沙棘HrCYP85A1基因生物信息及表达分析

沙棘具有重要的生态价值及经济价值,油菜素内酯(BR)对植物抵御非生物胁迫具有响应作用,同时,CYP85A1是参与油菜素内酯合成反应的关键基因。因此,为了解析HrCYP85A1基因在沙棘抵御干旱胁迫中的作用,本研究以中国沙棘为试验材料,利用生物信息学软件对HrCYP85A1基因特点及蛋白结构进行了分析,并且利用荧光定量PCR技术分析了在干旱胁迫下HrCYP85A1基因的表达。结果表明,HrCYP85A1基因具有3个基序(motif),与多个物种的CYP85A1序列具有高度同源性;HrCYP85A1基因编码的蛋白位于质膜位置,且其为亲水性蛋白;HrCYP85A1参与NaCl、PEG与ABA等非生物胁迫的响应,说明其与沙棘多种非生物胁迫密切相关。本研究结果将为今后研究沙棘CYP家族基因功能提供了依据,并为林木抗逆研究及分子育种提供科学依据。     

玉米中低温应答ERF基因鉴定及表达分析

ERF转录因子在植物的多种发育过程和非生物胁迫反应中发挥重要作用。在玉米中,虽然ERF家族基因对盐胁迫和干旱胁迫的响应研究已经有报道,但尚没有研究从全基因组水平鉴定ERF家族基因对低温胁迫的响应。本研究采用高通量测序技术Illumina HiSeq,分别在5℃和22℃处理下构建玉米叶组织转录组,从中筛选出57条低温响应ZmERFs,包括53条上调表达的Zm ERFs,4条下调表达的Zm ERFs。不同的Zm ERFs在不同组织部位和发育阶段的表达模式有很大变化。蛋白保守结构域分析表明ZmERFs蛋白中共有20个保守基序,EAR基序出现在组B1成员中,LWSY基序出现在A1,A5和B2成员中。启动子分析显示,多种逆境相关元件ABRE、ARE、LTR和MBS在低温响应ZmERFs的启动子中高度富集。RT-qPCR结果进一步显示GRMZM2G544539和GRMZM2G040664基因可以同时受低温、盐和干旱胁迫诱导表达,GRMZM2G434203基因可以同时受低温和干旱胁迫诱导表达,表明ERF转录因子可以参与包括低温在内的多重非生物胁迫反应。此外,启动子中含有7个ABRE元件的GRMZM2...     

甘蓝型油菜TIP4;1基因的克隆与表达分析

水孔蛋白是位于质膜和液泡膜等生物膜上主要负责水分跨膜运输的通道蛋白。为了分析甘蓝型油菜种子萌发过程水分调控的分子机制,采用RT-PCR法从甘蓝型油菜种子中克隆了液泡膜内在蛋白(Tonop last intrinsic proteins,TIPs)TIP4;1基因片段序列,并对甘蓝型油菜种子TIP4;1基因在种子萌发过程及干旱、低温和盐胁迫下的表达进行了qRT-PCR(Quantitative Real-time PCR)分析。结果表明,TIP4;1基因在干种子中表达水平很低,但是在种子萌发过程中表达量增加。此外,在干旱、低温及盐的胁迫处理下,TIP4;1基因的表达上调,结果暗示着该基因可能参与了甘蓝型油菜种子萌发和逆境响应过程。随着研究的深入,水孔蛋白的水分调控机制将进一步被揭示,这对于解决干旱胁迫和盐胁迫等实际问题具有重大现实意义。     

