副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)中溶源噬菌体与其宿主菌致病力的相关性

急性肝胰腺坏死病(Acute Hepatopancreatic Necrosis Disease,AHPND)是由副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)引起的对虾病害,本研究从患AHPND的凡纳滨对虾样品中分离得到5株副溶血弧菌,采用致AHPND的副溶血弧菌(VPAHPND)的相关质粒的引物AP2进行PCR检测,表明这5株菌中均存在AHPND相关质粒。利用丝裂霉素C进行溶源性噬菌体筛选和噬菌体诱导发现,其中2株副溶血弧菌(20130629002S01和20130726001S01)可能存在溶源性噬菌体感染;从经0.5μg/ml丝裂霉素C诱导的20130629002S01和20130726001S01中分别分离得到两种噬菌体phage1和phage2。透射电镜观测显示,phage1为有尾噬菌体,phage2为球形噬菌体。将上述5株副溶血弧菌进行卤虫无节幼体人工感染实验,结果显示,它们对卤虫无节幼体均有致病力,且各分离株的毒力表现出显著性差异;20130629002S01和20130726001S01两株带有溶源性噬菌体的副溶血弧菌的致病力显著低于无噬菌体的副溶血弧菌(20130721001S02)。本研究结果表明,5株VPAHPND分离株都含有AHPND相关的质粒,表现出显著的毒力差异,可能携带不同的溶源噬菌体,也可能不携带溶源噬菌体,溶源噬菌体与副溶血弧菌各分离株的毒力并无必然相关性。     

一株副溶血弧菌噬菌体的分离与鉴定

分离到2株副溶血弧菌噬菌体,筛选出其中具有强裂解性的1株.该噬菌体的噬菌斑中心清亮,边缘有晕环.12 h观察,噬菌斑直径约3 mm,效价为1011pfu/ml.该噬菌体的核酸为线型双链DNA,大小约4 kb.电镜观察显示,头部为正二十面体,直径约110 nm,有尾,尾长约270 nm,底部有3个刺突.按国际病毒分类委员会第五次报告的分类标准,该噬菌体具肌尾噬菌体科的特征,与其他副溶血弧菌噬菌体比较显示,该噬菌体可能是一种新型的副溶血弧菌噬菌体.     

水体使用副溶血弧菌噬菌体对对虾体内宿主的防治研究

研究在水体使用噬菌体对感染病原菌对虾的治疗效果。在水体使用浓度分别为1×106,1×105,1×104pfu/mL的噬菌体对人工感染副溶血弧菌的凡纳滨对虾进行生物防治实验。结果显示,施加噬菌体的实验组对虾的死亡率明显低于对照组,对虾发病症状也较轻。凡纳滨对虾各组织器官含菌量实验表明,噬菌体对水体宿主裂解的同时,对虾体内器官的副溶血弧菌也被明显清除。水体中加入噬菌体使感染副溶血弧菌对虾体内的血细胞含量保持相对稳定。水体使用噬菌体对对虾副溶血弧菌病有积极的治疗作用。     

氨氮胁迫下凡纳滨对虾对副溶血弧菌的易感性

为探讨养殖水体中总氨氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)"急性肝胰腺坏死综合征(Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome,AHPNS)"发生的影响,设置了1个对照组和4个不同质量浓度氨氮实验组:2.5、5.0、7.5、10.0 mg/L实验组,胁迫20 d后腹肌注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行感染。凡纳滨对虾感染后6–24 h,除对照组外,各实验组均出现死亡高峰。24 h后,5.0、7.5和10 mg/L实验组对虾累积死亡率均高于2.5 mg/L组,且在同一取样时间各实验组对虾累积死亡率随着氨氮浓度的升高而升高,48 h后各实验组对虾不再死亡,其累计死亡率分别为0、8%、12%、20%和36%。PO活性呈现先升高再降低的趋势,对照组、2.5和5.0 mg/L实验组PO活性差异性不显著(P0.05),7.5和10 mg/L实验组除12 h外均显著低于对照组(P0.05)。SOD活性呈现先升高后下降的趋势,7.5和10 mg/L实验组SOD活性在感染后除24 h外均显著高于对照组(P0.05),而2.5 mg/L实验组与对照组差异性不显著(P0.05)。对照组和2.5 mg/L实验组对虾LSZ活性在各取样时间点差异性不显著(P0.05),7.5和10 mg/L实验组对虾LSZ活性在3 h、6 h、24 h、48 h时间点显著低于对照组(P0.05)。感染6 h后各实验组对虾肝胰腺中Lv LT m RNA表达量开始上升,24 h后开始下调,至72 h恢复至原水平。实验结果表明,氨氮胁迫能降低凡纳滨对虾的非特异性免疫酶活性,影响对虾肝胰腺中Lv LT m RNA对病原刺激的应答反应,增加对副溶血弧菌的易感性,为预防凡纳滨对虾AHPNS的暴发,养殖水体中总氨氮浓度应控制在1.96 mg/L以下。     

