盐度胁迫对三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中游离氨基酸含量的影响

为探究不同盐度环境下三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中游离氨基酸(free amino acids,FAAs)的含量及浓度的变化规律,明确FAAs的组成以及在盐度适应中发挥的作用,丰富FAAs在甲壳动物盐度适应领域的研究,为后续分子机理的研究提供依据,实验设定胁迫盐度分别为10、20、40、50,以正常海水(盐度33)为对照,用日立835-50型氨基酸自动分析仪测定三疣梭子蟹血淋巴与肌肉组织中游离氨基酸的组分,分析不同盐度环境下三疣梭子蟹肌肉和血淋巴中FAAs的含量及变化规律。结果显示,在正常海水中三疣梭子蟹血淋巴和肌肉中含量较高的FAAs主要为牛磺酸(Tau)、精氨酸(Arg)、甘氨酸(Gly)、脯氨酸(Pro)和丙氨酸(Ala)。盐度为10~50,梭子蟹肌肉和血淋巴总游离氨基酸(total free amino acid,TOFAA)的含量随盐度的增加而显著升高,非必需氨基酸(non-essentical free amino acid,NEAA)的含量随盐度的升高而上升,而必需氨基酸(essentical free amino acid,EAA)的含量变化不显著,因此,TOFAA在渗透压调节方面的作用主要取决于NEAA。发挥主要渗透压调节作用的FAAs为脯氨酸(Pro)、丙氨酸(Ala)、甘氨酸(Gly)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)。Ala、Gly、Asp、Glu属于鲜味氨基酸(taste amino acid,TAA),研究表明,NEAA中的TAA在渗透压调节方面作用显著,Pro含量的升高对TOFAA含量的增加作用显著,盐度为40~50尤甚,表明Pro在梭子蟹高渗调节中发挥重要作用。     

急性盐度胁迫对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)“黄选1号”血清渗透压及离子含量的影响

为探索三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)“黄选1号”在盐度适应过程中血清渗透压和离子浓度的变化特点及规律,进而了解其渗透压调节机理,设置盐度为5、10、20和50共4个实验组,以盐度30的自然海水为对照组,进行三疣梭子蟹“黄选1号”急性盐度胁迫实验.结果显示,各实验组血清渗透压呈规律性交化,0-12 h期间,低盐实验组血清渗透压较对照组表现为下降,盐度为50的高盐实验组,血清渗透压表现为上升;12-72 h期间,各实验组血清渗透压达到稳定状态.随着胁迫盐度的升高,血清与环境介质渗透压的差值先减小后稳定,与外界环境未出现等渗现象.血清中Cl-、Na+、K+含量的变化与血清渗透压的变化相似,但血清与环境介质离子含量的差值表现为Cl-、Na+含量差值先下降后稳定,C含量差值表现为先上升再下降最后稳定.研究表明,三疣梭子蟹“黄选1号”渗透压调节类型属于高渗调节型,Cl-和Na+在渗透压调节中起主要作用,提示三疣梭子蟹“黄选1号”具有较强的渗透压调节能力,对生存环境盐度的变化具有较强的适应能力.     

不同近交程度对三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)繁殖性能的影响

以本实验室建立的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)全同胞家系为研究对象,通过连续观测6代三疣梭子蟹近交家系的抱卵量、排幼量、孵化率、单位体重抱卵量、单位体重排幼量及幼体发育各阶段的变态率6个指标来评价近交对三疣梭子蟹繁殖性能的影响.方差分析显示,在实验亲蟹的规格大小对测量数据无影响的条件下,近交系数每增加10％,各近交代与非近交代F1m在单位体重抱卵量与单位体重排幼量的差异不显著(P＞0.05),这2个指标的近交衰退系数分别为-2.789％～-6.620％和-1.188％～-5.938％;孵化率的差异也不显著(P＞0.05),衰退系数为-1.859％～-7.222％,表明没有明显的近交衰退;由溞状幼体(Z)阶段、大眼幼体(M)阶段到Ⅱ期幼蟹阶段的变态率变化趋势可知,随着近交代数的增加,各阶段的变态率呈下降趋势.     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)两种养殖塘水体古菌的季节变化

结合基于古菌16S rRNA 基因的末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)技术与克隆测序技术对象山港三疣梭子蟹–脊尾白虾混养模式下改良塘 M1(塘底铺网、四周铺砂的养殖塘)以及传统塘M2(土塘)不同季节水体古菌群落结构和多样性进行分析。结果显示,M1、M2养殖塘水体古菌群落均由泉古菌门(Crenarchaeota)和广古菌门(Euryarchaeota)组成。M1、M2水体古菌群落组成在养殖初期较相似,但随着养殖时间的推移,古菌群落结构组成发生显著差异。M2养殖水体古菌群落结构随时间变化的差异性大于 M1,说明 M2养殖生态古菌群落稳定性低于 M1,底铺网、四周铺砂的改良措施可以减少古菌群落变化的幅度。相关性分析发现,多样性指数高时,古菌分布受环境的影响较小;2种养殖塘水体古菌分布受温度、溶解氧、总氮和总磷的影响较大。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus) 4个地理群体体色差异分析