玉米油菜素甾醇生物合成关键酶基因ZmCYP90B1的克隆及其对逆境胁迫的响应

油菜素甾醇作为一类重要植物激素, 在植物生长发育和抵御逆境胁迫等过程中发挥重要作用。CYP90B1基因编码酶是其合成途径中关键限速酶。本研究针对迄今有关玉米CYP90B1基因应答逆境胁迫特征尚未见报道现状, 采用RT-PCR结合RACE技术, 从玉米中克隆了油菜素甾醇生物合成关键基因ZmCYP90B1 (GenBank登录号KY242373)。ZmCYP90B1全长2058 bp, 开放阅读框为1518 bp, 编码506个氨基酸。ZmCYP90B1蛋白预测分子量为57.66 kD, 等电点为9.54, 含有1个跨膜结构域及1个p450保守结构域。序列比对表明, ZmCYP90B1与其他物种CYP90B1蛋白高度相似, 但在单双子叶植物中进化上具有明显差异。实时荧光定量PCR结果表明, 非生物胁迫(干旱、高盐、低温和脱落酸)、虫害(甜菜夜蛾取食)和茉莉酸甲酯均诱导ZmCYP90B1表达, 表明该基因响应多种非生物胁迫, 参与植物对虫害和茉莉酸甲酯的响应。进一步构建过量表达ZmCYP90B1基因的烟草株系并检测表明该烟草株系抗旱性增强, 叶片失水率下降, SPAD值增大。此外, 干旱胁迫下转基因烟草超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)的活性以及游离脯氨酸(Pro)的积累量均显著高于野生型, 丙二醛(MDA)和脱落酸(ABA)含量明显低于野生型。通过检测下游胁迫响应基因表达, 表明ZmCYP90B1提高植物抗旱性可能不依赖ABA途径, 而与其对抗氧化相关途径相关基因的转录调控有关。     

烟草转录因子NtNAC080在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

NAC作为植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育、衰老及胁迫响应等生物学过程。为探究烟草NtNAC080在非生物胁迫响应中的功能,利用qRT-PCR技术分析了不同胁迫处理下NtNAC080的表达模式,结果表明,NtNAC080的表达受干旱、高盐胁迫以及ABA、MeJA和SA激素的诱导;以NtNAC080基因的敲除突变体及野生型(K326)烟株为材料,分析敲除株系在高盐和干旱胁迫下抗逆表型。试验表明,与野生型相比,2个敲除株系的耐盐抗旱能力均明显增强;干旱和盐胁迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量显著高于野生型,而丙二醛含量显著低于野生型。相反地,异源表达NtNAC080的转基因拟南芥与野生型(Col-0)相比对盐和干旱的耐受性明显减弱。qRT-PCR分析发现在干旱和盐处理后胁迫相关基因(NtDREB1A、NtKAT2、NtNHX1等)在NtNAC080基因敲除株系中表达水平显著高于野生型。以上结果表明,NtNAC080在烟草的非生物胁迫响应中起负调控作用,这可能是通过调控抗氧化酶活性及胁迫相关基因的表达来实现的。     

蒜芥茄SsUBC基因的克隆及表达分析

本研究从蒜芥茄中克隆得到泛素E2结合酶UBC基因编码区序列,命名为SsUBC,登陆Gen Bank,编号:MF872897。SsUBC基因编码区全长859 bp,编码272个氨基酸。进行进化树分析,SsUBC编码的氨基酸序列与番茄和马铃薯等茄科植物有较近的亲缘性。利用荧光定量PCR技术分析SsUBC基因在蒜芥茄各器官表达特征和不同非生物胁迫处理下(镉,高温,干旱,盐和脱落酸)根部和叶片的表达特性。结果表明,SsUBC基因表达在不同器官中具有差异性,且叶片中表达量最高。非生物胁迫处理后叶片中SsUBC基因表达变化比根部中更为显著,除盐胁迫外,其它四种处理条件下该基因在叶片中的表达量均高于根部,其中高温胁迫下表达量升高变化最为显著。除盐胁迫外,叶片中基因的表达均为上调趋势,而干旱胁迫下根中该基因表达为下调趋势。综上,SsUBC基因在蒜芥茄响应镉(1 h)、高温(1 h)、干旱胁迫(1 h)时的应答较为迅速,其次为脱落酸(9 h),且响应部位为叶片;而在盐胁迫(12 h)下应答相对较为迟缓。     