两株副溶血弧菌噬菌体的分离鉴定及裂解性能

为探究副溶血弧菌的生物防治方法,自水产品市场污水排放处及青岛岸边海水中分离出两株副溶血弧菌噬菌体VPp2、VPp3.借助噬菌斑形态、电镜、酶切等技术对其进行了分类鉴定,测定了其裂解谱、最佳感染复数、一步生长曲线并研究其裂解性能.分类鉴定结果表明,VPp2、VPp3分别属于2株不同的噬菌体.其核酸均是线型双链DNA,均具有正二十面体的头部及较长的尾部,且均属肌尾科噬菌体.VPp2头部直径约64 nm,尾长约114 nm.VPp3头部直径约89 nm,尾长约106 nm.裂解性能研究结果表明,VPp2、VPp3在双层平板上均能形成清晰透亮的噬菌斑.其裂解谱相同.最佳感染复数均较小,潜伏期均较短,VPp2的裂解量只有11.1,而VPp3的裂解量可达45.3,是符合条件的潜伏期短裂解量大的噬菌体,可进一步应用于噬菌体治疗及检测等.     

副溶血弧菌对斑节对虾和日本对虾的致病力研究

作为条件致病菌的弧菌,前人对其致病性已作了大量的研究,但不同研究者得出的结果很不一致,有的甚至相互矛盾［1－4］,其差异主要在于浸泡感染能否使健康对虾致病。因此,本实验以不同的感染方式以及不同的实验条件,对斑节对虾体内分离出的副溶血弧菌的致病力进行研究,以便了解对虾弧菌病的发病条件。１材料与方法１.１材料 对虾：体长７～９ ｃｍ的健康斑节对虾（Ｐｅｎａｅｕｓ ｍｏｎｏｎｄｏｎ）和日本对虾（Ｐ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）,直接购于养殖场。 菌株：对虾病原菌一副溶血弧菌（Ｖｉｂｒｉｏ ｐｏｒａ－ｈａｅｍｏｌｙｔｉ…     

凡纳滨对虾感染致急性肝胰腺坏死病副溶血弧菌(VpAHPND)的定量分析

对虾急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease, AHPND)是由致AHPND副溶血弧菌(AHPND-causing Vibrio parahaemolyticus, VpAHPND)携带的pVA1-like质粒所表达的PirAVp和PirBVp毒力蛋白对对虾肝胰腺的急性毒性所致。本研究用2.19×105 CFU/ml VpAHPND分离株20130629002S01对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)进行浸泡感染,于感染后2~9 d采集对虾的肝胰腺、鳃、肠道、肌肉组织,采用实时荧光定量PCR方法,检测各组织中的pirAVp拷贝数。结果显示,感染后凡纳滨对虾各组织均能检测到pirAVp,其中,肝胰腺在感染后第4天达到峰值, 为8.71×104 copies/mg,而鳃、肌肉、肠道分别在第3、4、5天达到峰值,分别为9.08×103、2.59×104、5.76×104 copies/mg。早期感染鳃组织中先出现VpAHPND的富集,在高死亡发生期,VpAHPND数量在肝胰腺和肠道出现高峰,在死亡数量逐渐下降的后期,各组织的VpAHPND均快速下降,肠道、肝胰腺和肌肉中的VpAHPND水平趋于接近。对虾肝胰腺组织病理切片显示,同一时间有临床症状的病虾和濒死对虾相比,濒死对虾表现出更严重的AHPND病理特征,且二者的组织病理特征均随着感染时间的延长变得更为严重,但检测到的VpAHPND数量呈下降趋势。研究表明,在VpAHPND感染过程中,组织中的pirAVp基因数量不能代表对虾的发病程度,发病程度及组织病理严重的AHPND样品中VpAHPND的数量不一定处于高水平状态。     

