红色荧光蛋白基因在转基因唐鱼中的表达

在成功构建斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子转红色荧光蛋白基因唐鱼Tanichthys albonubes可遗传品系的基础上,作者采用荧光显微镜观察和用RT-PCR技术对外源基因在唐鱼体内的表达情况进行检测。结果表明:红色荧光蛋白基因在F3代唐鱼体内的表达最早出现在受精后19 d,多数个体的表达集中在25³0日龄,最晚的表达个体出现在35日龄;红色荧光蛋白的表达主要分布于肌肉、心脏、肝脏、脾、鳃、鳔、肠和性腺,在肌肉、肝脏、鳃组织中的相对表达量较其它组织高,而在表皮和鳍条中没有检测到外源基因的表达。虽然红色荧光蛋白在转基因唐鱼后代出现表达迟缓、表达特异性改变的现象,但在外源基因后代中的遗传和表达在总体上还是稳定的,有望培育出转红色荧光蛋白基因唐鱼品系。     

红色荧光蛋白基因在转基因唐鱼中的表达

在成功构建斑马鱼肌球蛋白轻链2启动子转红色荧光蛋白基因唐鱼Tanichthys albonubes可遗传品系的基础上,作者采用荧光显微镜观察和用RT-PCR技术对外源基因在唐鱼体内的表达情况进行检测。结果表明:红色荧光蛋白基因在F3代唐鱼体内的表达最早出现在受精后19 d,多数个体的表达集中在25~30日龄,最晚的表达个体出现在35日龄;红色荧光蛋白的表达主要分布于肌肉、心脏、肝脏、脾、鳃、鳔、肠和性腺,在肌肉、肝脏、鳃组织中的相对表达量较其它组织高,而在表皮和鳍条中没有检测到外源基因的表达。虽然红色荧光蛋白在转基因唐鱼后代出现表达迟缓、表达特异性改变的现象,但在外源基因后代中的遗传和表达在总体上还是稳定的,有望培育出转红色荧光蛋白基因唐鱼品系。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎研究

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胞（80.56%）相比无显著差异（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,能够成功克隆出转基因胚胎,并获得转基因囊胚。     

利用体细胞核移植技术生产表达红色荧光蛋白的猪转基因克隆胚胎（摘要）

[目的]为生产转基因克隆猪奠定基础。[方法]以反转录病毒转染的带有红色荧光蛋白（RFP）基因的猪胎儿成纤维细胞作为核移植的核供体,利用体细胞克隆技术研究红色荧光蛋白克隆胚胎体外发育情况。[结果]RFP转基因细胞的融合率为83.87%,与未转基因细胸（80.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚体外囊胚率为8.67%,与未转基因细胞组（6.56%）相比无显差异著（P〉0.05）;RFP转基因体细胞重构胚移植于15头受体后,尚无受孕个体。[结论]利用转红色荧光蛋白基因的细胞为供体细胞,并成功地克隆出转基因胚胎。     

卡那霉素在筛选转基因番茄后代中的应用

以中蔬5号番茄种子为试验材料,进行卡那霉素梯度浸种试验,确定卡那霉素筛选的最佳浓度,在此基础上,用浸种法、浇灌法、叶片涂抹法和叶盘培养法4种方法对T1转基因番茄植株(含有nptⅡ基因)进行筛选。同时用PCR检验叶片涂抹法和叶盘培养法的筛选准确性。结果显示,卡那霉素的最佳筛选浓度为100 mg/L;叶片涂抹法和叶盘培养法较适合大规模的筛选,根据PCR验证结果,两种方法的准确度可达90%。     

红色荧光转基因五指山猪大叶性肺炎的病理学观察

采用病理解剖学和病理组织学技术对1例疑似大叶性肺炎而死亡的红色荧光转基因五指山猪进行病理诊断。结果表明,病猪主要病变体现在肺脏,肺充满整个胸腔,表面附有絮状渗出物,呈灰红色,局部可见暗红色的出血斑,质硬如肝,切面干燥,投入水中完全下沉;显微镜下主要呈现大叶性肺炎的红色肝变期和灰色肝变期的病变特点,心、肝、肾、脾、胰腺等其他器官充血,可见轻微的细胞变性,结合其临床症状,确诊为大叶性肺炎。此外,死亡红色荧光转基因五指山猪的各组织器官呈红色,颜色深浅因不同器官而有差异。这将为进一步探讨红色荧光转基因猪的研究提供病理学基础资料。     

以PCR鉴定转基因番茄植株的微量DNA提取方法

微量DNA提取法是目前以PCR法鉴定转基因番茄植株T1代单株幼苗的一种简便、快速、有效的方法.该方法需约1 h即可完成植物DNA的提取,样品用量仅为30-100mg,产量可达30-80μg/g,粗提DNA(溶于10μlTE缓冲液)不必经过纯化,用TE缓冲液稀释5-10倍即可直接用于PCR分析.     