水稻OsGPRP家族基因克隆及其对非生物胁迫的响应

富含脯氨酸和甘氨酸的蛋白基因GPRPs广泛分布于高等植物中,在植物的生长发育和逆境适应中具有重要的作用。为了克隆水稻中的OsGPRP基因,利用生物信息学分析,结合RT-PCR和测序等方法,共获得了3个水稻OsGPRP的cDNA序列,分别编码197,180,170个氨基酸,其蛋白序列均含有3个典型的植物GPRP蛋白保守结构域:N端的XYPP重复、中部富含A的疏水区和C端的HGK重复。为了初步探讨这些OsGPRP基因的功能,利用在线工具Plant CARE database分析,结果发现有3个水稻OsGPRP基因的启动子中包含有许多与植物生长发育、激素和逆境胁迫响应相关的顺式作用元件。为了进一步探究OsGPRP基因在水稻适应非生物逆境胁迫过程中的生物学功能,利用实时荧光定量PCR分析了3个OsGPRP基因在水稻幼苗适应干旱和低温胁迫过程中的响应情况。结果显示,这些OsGPRP基因对干旱和低温胁迫均有不同程度的响应;在干旱胁迫下,这些OsGPRP基因在水稻幼苗不同组织中的表达量均表现出上升的趋势,表达模式较为相似;而在低温胁迫下,其表达模式却存在一些明显的不同,其中,OsGPRP1和OsGPRP3的表达量上升,而OsGPRP2的表达量却下降。结果表明,3个OsGPRP基因在水稻适应非生物逆境中具有重要的作用。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因的异源表达增强了烟草对干旱、盐及叶斑病的抗性

为明确一年生草本盐生植物费尔干猪毛菜(Salsola ferganica Drob.)病程相关蛋白基因SfPR1a (GenBank登录号为JQ670917)是否参与了植物对逆境胁迫的响应,采用qRT-PCR检测了该基因在不同组织部位和脱落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前体(ACC)等相关激素胁迫及NaCl处理下的表达规律,同时对转基因烟草在盐、旱及丁香假单胞菌等胁迫下的抗性进行了鉴定。结果显示, SfPR1a基因在费尔干猪毛菜根中的表达量显著高于茎叶中,且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的积极诱导;干旱胁迫下,转基因烟草的丙二醛(MDA)含量显著低于野生型烟草,显示出较强的抗旱表型;盐胁迫下,异源表达SfPR1a的转基因烟草幼苗生长显著优于野生型烟草;丁香假单胞菌攻毒后的转基因烟草叶片呈现严重的坏死反应,但植株的整体抗性表型显著优于野生型烟草;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于植物细胞质外体空间。以上结果表明,费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因参与了植物对非生物及生物胁迫的抗性。     

山羊草谷胱甘肽S-转移酶基因家族鉴定及表达分析

谷胱甘肽S-转移酶是一种多功能蛋白酶,在植物体内参与干旱、盐、低温、重金属等多种非生物胁迫的调节;山羊草是普通小麦D染色体组的供体物种,深入挖掘山羊草中GST基因,对进一步分析六倍体小麦GST基因的功能具有重要意义。本研究利用信息生物学手段,在山羊草中共发现114条GST基因序列,分属于6个亚族;基因复制分析发现共4对基因发生了基因复制,且均为纯化选择;采用荧光定量PCR对部分GST基因在非生物胁迫下的表达分析发现,8个GST基因在响应干旱和盐胁迫时,主要在根部显著上调表达,3个GST基因在响应低温胁迫时,在根和叶中均显著上调表达,说明山羊草中的GST基因在应答非生物胁迫时,在不同组织中的表达存在着差异。     

大豆sbp基因表达方式分析及其启动子调控活性研究

研究大豆蔗糖结合蛋白基因(sbp)的表达方式及其启动子的调控活性,为揭示sbp基因表达本质及其启动子功能研究、利用提供理论依据。利用qRT-PCR方法,检测sbp基因在不同逆境胁迫条件下及不同组织中的表达方式;利用PCR方法,克隆sbp基因5'端上游序列并对其进行预测分析;在转基因烟草中,研究sbp基因启动子在干旱胁迫条件下及不同组织中的调控活性。sbp基因受干旱诱导上调,而在盐、低温、ABA诱导下表达下降。sbp基因在大豆根、茎、叶、花中的相对表达量低,而在种子中的相对表达量高。克隆获得sbp基因5'端上游942 bp序列,命名为SP,预测分析表明,SP序列中含有多种典型的种子特异表达元件及与激素、逆境诱导相关的元件。组织化学分析表明,在转基因烟草中,SP启动子驱动gus基因在干旱胁迫下及种子中高表达。推测SP启动子兼具干旱诱导表达活性和种子特异表达特性。     

