芒果赤霉素氧化酶基因GA3ox的克隆、表达及亚细胞定位分析

赤霉素3-氧化酶(gibberellin 3-oxidases, GA3ox)是赤霉素(gibberellic acid, GA)生物合成途径中的关键限速酶之一。芒果中GA3ox基因的功能及其表达模式未见报道。本研究利用RACE技术克隆了一个芒果GA3-氧化酶基因(GA3ox),该基因全长cDNA序列为1 680 bp,编码氨基酸381个,开放阅读框(open reading frame, ORF)为1 146 bp,蛋白分子量为42.6 kD,等电点为5.13,不含信号肽,不含跨膜结构域。系统发育树分析发现,该基因编码的蛋白主要与开心果亲缘关系较近,其次为克莱门柚、甜橙、麻疯树等植物。通过拟南芥原生质体亚细胞定位分析发现,该基因主要定位在细胞质中。通过对乔化、矮化芒果品种不同发育时期的叶片的实时荧光定量PCR分析发现,该基因主要在矮化品种中表达量较高,在乔化品种各个时期表达量较低,且差异不大。矮化品种中主要在开花期表达量最高,坐果期7～8周含量最低,但都高于乔化品种的任何取样时期。该基因的克隆和表达分析为下一步功能的研究及其在芒果株形调控分子机制提供理论依据。     

萝卜LIM基因家族生物信息学及表达分析

为明确LIM家族基因在萝卜小孢子胚胎发生诱导中的表达特性,本研究在萝卜全基因组中鉴定LIM,通过分析理化性质、基因及蛋白结构、基因进化和表达模式。共鉴定到12个萝卜LIM家族成员,包含189～320个不等的氨基酸。亚细胞定位结果显示,RsLIM蛋白在细胞核中均有分布,部分在高尔基体中也有分布。启动子顺式作用元件分析表明,RsLIM启动子回应光、激素诱导的元件最多。基因结构分析表明,RsLIM中外显子数为3～10个。结构域分析表明,RsLIM蛋白中除Rs LIM2外,均具有2个LIM结构域。根据聚类分析结果可将RsLIM分为3组。染色体定位结果显示,Rs LIM分布在萝卜9条染色体中的6条,且呈不均匀分布。转录组数据表明,12个RsLIM基因在不同组织中的表达具有明显差异,显著分为2类。游离小孢子不同预处理的实时荧光定量PCR结果显示,12个Rs LIM对不同预处理的反应效果不同,低温诱导促进多数基因表达,高温诱导抑制多数基因的表达,RsLIM基因家族具有一定的表达特异性。本研究为萝卜LIM基因家族的功能分析提供了依据。     

银杏GbASR基因的克隆、生物信息学及表达分析

为了明确银杏ASR(ABA-stress-ripening)在应答非生物逆境胁迫中的作用,以便为ASR基因功能、环境胁迫研究提供材料。本研究以银杏(Ginkgo biloba)为材料,利用分子生物学技术对ASR基因进行了克隆,构建pCAMBIA1300-ASR-GFP融合表达载体,进行亚细胞定位分析。采用序列比对方法分析GbASR蛋白结构域及系统进化;利用qRT-PCR方法进行组织特异性表达及非生物逆境胁迫下的基因表达分析。结果表明,银杏ASR基因编码区全长546 bp,共编码182个氨基酸;蛋白质等电点为5.33,分子量大小为20111.24 Da,为亲水性稳定蛋白;GbASR蛋白含有1个高度保守的ABA/WDS结构域,且与火炬松PtASR蛋白同源性较高;GbASR蛋白定位于细胞核。此外,GbASR基因在银杏幼苗根、茎、叶各组织中均有表达,且在叶部有较高的表达;在高盐、干旱和高温胁迫下,GbASR基因均受诱导,且在不同胁迫处理时间0 h、6 h、24 h和48 h的表达存在显著的差异。以上分析说明GbASR基因参与响应高盐、干旱和高温等非生物胁迫,这为植物的育种及解释ASR基因功能提供依据。     