对鸭绿江口、莱州湾、海州湾、舟山4个野生群体的三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)头胸甲颜色进行观察及大螯斑点、头胸甲斑点、游泳足斑点数量统计,采用单因子方差分析和判别分析法对其进行比较。结果显示,4个地理群体头胸甲颜色存在显著差异,斑点数量存在显著或极显著差异;对样本所属群体进行判别分析,4个群体雌蟹的综合判别率为53.3%,其中海州湾最高,为83.3%;莱州湾最低,为30.0%;说明根据斑点数量不能精确完成个体群体归属判定。建立4个群体各自的判别函数公式,通过对同样环境下养殖的4个群体子代进行单因素方差分析,发现子代间差异减少;而家系结果显示,子代头胸甲颜色和亲本差异较大,斑点为中间型。综合以上数据初步判定,三疣梭子蟹体色受环境和遗传共同作用,且环境因素为主导因素。     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)耐低盐的遗传力估计

应用数量遗传学原理和全同胞组内相关法估计三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)Ⅱ期幼蟹和80日龄稚蟹耐低盐性状的遗传力。实验中采用梭子蟹室内人工控制定向交尾方法,构建了32个全同胞家系,包括9个半同胞家系。测定Ⅱ期幼蟹和80日龄稚蟹在盐度11胁迫下的存活率分别为55%和64%,差异显著。利用SPSS软件的一般线性模型(GLM),计算存活率变量的方差组分,估计耐低盐性状的遗传力。基于全同胞方差组分分析显示,全同胞方差组分估计的遗传力是对三疣梭子蟹两个发育阶段狭义遗传力的无偏估计值,Ⅱ期幼蟹耐低盐遗传力为0.18,属于低度遗传力;而80日龄稚蟹耐低盐遗传力为0.20,属于低度遗传力。因此,家系选育方法更适于三疣梭子蟹耐低盐新品种培育。     

低盐胁迫对三疣梭子蟹鳃和肝胰腺显微结构及家系存活的影响

在实验生态条件下研究了低盐环境对三疣梭子蟹鳃丝和肝胰腺显微结构、家系存活率的影响。研究结果表明,低盐(15.0、13.0、11.0、9.0)胁迫能够诱导鳃丝和肝胰腺显微结构改变。盐度为15.0时,上皮层变薄,B细胞数量增多;盐度为13.0时,鳃丝不规则增厚,B细胞数量进一步增多,肝小管中的R细胞的数量减少,柱状上皮细胞的细胞质内出现许多空泡;盐度为11.0时,上皮层出现解体,鳃腔中的血细胞明显增多,肝细胞空泡化现象更为严重;盐度为9.0时,上皮层破坏直至解体,B细胞中转运泡数量增多,体积增大,细胞结构损伤严重。以72h的低盐半致死盐度(LD50=11.1)为评价指标,检测24、48、72h共计10个家系对低盐的耐受性。各家系对照组(盐度为35.0)在实验期间均未出现死亡现象,而在低盐胁迫条件下,随着时间的逐渐延长,各家系的存活率均呈下降趋势,24、48、72h的存活率变化范围分别在64.44%~80.00%、50.00%~68.89%和33.33%~60.00%之间。各家系72h时的存活率大小顺序为J10J4J9J5J7J3J6J2J8J1,均显著低于各自的对照组(P0.05)。     

盐度胁迫下三疣梭子蟹Ferritin基因的原核表达

为验证Ferritin基因是否对三疣梭子蟹的盐度胁迫具有适应性, 利用PCR扩增获得了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)第六对鳃的Ferritin基因, 将该目的基因克隆到表达载体pET28a(+)中, 转化大肠杆菌DE3(BL21), 并进行IPTG诱导表达。结果表明: 经诱导的转pET28-Ferritin重组质粒菌株有特异的表达蛋白条带出现, 与预期的理论值(19.448 kD)相符合; 高盐胁迫下, 转重组质粒的大肠杆菌比转pET28空载质粒存活率显著提高(P< 0.001), 并且随盐度升高, 两者差异越显著。这表明Ferritin基因能够提高大肠杆菌的盐度耐受力, 由此推测Ferritin基因参与了三疣梭子蟹盐度适应的生理过程。本研究旨在为生产过程中三疣梭子蟹养殖水体的盐度调控策略提供理论依据。

     