双抗TMV和CMV转基因番茄后代的遗传分析

通过对转ＴＭＶ和ＣＭＶ双价外壳蛋白基因番茄Ｔ１代群体和Ｔ２代株系进行ＰＣＲ及ＰＣＲ－Ｓｏｕｔｈｅｒｎ鉴定，并分别进行温室及田间抗病毒试验，结果表明，Ｔ１代工程番茄植株中确有ＣＭＶ—ＴＭＶ双价外壳蛋白基因的遗传和分离，其遗传行为符合显性单基因的孟德尔遗传。Ｔ２代部分株系ＣＭＶ—ＴＭＶ双价ＣＰ基因已获得稳定遗传，共获得了３个遗传稳定的番茄株系。     

鮰爱德华氏菌的红色荧光蛋白标记及其应用

为研究鮰爱德华氏菌与宿主的相互作用关系,本研究构建带有红色荧光蛋白基因的pM DmC herry表达载体,通过电击转化法将载体成功导入鮰爱德华氏菌zbl141菌株中,获得了红色荧光蛋白标记的鮰爱德华氏菌菌株。在倒置荧光显微镜下观察,重组鮰爱德华氏菌显示特异性红色荧光。稳定性检测结果表明,标记菌株传至28代,重组质粒稳定率仍为100%。用标记菌株感染斑马鱼仔鱼后,能在激光共聚焦显微镜下实时观察到细菌在鱼体内的分布情况;标记菌株体外感染小鼠巨噬细胞后,也能观察到病原菌与巨噬细胞的相互作用情况。说明标记菌株具有良好的特异性和可视性,为鮰爱德华氏菌对宿主的致病性研究提供了一种良好的生物材料。     

转红色荧光蛋白基因唐鱼的遗传分析和生物学研究

转红色荧光蛋白基因唐鱼(Tanichthys albonubes)测交获得实验鱼,以表达红色荧光蛋白为表型性状,采用点杂交和遗传学分析相结合的方法,研究外源基因的遗传传递规律,并对转基因唐鱼和非转基因唐鱼的生长和繁殖等方面进行了比较.结果显示:测交后代表型的分离规律基本符合经典的孟德尔单显性基因遗传模式,外源基因属于单位点整合,测交后代中没有发现沉默整合个体;实验鱼的生长和可量性状对比实验表明,转基因唐鱼和非转基因唐鱼在仔鱼期到性成熟之间,生长速度无显著差异,性成熟个体的外部形态除体色外也无差别,繁殖力方面基本无显著差异.本研究结果表明了培育转红色荧光蛋白基因唐鱼纯系的可行性;同时在生长、繁殖方面的研究结果为评价转基因唐鱼的生态安全奠定了基础.     

以PCR鉴定转基因番茄植株的微量DNA提取方法

微量DNA提取法是目前以PCR法鉴定转基因番茄植株T1代单株幼苗的一种简便、快速、有效的方法。该方法需约1h即可完成植物DNA的提取，样品用量仅为30-100mg，产量可达30-80μg／g，粗提DNA(溶于10μlTE缓冲液)不必经过纯化，用TE缓冲液稀释5-10倍即可直接用于PCR分析。     

转基因番茄定性PCR检测

根据番茄内参基因PG和转基因番茄中常见的CaMV 35S启动子、NOS终止子、npt-Ⅱ基因、反义EFE基因等的特异性结构,设计5对定性PCR引物,经定性PCR检测,可以准确地检测出目的基因,说明这5对引物具有较高的特异性和准确性,可以用于转基因番茄及其产品的定性PCR检测。     

生产转基因五指山小型猪重构胚条件优化

利用体细胞核移植技术是得到具有优良特征及抗病性五指山小型猪快速有效方法,因此将外源基因安全高效导入到供核细胞至关重要。利用不同转染试剂、转染方法对转染效率进行研究,确定G418筛选浓度。同时利用体细胞核移植技术生产转单体红色荧光蛋白重构胚。结果表明,使用U-023细胞核电转程序能有效介导质粒pCX-mRFP1转染猪耳成纤维细胞,转染率可达到83.33%。确定G418最佳筛选浓度为200μg.mL-1。利用转基因细胞作为核供体生产重构胚卵裂率是83.08%(221/266),囊胚率是11.65%(31/266)。研究结果为生产表达单体红色荧光蛋白五指山小型猪提供参考,从而为人类疾病发病机理研究以及生产人类疾病模型动物奠定了基础。     