亚硝酸盐氮胁迫下凡纳滨对虾对副溶血弧菌的易感性

为探讨亚硝酸盐氮胁迫对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)急性肝胰腺坏死综合征(Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome, AHPNS)发生的影响, 设置1个凡纳滨对虾对照组和4个不同亚硝酸盐氮质量浓度 (2.0、4.0、6.0和10.0 mg/L) 胁迫组, 亚硝酸盐氮暴露20 d, 于凡纳滨对虾后腹肌注射副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行感染。观察到在感染后9~24 h各实验组出现死亡高峰, 濒死对虾表现出与AHPN相同的临床症状, 48 h后, 各实验组对虾不再出现死亡, 对照组和各实验组对虾累计死亡率分别为0、4%、8%、16%和24%。其中, 4.0 mg/L实验组对虾累计死亡率与2.0 mg/L实验组差异不显著(P>0.05), 但显著低于6.0和10.0 mg/L实验组(P<0.05)。感染副溶血弧菌后, 对照组、2.0和4.0 mg/L组凡纳滨对虾血清ALT活性先上升后下降, 6.0和10 .0 mg/L实验组血清谷丙转氨酶(ALT)活性持续上升。对照组和2.0 mg/L实验组对虾血清谷草转氨酶(AST)活性先上升, 96 h后开始下降, 4.0、6.0和10.0 mg/L实验组AST活性持续升高。对照组、2.0和4.0 mg/L实验组对虾ALP活性呈现先升高后降低的趋势, 6.0和10.0 mg/L实验组对虾碱性磷酸酶(ALP)活性持续降低。对照组对虾溶菌酶(LSZ)活性在各取样时间点显著高于6.0和10.0 mg/L实验组(P<0.05), 而与2.0和4.0 mg/L实验组差异不显著(P>0.05)。结果表明, 亚硝酸盐氮胁迫能降低凡纳滨对虾的免疫力, 增加其对副溶血弧菌的易感性。为预防AHPNS的暴发, 养殖水体中亚硝酸盐氮质量浓度应控制在4.0 mg/L以下。

     

引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病的副溶血弧菌MLST新序列型

针对12株引起凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)的致病性副溶血弧菌,运用多位点测序技术,分析致病菌株的遗传特征。实验选择副溶血弧菌的7个管家基因dnaE、gyrB、recA、dtdS、pntA、pyrC及tnaA,对12株AHPND致病菌扩增测序。将核酸序列上传至PubMLST数据库进行比对后获得每株菌的序列型。收集其他地区AHPND致病性副溶血弧菌的多位点序列分型(MLST)数据,采用eBURSTV3及MEGA5.0软件进行遗传进化分析。结果显示,2014年中国广东分离的AHPND致病株属于一个新序列型ST1710(42、134、99、79、141、41、51),仅与库中ST415及ST975同源性较高。目前,急性肝胰腺坏死致病株的9种ST型可归为2个克隆组和5个单体。经系统发育树进一步分析可知新序列型ST1710与单体ST975遗传关系相近。本研究首次报道中国AHPND分离株的序列型,丰富了PubMLST数据库,并为其遗传进化研究奠定了理论基础。     

副溶血弧菌致病因子与耐热直接溶血毒素的研究进展

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,作为人类致病菌它能够在很广的范围内造成由食物中毒引起的肠胃炎和败血症[1-2].该菌最早是由Fujino等[3]在日本发生的一次爆发性食物中毒中发现并成功分离的一种多形态杆菌,其在不含盐的培养基内不能繁殖,而在含盐浓度较高(超过3%)的培养基中生长旺盛,并广泛存在于海岸和海水中.     

一株副溶血弧菌的分离和鉴定

从患病的凡纳滨对虾体内分离了一株致病菌。对该菌进行了常规的生理生化鉴定,确认该菌为副溶血弧菌;该菌在第6 h就进入对数早期,对数期一直持续到22 h;用该菌腹腔注射小白鼠,对小白鼠半数致死量LD50为7.6×106cfu/g。     

Characterization and growth conditions of Vibrio parahaemolyticus strains with different virulence degrees that cause acute hepatopancreatic necrosis disease in Litopenaeus vannamei

The phenotypic characteristics and growth kinetics at several temperatures, salinities, and pH values of three Vibrio parahaemolyticus (Vp) strains with different virulence and one nonpathogenic strain were evaluated. Independent of the virulence of the strain, a high metabolic diversity was found, which yielded different colored phenotypes on the CHROMagar? Vibrio. All strains were resistant to ampicillin and carbenicillin, and Vp AHPND+ organisms were the most sensitive to enrofloxacin. The exponential growth of Vp strains started at 1–2 hr of incubation, although no relationship was observed between the bacterial density and degree of virulence. Moreover, the growth of the most virulent strain was independent of the nutrients in the incubation media during the initial hour postinoculation. No strain grew at 4°C in 0% NaCl and pH 4, but only Vp AHPND+ grew at 44°C. For all strains, the lag phase was proportional to the NaCl concentration, and the growth was better at pH 8–9. However, the Vp AHPND? strain displayed a greater variability, was more sensitive to extreme conditions, and showed a lag phase of 9 hr independent of the pH.     

