPD基因的表达量、MDA和脯氨酸含量均显著高于对照; 且随着胁迫处理时间延长, 基因表达量呈持续增强趋势, MDA和脯氨酸含量随之增加。结果表明, StCPD基因干扰表达能明显降低马铃薯对干旱胁迫的抵抗能力, 为进一步研究BR对马铃薯生长发育和对干旱胁迫的响应奠定了基础。