谷子SiHd3a基因的克隆及表达分析

分析谷子成花素基因(Hd3a)在不同光周期条件下的表达规律,旨在揭示成花素基因在光周期调控谷子开花过程中扮演的角色。首先利用生物信息学方法获得位于谷子4号染色体的成花素基因序列(Seita.4G067600),命名为SiHd3a,然后根据基因序列设计1对特异引物,提取谷子农家种黄毛谷总RNA,利用RT-PCR技术克隆得到黄毛谷SiHd3a基因cDNA序列,其长度为792 bp,包含一个537 bp的CDS区,编码178个氨基酸;预测SiHd3a蛋白的分子质量为19.74 ku,等电点为6.82,初步判断其为亲水蛋白;蛋白质的二级结构中无规则卷曲所占比例最高(43.26%),其次为延伸链(β-折叠,29.21%)、α螺旋(16.29%)、β转角(11.24%);亚细胞定位分析发现,SiHd3a蛋白定位在细胞质和细胞间质;基于Hd3a蛋白序列进化分析发现,谷子与野生黍、玉米、高粱之间的亲缘关系比较近,聚在一组,而与水稻亲缘关系较远。半定量PCR发现,SiHd3a基因在短日照条件下表现为昼夜节律性表达,在早晨6:00、中午12:00各有1个表达峰,而在长日照条件下基因24 h内表现稳定表达水...     

蓖麻矮化相关基因RcDof的克隆及分析

为研究Rc Dof基因在蓖麻矮化中的作用及生物学功能,提取蓖麻生长跃变期茎尖中基因组DNA,根据蓖麻中已获得的锌指蛋白基因片段设计引物,采用RACE技术克隆得到该基因,基因完整阅读框全长为924 bp,可编码307个氨基酸,为C2C2型锌指蛋白,预测蛋白质分子量为34.020 9 k Da,等电点为9.23。二级结构预测表明α螺旋占1.63%,β折叠占1.30%,其他无规则卷曲占97.07%,为外释放蛋白。亚细胞定位于细胞核中,对Rc Dof基因的生物信息学分析为进一步研究其在蓖麻矮化过程中的作用机制和功能特征提供理论依据。     

灵芝14-3-3蛋白基因的电子克隆与表达分析

通过电子克隆技术,获得14-3-3基因的cDNA序列全长,并采用生物信息学方法,借助电子计算机和相关的生物信息学软件,对该基因编码蛋白从基本理化性质、疏水性/亲水性、亚细胞定位、跨膜区结构、信号肽、高级结构及系统发育树分析等进行了预测和分析。该cDNA编码蛋白由257个氨基酸组成,相对分子质量为29．0145 kDa,亲水性和疏水性比较平衡,定位于细胞质,不存在信号肽,无跨膜螺旋区,且二级结构由6．23％无规则卷曲,66．54％α-螺旋和27．24％延伸链组成。同源比对分析显示,该酶基因编码的氨基酸序列与污叉丝孔菌、双孢菇和木耳等蘑菇类高等真菌中的14-3-3基因所编码的氨基酸序列高度同源。实时荧光定量PCR结果表明,灵芝14-3-3基因在液体静置培养过程中的表达量显著高于振荡培养。     

花生mtACP3基因的克隆与表达分析

旨在探究酰基载体蛋白在植物脂肪酸合成途径中的作用机制,本研究采用传统PCR方法从花生中克隆得到了一个线粒体型基因,命名为AhmtACP3。并采用荧光定量PCR技术分析了基因的表达特性。该基因全长为859 bp,开放阅读框ORF为390 bp,开放阅读框对应的基因组序列为543 bp,由2个外显子和1个内含子组成,该基因编码129个氨基酸,理论分子量为14.5345 k D,理论等电点为5.22,可能定位于线粒体上。系统发育分析表明,花生线粒体型ACP蛋白分成2个分支:AhmtACP1和AhmtACP2有较近的亲缘关系,与AhmtACP3亲缘关系较远。荧光定量PCR结果显示,AhmtACP3基因在花中的表达量明显高于其他组织,其次是子叶和根。AhmtACP3基因在种子发育过程中的表达量呈现下降趋势。     