三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3基因克隆鉴定及表达分析

为初步研究三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)几丁质酶PtCht3的生物学功能,利用特异性引物扩增和SMARTTM RACE技术克隆获得三疣梭子蟹PtCht3基因全长cDNA序列,并对该序列进行分析.结果显示,三疣梭子蟹PtCht3基因全长为1409 bp,对PtCht3基因序列推导出的氨基酸序列进行分析可知,该基因编码由394个氨基酸组成的蛋白质,预测分子量为43.67 kDa,理论等电点为4.80.PtCht3蛋白亲水性总平均数为-0.097,属于稳定蛋白.同源性和系统进化分析发现,PtCht3与日本仿长额虾(Pandalopsis japonica)和中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)几丁质酶3的同源性分别为54％和53％,与其他甲壳动物几丁质酶3聚为一支.RT-PCR显示,PtCht3基因具有较强的组织表达特异性,在肝胰腺中的相对表达量最高,在三疣梭子蟹蜕皮前期表达上调,低盐胁迫后在鳃和肝胰腺中表达量出现了波动,总体呈先上升后下降的表达趋势.推测PtCht3可能在三疣梭子蟹消化和蜕皮过程中发挥重要作用,参与三疣梭子蟹渗透压调节进程.本研究为三疣梭子蟹几丁质酶的功能研究提供了重要信息.     

盐度对三疣梭子蟹成熟前后呼吸代谢的影响

为了探讨三疣梭子蟹对不同盐度水平的生理响应以及成熟前后的生理变化,实验采用水化学和酶学方法,研究了盐度(15、20、25、30和35)对成熟前后三疣梭子蟹耗氧率、排氨率、氧氮比(O∶N)以及己糖激酶(HK)、丙酮酸激酶(PK)、琥珀酸脱氢酶(SDH)和乳酸脱氢酶(LDH)4种呼吸代谢酶活力的影响。结果发现:1.盐度与规格的交互作用对三疣梭子蟹呼吸代谢无显著影响(P>0.05);2.盐度对三疣梭子蟹耗氧率的影响不显著(P>0.05),但显著影响其排氨率(P<0.05);成熟前后的三疣梭子蟹耗氧率和排氨率差异显著(P<0.05);3.盐度对三疣梭子蟹O∶N未产生显著影响(P>0.05),三疣梭子蟹成熟前O∶N显著高于成熟后(P<0.05);4.除LDH外,盐度对三疣梭子蟹呼吸代谢酶活力影响不显著(P>0.05);除鳃中SDH和LDH外,三疣梭子蟹呼吸代谢酶活力随生长发育发生显著变化(P<0.05)。研究表明,规格对三疣梭子蟹呼吸代谢的影响高于盐度,长时间盐度驯化可能减弱甚至消除三疣梭子蟹在不同盐度水平下代谢的差异。     

三疣梭子蟹蜕皮激素受体EcR基因的cDNA克隆及表达分析

通过简并引物扩增及Smart TM Race技术,首次克隆了三疣梭子蟹Portunus trituberculatus蜕皮激素受体EcR基因cDNA全长序列。该基因全长2 996bp,编码一个由503个氨基酸组成的多肽,预测理论等电点pI为7.33,分子量大小为55.69kDa。同源性及系统进化分析表明,三疣梭子蟹EcR基因与青蟹、拟穴青蟹、大西洋招潮蟹、陆地蟹、美洲螯虾、褐虾、日本对虾的同源性分别为94%、90%、88%、84%、82%、73%、66%。荧光定量RT-PCR结果表明,EcR在肝胰腺、卵巢、肌肉、眼柄、鳃和心脏中均有分布,在肝胰腺中表达量最高,在心脏中最低。高盐(45)胁迫下,EcR基因的表达量在24h后显著低于对照组(P0.05),总体呈下降趋势;低盐(11)胁迫条件下,EcR转录组的表达量呈现先降低后上升的趋势,在12h达到最低,之后逐渐上升,在48h之后显著高于对照组(P0.05)。     

梭子蟹溶藻弧菌病的初步研究

2005～2006年,昌邑池塘养殖梭子蟹发生被称为"牙膏病"的疾病,并导致大量死亡。发病时间主要在7～9月份的高水温期,病蟹典型症状是肌肉白浊、无弹性、呈不透明的乳白色。从病蟹的肌肉、肠道、胃、眼球、肝胰腺均分离到单一形态的微生物,经生理生化鉴定为溶藻弧菌。人工感染实验发现,其对健康梭子蟹具有致病性,出现与自然发病蟹相同的症状,并在人工感染病蟹中分离出同样性状的菌株,证实其为该病病原菌。     