烟草SnRK2基因家族的克隆及表达分析

农作物生产过程中会面临多种非生物胁迫的影响,会极大地影响作物的产量以及品质。非生物胁迫形式多种多样,干旱胁迫是其中一种主要形式。烟草是重要的经济作物,主要在中国西南地区种植,但经常会遭受极端干旱胁迫。Sn RK2基因家族参与植物抗旱过程,能够受逆境胁迫诱导表达,这种表达是SnRK2基因家族功能的重要体现。为了进一步研究烟草SnRK2家族基因的功能,本研究克隆了烟草SnRK2基因家族GroupⅠ的基因,并检测了烟草SnRK2基因家族的组织表达特异性及诱导表达特异性。结果表明,烟草SnRK2基因中Ntab0922420基因的表达量最高,同时烟草SnRK2基因家族成员更容易在茎与叶中表达。烟草经过低温、盐、干旱胁迫以及ABA处理后,部分SnRK2基因成员表现出受胁迫诱导,其中ID为Ntab0894060的基因受干旱显著诱导。这些工作将为研究烟草SnRK2基因家族功能鉴定基础,并为培育抗逆烟草品种提供遗传资源。     

高温和盐胁迫下硅对辣椒CaMADS-box基因表达的影响

为了探索非生物胁迫下硅对辣椒Ca MADS-box基因表达的影响,以豫椒101为材料,在对辣椒Ca MADS-box基因片段同源克隆的基础上,对其编码的部分蛋白进行氨基酸同源性分析、理化性质预测、亚细胞定位预测和进化树分析,探讨了硅处理后辣椒Ca MADS-box基因在高温胁迫、盐胁迫下表达量的变化,结果表明,克隆得到的Ca MADSbox基因所编码的蛋白为亲水性蛋白,含有MADS结构域,属于MADS基因家族,亚细胞定位在细胞核中,分子进化树表明其与茄属和烟草属亲缘关系最近,相似性达到67%。荧光定量分析表明,Ca MADS-box基因在高温胁迫和盐胁迫后表达量都呈现出先升高后下降的模式,高温胁迫下48 h达到峰值,而盐胁迫在24 h达到峰值,硅处理能够诱导Ca MADS-box基因表达,在高温胁迫和盐胁迫下都在12 h达到高峰值,这表明Ca MADS-box是一个硅快速响应基因,推测硅处理在缓解辣椒高温胁迫和盐胁迫等非生物胁迫方面具有重要作用。     

大豆转录因子GmWRKY58亚细胞定位及在非生物胁迫下的表达分析

WRKY转录因子在植物响应非生物胁迫,调控抗逆基因的表达方面具有重要作用。为了解析大豆转录因子GmWRKY58基因在非生物胁迫中的功能,从大豆中克隆了GmWRKY58 c DNA全长,推导其编码的氨基酸序列、生理生化特征与进化关系,并研究了其亚细胞定位和在不同组织及非生物胁迫下基因的表达变化。结果表明,GmWRKY58基因c DNA ORF全长为954 bp,编码317个氨基酸。亚细胞定位结果显示,GmWRKY58蛋白质定位于细胞核中。实时荧光定量PCR基因表达分析表明,GmWRKY58在大豆根、茎、叶、花和荚等组织均有表达,根、茎、叶中的表达量明显高于花和荚。在大豆根中,GmWRKY58基因受高盐、干旱、低N和缺Fe等非生物胁迫因子强烈诱导,在高盐胁迫下,基因表达量增加187.4倍;GmWRKY58基因受水杨酸(SA)、低温及低P和低K等诱导轻微,差异表达不显著。由此推测,GmWRKY58转录因子在大豆抗盐、抗旱、低N和缺Fe等非生物胁迫过程中起到重要的调控作用。     