橄榄果实氨基酸转运蛋白基因CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4的克隆与表达分析

氨基酸通透酶(amino acid permease, AAP)参与植物氨基酸的转运、吸收、氮代谢等途径。为了解橄榄果实AAP基因在不同品种果实成熟发育过程的表达模式,本研究以呈味差异显著的两个品种普通橄榄‘长营’和清橄榄‘梅埔2号’为试验材料,通过RT-PCR方法克隆了3个APP基因的cDNA序列全长,并对其进行了生物学信息分析与亚细胞定位分析,同时利用实时荧光定量PCR技术分析了两个不同品种果实在不同发育时期的CaAAPs表达情况。结果表明：3个基因的序列长度分别为1 254 bp (CaAAP1)、405 bp (CaAAP2)、633 bp (CaAAP4),其编码的蛋白均为不稳定疏水性蛋白,分别含有7、1、5个跨膜区,保守基序差异较大;亚细胞定位结果表明,CaAAP1、CaAAP2主要在细胞质膜上表达。荧光定量结果表明随着果实的发育,CaAAP1、CaAAP2和CaAAP4在‘长营’果实的表达量均呈显著上升趋势,在‘梅埔2号’的表达量变化趋势较平缓,且在170 d时显著下降,两个品种CaAAPs家族基因表达量差异大,表明CaAAP1、CaAAP2、CaAAP4基因可能对橄榄果...     

大麻FT同源基因CsHd3a的克隆及表达谱分析

为探究FT基因在大麻光周期途径中调控开花的作用,从工业大麻品种庆麻1号(Q1)中使用PCR技术克隆了FT同源基因cDNA序列,命名为CsHd3a.利用生物信息方法对该基因序列特征进行了分析,并使用实时荧光定量(qRT-PCR)技术研究其组织特异性表达模式.选取了晚花品种云麻7号(Y7)与早花品种Q1使用qRT-PCR技...     

陆地棉干旱胁迫基因GhRBCO的克隆与表达分析

Rubisco蛋白(ritmlose-1,5-bisphosphosphate carboxylase/oxygenase,Rubisco)的上调表达是植物应对非生物胁迫的特征之一.本研究在前期蛋白质组学分析的结果上,利用同源克隆获得陆地棉'KK1543'在干旱胁迫下差异表达的基因GhRBCO.GhRBCO基因编码区长...     

萝卜扩展蛋白基因RsEXPB1克隆与表达特征分析

本文根据GenBank中扩展蛋白序列设计特异引物,从萝卜高代自交系"NAU-LVYH06"中克隆到一个扩展蛋白基因RsEXPB1(GenBank accession No.GQ387363,GQ387364).其编码区基因组序列长度为1 430bp,包括4个外显子和3个内含子;RT-PCR获得长度为898 bp的cDNA,开放读码框(ORF)为29～820 bp,推导编码263个氨基酸,含有1个组氨酸(His-Phe-Asp,HrD)功能域,ORF和推导蛋白序列与拟南芥AtEXPB3(GenBank accession No.NM118965)同源性分别为87%、92%.半定量RT-PCR检测到该基因主要在萝卜生育前期的幼叶、肉质根木质部和韧皮部中表达,且表达丰度可能与该部位细胞生长分裂状态相关,差异较明显.     

天女木兰MsAHG1和MsAHG3基因的克隆及表达分析

为了探究ABA信号通路中蛋白磷酸酶PP2C调控天女木兰种子休眠解除的分子机制,本研究以天女木兰种子转录组数据为参考,克隆获得了A类PP2C的2个基因(MsAHG1和MsAHG3)。生物信息学分析结果表明,MsAHG1、MsAHG3基因全长分别为1 269、1 209 bp,编码422、402个氨基酸,均属于PP2C家族;所编码的蛋白质相对分子量分别为44.885 43、43.356 03 kD,均属于不稳定的亲水蛋白;所编码氨基酸的同源性与系统进化分析显示,天女木兰的AHG1、AHG3蛋白分别与沉水樟的AHG1、AHG3蛋白亲缘关系较近。通过实时荧光定量PCR探究MsAHG1、MsAHG3基因在天女木兰不同组织、种子休眠解除过程及吸胀过程的相对表达量,发现MsAHG1和MsAHG3基因在干种子中表达量最高,且MsAHG3基因表达量极显著高于MsAHG1基因;MsAHG3基因在种子休眠解除和吸胀过程中的表达量均高于MsAHG1基因,表明MsAHG3基因在天女木兰种子休眠解除中发挥关键作用。     