三疣梭子蟹个体发育早期的同工酶谱变化

采用垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳技术研究了三疣梭子蟹个体发育早期（从未受精卵到第一期幼蟹）11种同工酶（LDH、GDH、ADH、SOD、EST、ME、MDH、SDH、GOT、ACP和α-AMY）酶谱的变化：结果表明,三疣梭子蟹EST、ME、MDH、SDH、GOT、ACP和α-AMY等7种同工酶电泳图谱显示了明显的发育阶段差异性,大都随发育渐趋复杂。个体发育阶段特异性的同工酶可以作为一项生化指标用于三疣梭子蟹发育阶段的鉴别。在三疣梭子蟹整个胚胎和幼体发育过程中均未能检测出LDH和GDH活性,而ADH和SOD酶活性则有持续和较稳定的表现。根据各同工酶的个体发育谱式,三疣梭子蟹个体发育过程中同工酶的表达类型被划分为4种。讨论了三疣梭子蟹同工酶的个体发生多念性和刚孵化的第一期涵状幼体的同工酶活性。     

三疣梭子蟹体内As的蓄积特异性研究

本研究以三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)为实验生物,应用半静态双箱模型的方法在室内模拟了三疣梭子蟹对砷(As)生物富集过程,As暴露浓度梯度分别为5、20和100 μg/L。通过对三疣梭子蟹体内总砷含量变化进行非线性拟合,得到其对总砷的生物富集系数(BCF)、生物富集动力学参数。结果显示,三疣梭子蟹肝胰腺组织对总砷的BCF明显高于肌肉组织。到富集实验结束时,三疣梭子蟹肝胰腺组织中由低到高浓度组对总砷的BCF分别为21.21、15.07和10.31,吸收速率常数(k1)及BCF均随水体中As浓度的增加而减少;肌肉组织中,由低到高浓度组对总砷的BCF分别为5.17、3.74和5.83,5、100 μg/L实验组各动力学参数较为接近,但20 μg/L实验组的富集速率常数k1最小,释放速率常数(k2)最大。研究表明,三疣梭子蟹BCF和生物学半衰期B1/2最小。     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp,包括4832 bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15 kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,Pt DNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12 h (4倍),随后逐步下降,在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后Pt DNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。     

三疣梭子蟹PtDNMT1基因的克隆及其 在低盐适应中的表达分析

甲基转移酶是维持基因组甲基化状态的重要基因,本研究利用SMART-RACE技术克隆了三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)甲基转移酶基因(PtDNMT1)。PtDNMT1基因cDNA序列全长5919 bp,包括4832 bp的开放阅读框,编码1610个氨基酸,预测分子量为148.15 kDa,理论等电点为4.68。结构预测发现,PtDNMT1有2个特殊的结构域,分别是锌指结构域(zf-CXXC)和甲基转移酶家族特有的Dcm结构域。进化树分析显示,PtDNMT1基因与昆虫类的DNMT基因聚为一支。组织表达分析发现,PtDNMT1基因在肝胰腺、鳃、卵巢、肌肉、胃、心脏、血液中均有表达,其中在肝胰腺中表达最高,卵巢和鳃次之。进一步研究了低盐胁迫后PtDNMT1基因在鳃、肝胰腺和肌肉组织中的表达变化规律为胁迫6 h时鳃组织中PtDNMT1基因的表达即达到峰值(5.3倍),并一直持续到12 h (4倍),随后逐步下降,在72 h时仍显著高于对照组(2.3倍);PtDNMT1基因在肝胰腺中的表达规律类似于鳃,然而其达到峰值的时间稍晚于鳃(24 h),且上调倍数高于鳃(8倍);低盐胁迫后PtDNMT1基因在肌肉中的表达最初呈现下调趋势,之后(24 h)上调表达至峰值(2.2倍),且一直上调表达至72 h。本研究首次克隆了PtDNMT1基因,根据其在各组织中的表达分布特征以及盐度胁迫后的表达变化情况,推测DNA甲基化在三疣梭子蟹低盐适应中发挥了重要作用。     

地膜池塘三疣梭子蟹育苗试验

设计一种地膜池塘,进行梭子蟹育苗试验,结果表明:试验地膜池塘梭子蟹育苗的成活率比较对照池塘有显著提高(p0.05),试验池塘成活率6.95%,对照池塘4.25%,单位出苗量试验池塘1325.8 ind/m3,对照池塘1140.5 ind/m3。试验池塘可以彻底避免才女虫的滋生和天津厚蟹的危害。该方法为蟹类生态池塘育苗新模式,具有良好的推广价值。     

温度对三疣梭子蟹行为的影响

描述了三疣梭子蟹的摄食、领域、防御、攻击及清洁行为。三疣梭子蟹在水温12℃以上摄食行为加强,领域与攻防行为也很明显,攻防主要其螯肢。三疣梭子蟹的清洁行为比较复杂,在光强度变化较大时较为明显,一般要持续15~20min。随着温度的降低,三疣梭子蟹的摄食、攻防、领域行为都明显减弱。