黄瓜独脚金内酯信号转导基因CsMAX2的克隆与表达分析

独脚金内酯(strigolactone, SL)是一类新型植物激素,MAX2基因是独脚金内酯信号转导途径中的关键基因。本研究从黄瓜中克隆了CsMAX2基因,其编码715个氨基酸。生物信息学分析表明CsMAX2是一类亲水性蛋白,具有保守的F-box/LRR-repeat结构域,与南瓜中的MAX2基因亲缘关系最近,并且该蛋白与SL合成通路中的D27、CCD7与CCD8等蛋白均有互作关系。启动子分析表明该基因有多个响应非生物胁迫与激素应答的顺式作用元件。表达特性分析表明,CsMAX2在黄瓜的幼茎和幼叶中表达量较高;CsMAX2在黄瓜根与叶中积极响应干旱胁迫诱导上调表达;在盐胁迫条件下,Cs MAX2基因在根与叶中的表达量相反;同时发现CsMAX2也参与了ABA信号转导途径。本研究初步分析了Cs MAX2基因的蛋白特性及表达特性,为CsMAX2在黄瓜独脚金内酯信号转导途径中响应非生物胁迫提供了帮助。     

棉花GhCYSTM9基因的克隆及在非生物胁迫下的表达分析

CYSTM是真核生物中广泛存在的一类小分子蛋白,其在细胞信号转导、逆境防御反应中发挥着非常重要的作用。为了研究CYSTM基因在棉花非生物胁迫响应中的功能,本研究利用RT-PCR方法从陆地棉中克隆了GhCYSTM9基因。该基因c DNA全长237 bp,编码78个氨基酸,所编码蛋白具有一个C端保守的富含半胱氨酸的TM螺旋和特异的N端胞质元件。多重比对发现,GhCYSTM9与拟南芥CYSTMs具有较高的相似度,其中与AtCYSTM9 (NP566703.4, AT3G22240.1)序列一致性最高,达68.33%。荧光定量PCR分析其组织表达特性发现,GhCYSTM9基因在雄蕊、花瓣、根和花萼中显著高表达,在叶片、茎和雌蕊中表达量较低。进一步研究发现,GhCYSTM9基因的表达受到低温、干旱和盐胁迫的诱导,在胁迫处理下,其表达水平均呈现显著的上调表达。非生物胁迫下的基因表达分析结果显示,该基因在棉花非生物胁迫响应中有重要作用。本研究为进一步开展GhCYSTM9基因功能研究奠定了理论基础。     

甘蓝型油菜CBF基因家族的鉴定和表达分析

低温是影响植物生长发育的重要环境胁迫因子,ICE1(inducer of CBF expression1)-CBF(C-repeat(CRT)-binding factors)-COR(cold responsive)在植物响应低温胁迫的信号途径中具有重要作用。为探究CBF(C-repeat-binding factors)基因在甘蓝型油菜(Brassica napus L.)中的进化以及在低温胁迫应答反应中的功能,本研究以4个拟南芥CBF基因为基础序列,鉴定出11个甘蓝型油菜、6个白菜和5个甘蓝CBF基因,并对它们的分子特性、蛋白保守结构域和系统进化树、基因结构及基因染色体分布、甘蓝型油菜CBF基因组织表达模式以及不同逆境和激素处理下的表达模式进行系统的比较分析。结果表明,在11个甘蓝型油菜CBF基因中,可分为亚组Ⅰ(CBF1/2/3)和亚组Ⅱ (CBF4) 2个亚组。转录组测序结果表明,所有甘蓝型油菜CBF基因受低温诱导表达,其中亚组Ib的4个基因对冷胁迫响应迅速且持续时间长,亚组Ⅱ中2个基因对冷胁迫响应表达较弱,但它们在根中表达量明显高于叶片,并且参与盐胁迫和渗透胁迫响应;甘蓝型...     