橡胶草Tk-bZIP11转录因子基因的克隆及其表达模式分析

橡胶草(Taraxacum kok-saghyz)种植过程中经常受干旱等胁迫影响，提高品种的抗逆性具有重要意义。为了研究bZIP转录因子在橡胶草逆境响应中的功能，本研究从橡胶草中克隆了Tk-bZIP11基因，其ORF全长468 bp，编码156个氨基酸。蛋白结构分析结果表明，Tk-bZIP11蛋白具有bZIP转录因子特有的保守结构域，同时具有核定位信号。在进化关系上，Tk-bZIP11与莴苣(Lactuca sativa) Ls-bZIP11亲缘关系最近，并具有相同的保守基序。亚细胞定位结果表明，Tk-bZIP11定位在细胞核中。实时荧光定量PCR (RT-qPCR)分析结果表明，Tk-bZIP11在橡胶草的不同组织均有表达，其在叶片中表达量最高，是花梗中表达量的3.28倍。在经甘露醇诱导的渗透压胁迫下，Tk-bZIP11在处理后呈现显著下调表达。在NaCl和PEG-4000模拟的胁迫处理下，Tk-bZIP11在处理后12 h内均呈现上调表达，24 h后呈现下调的规律。在植物激素茉莉酸甲酯、乙烯利和脱落酸处理下，Tk-bZIP11表达量也是在处理的前12 h显著上调表达，之后下调表达。...     

林烟草钾离子通道基因NKT6的克隆与表达定位分析

Shaker家族钾离子通道在植物钾的吸收转运及其他生命过程中发挥重要作用。本研究利用同源克隆的策略从林烟草中获得一个Shaker家族钾离子通道基因,命名为NKT6 (GenBank登录号为KC310448)。该基因cDNA序列全长2 317 bp,编码由681个氨基酸组成的蛋白,该蛋白与Shaker家族其他成员具有较高同源性。NKT6基因组CDS序列共含有11个外显子、10个内含子。系统进化树分析表明,NKT6蛋白是Shaker家族Group II的成员之一。荧光定量PCR分析发现,NKT6的表达量在林烟草的茎和腋芽中最高,在萼片、叶、花中其次,在根中最低。亚细胞定位结果表明,NKT6主要定位于细胞膜和核膜附近的内质网上。干旱与外源ABA胁迫处理下,NKT6的表达量均呈下降趋势。推测NKT6可能在林烟草气孔开放中发挥作用。     

甘蔗ScWRKY4基因的克隆与表达特性分析

WRKY是植物中特有的转录因子家族之一, 在植物对生物和非生物逆境胁迫的应答反应中起重要调控作用。本研究基于课题组前期构建的甘蔗(Saccharum spp.)转录组数据库, 从新台糖22 (ROC22)中成功克隆到1个WRKY基因, 命名为ScWRKY4 (GenBank登录号为MG852087)。序列分析发现, ScWRKY4基因cDNA全长1265 bp, 包含1个741 bp的完整开放读码框, 编码246个氨基酸, 该蛋白具有1个WRKYGQK保守结构域和C₂H₂锌指结构域, 属于IIc类WRKY转录因子。生物信息学预测分析发现, ScWRKY4蛋白为碱性的不稳定亲水性蛋白, 不存在信号肽和跨膜结构域, 蛋白二级结构元件缺少β螺旋。在本氏烟(Nicotiana benthamiana)叶片瞬时表达中, ScWRKY4蛋白定位于细胞核。酵母杂交实验结果显示, ScWRKY4不具有转录激活活性。实时荧光定量PCR分析表明, ScWRKY4基因在甘蔗的根、叶、芽和皮中的表达量无明显差异, 在蔗肉中的表达量最高, 为对照蔗根的18.38倍; 黑穗病菌侵染0~72 h, ScWRKY4在抗病品种崖城05-179中下调表达, 在感病品种ROC22中表达较稳定; 受到外源激素脱落酸、水杨酸和茉莉酸甲酯以及非生物胁迫因子氯化钠和聚乙二醇胁迫后, ScWRKY4基因均被诱导上调表达。上述研究结果表明, ScWRKY4基因可能不参与甘蔗对黑穗病的抗性反应或在该防御方面起负调控作用, 但积极响应甘蔗对盐和干旱胁迫的应答。     