花粉管通道法转基因棉花后代筛选鉴定

通过对棕色棉BC05叶片进行Kan浓度梯度涂抹实验,确定了Kan涂抹筛选的最佳浓度为3.0 g/L,最佳观察时间为涂抹第5天。对Kan抗性植株进行PCR鉴定表明,Kan涂抹筛选可基本准确的鉴别出转基因材料与非转基因材料,但目标基因是否成功整合还必须进行PCR鉴定,田间卡那霉素筛选结合PCR分子鉴定是转基因棉花后代大规模群体筛选的有效方法。     

单体红色荧光蛋白基因DsRed2的克隆及其原核表达

从原始质粒p DsRed2-1中分离红色荧光蛋白基因DsRed2、构建原核表达载体p GEX4T1-DsRed2,进行了原核表达。结果表明:目标DNA序列含有由678 bp构成的开放阅读框(ORF),编码由225个氨基酸构成的蛋白(红色荧光蛋白,简称RFP2)。与参考序列相比,目标DNA序列在其ORF内存在一个单碱基的同义突变,所编码的目的蛋白氨基酸序列不变。DsRed2基因在常用的表达菌株BL21(DE3)和克隆菌株DH5α中都能够表达出目的蛋白RFP2,使菌落呈现红色。在BL21(DE3)中,在1~5 h内,随诱导时间的延长,RFP2的表达量迅速增加,此后增加不明显。在原核细胞中表达出的RFP2,大多以难溶性包涵体形式存在,仅少量溶于细胞质中,但都能正常显示出红色。RFP2为单体红色荧光蛋白,且在自然光下即可激发出红色荧光;DsRed2作为报告基因,可以非常简单、方便地区分出阳性和假阳性菌落。     

利用RFP标记进行水稻籼粳杂种偏分离的遗传分析

为了研究水稻籼粳杂种偏分离的遗传基础,用转化红色荧光蛋白(RFP)的7个粳稻株系与籼稻杂交,以整合在不同基因组位点的RFP为可视遗传标记,对F1花粉及F2植株进行遗传分析。根据‘7F5’转基因系的研究结果,在粳稻‘日本晴’和籼稻‘9311’杂交的遗传背景中,水稻基因组chr02:33465170位置附近存在一个花粉偏分离位点。‘9A2’转基因系组配的籼粳杂种产生1∶1(RFP+∶RFP-)比例的花粉,并且其F2植株群体发生偏分离,说明相应RFP位点(chr04:29587748)附近有一个控制F2植株偏分离的连锁位点,该位点的遗传机制与F1的花粉比例无关。RFP标记提高了籼粳杂种花粉及后代植株的研究效率,为探索偏分离遗传机理提供了新的研究手段。     

利用体细胞核移植技术生产表达绿色荧光蛋白转基因猪胚胎的研究

试验对脂质体转染猪胎儿成纤维细胞的技术程序进行了筛选,以绿色荧光蛋白基因转染后的阳性细胞作为体细胞核移植的核供体,以体外成熟卵母细胞为核受体构建了绿色荧光蛋白转基因克隆猪胚胎,并对重构胚在体外发育情况以及绿色荧光蛋白表达情况进行了跟踪研究。结果显示,采用4.0μg.mL-1脂质体转染试剂,1.6μg.mL-1质粒DNA,转染6 h可以获得最佳转染效果,转染效率达4.48%;GFP转基因体细胞重构胚体外囊胚发育率为10%,GFP阳性胚胎率为48%。结果表明,脂质体转染试剂可以高效转染猪胎儿成纤维细胞,获得的阳性细胞具有支持猪全程发育的潜能。     

甘薯实生种子后代的筛选鉴定和评价

以本地实生种子为对照,将国际马铃薯中心(CIP)的甘薯实生种子及其后代品系进行萌芽性、生产力、抗病性、品质等性状的全面筛选鉴定。结果表明,CIP实生种子的出苗率、移栽率、初选、复选、品系比较等各级试验的入选率分别为69.0%、55.5%、3.2%、19.0%、45.7%,本地实生种子分别为73.7%、64.2%、4.7%、23.1%、16.4%;筛选结果低代品系差异不显著,高代品系差异显著;从CIP实生种子中选拔出了一批性状优良、特征鲜明的优异品系,2个通过国家甘薯新品种鉴定定名,1个正在参加全国甘薯区域试验。