烟草ERF基因NtRAP2-7的表达载体构建及表达模式分析

为了研究烟草Nt RAP2-7基因在非生物胁迫响应中的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个ERF转录因子基因Nt RAP2-7。并利用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的理化性质、空间结构与系统进化关系。序列分析结果表明,该基因序列全长1 398 bp,共编码465个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为51. 16 ku。该蛋白包含一个由3个β-折叠及1个α-螺旋组成的保守结构,并含有58个磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,该蛋白主要定位于细胞核,并包含单分型的核定位信号序列。进化分析表明,Nt RAP2-7蛋白与林烟草RAP2-7蛋白序列同源性最高,为98%。运用q RT-PCR技术进行了该基因的表达模式分析,组织表达分析发现,Nt RAP2-7基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,但在根中的表达量最高。该基因的表达在低钾、高盐、干旱、ABA、H2O2处理下受到诱导和在低温处理下受到抑制,结果表明,烟草Nt RAP2-7基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。并利用双酶切法成功构建了p BI121-Nt RAP2-7过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。     

甜菜ERF转录因子基因克隆及非生物胁迫响应分析

ERF(Ethylene-responsive element binding factors)是调控植物生长发育和响应胁迫的重要转录因子，在植物应对生物及非生物胁迫反应、调控胁迫相关功能基因的表达、提高植物的抗逆性中起着重要的作用。分析甜菜ERF转录因子基因在非生物胁迫下的表达规律，旨在为深入研究ERF转录因子在甜菜逆境胁迫应答中的作用机制提供理论依据。本研究以高糖型甜菜品系‘BS02’为试材，利用RT-PCR方法克隆得到Bv＿ammr基因，并对其进行生物信息学分析。该基因CDS区长906 bp，编码301个氨基酸。蛋白质分子量为33.19 kD，理论等电点为8.61，其二级结构以无规则卷曲和α-螺旋为主，具有一个AP2保守结构域；氨基酸序列的同源性和进化树分析显示其编码蛋白与马兜铃菌毛所编码的蛋白亲缘关系较近。采用实时荧光定量PCR方法观测非生物胁迫下该基因表达模式，结果表明，Bv＿ammr基因对低温、高温、干旱、盐、ABA等非生物胁迫有不同程度响应。     

沙打旺DEAD-box RNA解螺旋酶基因的克隆与功能分析

植物体内解螺旋酶对干旱、低温、高盐等非生物胁迫会产生应答。然而,很多具体的机制并不清楚。研究利用RACE实验方法从豆科牧草沙打旺(Astragalus adsurgens)中分离到一个DEAD-box解螺旋酶基因AH1,它与豌豆解螺旋酶基因PDH45及苜蓿解螺旋酶基因MH1具有高度同源性。外源基因洋葱(Allium cepa)表皮细胞瞬时表达实验证明AH1蛋白定位在细胞核内。Real-time PCR实验证明AH1基因表达对干旱及盐胁迫具有明显响应,对低温不敏感。Northern杂交试验表明AH1转基因拟南芥体内DREB转录因子基因At DREB 2A表达升高,生理实验表明AH1转基因拟南芥可溶糖等渗透调节物质含量显著累积且对干旱及盐胁迫耐受力增加。     

大豆细胞色素P450基因GmCYP78A69的克隆和生物信息学分析

干旱胁迫会影响大豆籽粒发育进而影响产量,但其中的机制尚不明确。本研究通过分析基因表达综合数据库(gene expression omnibus, GEO)中受到干旱胁迫的大豆芯片数据,筛选了3个响应干旱的细胞色素P450 (CYP450)基因,且三者均为CYP78A亚家族成员。该亚家族成员在多种植物中被证明参与种子大小的调控。在大豆品种‘齐黄34’中克隆了一个对干旱胁迫响应程度最大的CYP450基因GmCYP78A69。生物信息分析发现该基因含有CYP450家族蛋白的保守结构域,亚细胞定位预测及跨膜结构域分析表明该蛋白定位于内质网,且通过一段跨膜结构域嵌入到内质网膜上。其高级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,含有少量的延伸链和β转角。在大豆不同组织中的表达分析表明该基因在各个器官中均有表达,其中在茎尖、花和幼荚中的表达量最高,推测该基因可能与花荚发育有关。本研究为探索GmCYP78A69在抗旱和种子形成等过程中的作用提供了基础,为研究干旱影响大豆种子大小的机制提供了切入点。