烟草IspH基因的克隆与原核表达

IspH基因作为MEP途径中的关键酶具有促进下游萜类化合物产量的积累和提高植物对外界的抵御能力的特定作用,本研究旨在通过对烟草中IspH基因进行克隆与原核表达分析,从野生型烟草中提取总RNA,通过RT-PCR克隆获得IspH基因的cDNA序列(NCBI登录号:KC480443),序列分析表明,IspH基因的开放阅读框(...     

柑橘抗逆基因MYB96的克隆与表达分析

为了探讨柑橘MYB96基因在柑橘抗逆过程中的作用,以甜橙、柠檬、金柑、芦柑为试验材料,克隆得到4个柑橘MYB转录因子家族基因,分别命名为CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96、CrMYB96,并对其生物信息学以及不同非生物胁迫处理下的表达模式进行分析。结果表明,CsMYB96、ClMYB96、FmMYB96和CrMYB96的开放阅读框长度分别为1 032,1 035,1 035和1 032 bp,其编码的蛋白分别由343,344,344,343个氨基酸组成,分子量分别约为38.16,38.27,38.22,38.13 ku,等电点分别为6.31,6.35,6.35,6.31,均为不稳定亲水性蛋白;亚细胞定位预测结果均定位于细胞核。这4个基因编码的蛋白二级结构相似,主要由α螺旋和无规卷曲构成;具有高度保守的R2和R3结构域;在进化关系上,与克莱门氏小柑橘CcMYB96亲缘关系最近。CsMYB96基因的启动子中含有脱落酸响应元件(ABRE)、低温响应元件(LTR)、厌氧响应元件(ARE)、参与干旱诱导的MYB结合位点(MBS)等非生物胁迫响应相关顺式作用元件。qRT-PCR结果分析...     

番茄转录因子基因SlYAB2a的克隆、表达及亚细胞定位分析

为了研究番茄SlYAB2a基因的功能及其在番茄生长发育中的分子机理,以番茄的cDNA为模板,利用RTPCR技术从番茄中克隆到SlYAB2a基因,该基因编码的蛋白质由192个氨基酸残基组成,蛋白质的分子量为21.35k Da,等电点是8.79,平均亲水系数是-0.487。SlYAB2a蛋白质的6~165位氨基酸残基形成Pfam:YABBY结构域,在20~47位有1个C2C2锌指结构域,在122~181位有1个螺旋-环-螺旋结构域。二级结构分析表明SlYAB2a蛋白分子中,α-螺旋占19.79%、β-折叠占14.06%、其余66.15%为不规则卷曲。蛋白多序列比对表明SlYAB2a与马铃薯、林烟草、酿酒葡萄、大豆、拟南芥、甘蓝型油菜、花药野生稻、玉米和小麦YABBY2的一致性分别为98%,78%,71%,65%,64%,64%,58%,57%,57%,说明SlYAB2a蛋白与来源于双子叶植物的YABBY2一致性较高,而与来源于单子叶植物的一致性较低。通过聚类分析发现YABBY2蛋白明显分为单子叶和双子叶2个亚类,SlYAB2a蛋白属于双子叶亚类,与马铃薯、潘那利番茄、绒毛状烟草、林烟草等的YABBY2蛋白序列亲缘关系较近。实时定量RT-PCR分析结果表明,在番茄植物的不同生长发育时期,根、茎、叶、花、果实中,都有SlYAB2a基因表达;并且在花和青熟果实中,SlYAB2a基因表达水平远远高于其他组织。说明SlYAB2a基因在花和果实的发育过程中起着重要作用。洋葱表皮细胞瞬时表达结果表明SlYAB2a蛋白定位于细胞核中。