对虾肝胰腺坏死病副溶血弧菌双重微流控荧光定量PCR快速检测技术的建立与应用

急性肝胰腺坏死病(AHPND)是对虾养殖过程中最常见、最严重的疾病,给对虾养殖造成重大经济损失。AHPND病原种类多、基因型复杂,现有的针对不同病原的检测技术目标导向较弱、检测成本高、时间消耗长,对虾健康养殖亟待开发AHPND的精准快速诊断技术。本研究针对AHPND病原体携带编码一种二元毒素pirA和pirB大型质粒的遗传共性,基于pirA和pirB基因设计特异性引物并建立微流控荧光定量PCR检测方法。该方法对致病基因pirA和pirB特异性强、灵敏度高,最低检测限分别为5.43×10⁰和4.31×10¹ copies/μL,样品平均检测时间为26min左右。为进一步评估该方法在实际应用中的准确性,以含有pirA和pirB毒性质粒的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)进行人工感染实验。结果表明,感染后的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)鳃丝、肝胰腺、肠道和肌肉等组织随时间的推迟均能检测到pirA和pirB;从感染2h的结果来看,pirB比pirA检出率更高。此外,致病因子pirA和pirB比toxR...     

凡纳滨对虾急性肝胰腺坏死病(AHPND)病原分离鉴定及其致病性分析

本研究从患急性肝胰腺坏死病(Acute hepatopancreatic necrosis disease,AHPND)的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中分离到一株优势菌,编号为20160303005-1,通过16S rRNA和分子伴侣蛋白groEL基因序列分析,并结合生理生化特征,将该细菌鉴定为副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus),其血清型为O1:KUT(K untypeable)。基因分析结果显示,该菌株携带可引起对虾AHPND的相关毒力蛋白基因pirA~(VP)和pirB~(VP),但不携带副溶血弧菌临床菌株毒力基因:耐热直接溶血毒素(Thenmostable direct hemolysin,tdh)和相对耐热直接溶血毒素(TDH-related hemolysin,trh)基因。菌株对凡纳滨对虾具有较强的致病性,浸泡感染的半数致死剂量(LD_(50))为7.96×10~3 CFU/ml。对虾急性感染后,6 h肝胰腺颜色变浅,肠胃变空;9 h肝胰腺呈浅白色,萎缩变小。9 h死亡数过半,24 h全部死亡。组织病理学分析显示,感染后对虾肝胰腺小管崩塌,上皮细胞严重脱落,呈现出典型的AHPND病理症状。药敏实验结果显示,该菌对庆大霉素、环丙沙星和头孢他啶等16种药物敏感,对阿莫西林、替卡西林和头孢噻吩等5种药物表现为耐药。上述研究可为该病原的流行病学及药物防控研究提供基本数据。     

Occurrence of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus among milkfish farms in Zanzibar

ABSTRACT

Fishing is among the main economic activities of the people of Zanzibar. Few fish dealers are transforming this sector into mariculture. Among the farmed fish is milkfish. Diseases are among the limiting factors in the development of the mariculture industry. Among other zoonotic diseases, vibriosis is caused by bacteria from the genus Vibrio. This study aimed to establish the occurrence of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus among milkfish farms in Zanzibar. A total of 380 milkfish were sampled. Swabs were collected from gills, intestine, and kidney of each sampled milkfish. Preliminary identification of V. cholerae and V. parahaemolyticus was done by biochemical tests. PCR was run on 16S rRNA, outer membrane protein W, and collagenase genes to confirm Vibrio species, V. cholerae, and V. parahaemolyticus respectively. Almost one-third (32.1%) of all sampled milkfish were found to contain targeted Vibrio; 18% and 29.5% of the sampled milkfish were positive for V. cholerae and V. parahaemolyticus respectively.     

克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定及药敏特性

为了净化水产养殖环境,减少克氏原螯虾(Procambarus clarkii)由于养殖规模不断扩大而感染副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)导致的大量死亡,寻求安全有效的防治措施,开展了克氏原螯虾副溶血弧菌的分离鉴定及药敏特性试验。2018年5月从湖北省公安县某养殖场采集到一批患病的克氏原螯虾,解剖后发现病虾的肝胰腺肿大发黄,肠道内无食物,有类似肠炎症状,从肝胰腺中分离出的致病菌经TCBS培养,得到光滑蔓延生长的菌落,呈蓝绿色斗笠状,菌落大小不一。显微观察发现细菌形态为棒状或弧状,长短不一,革兰氏染色呈红色,属于革兰氏阴性菌,细菌形态单一;通过分析其16S rDNA序列和生理生化特征,鉴定为副溶血弧菌并命名为Vp-2,其与弧菌属种类同源性最高,并与菌株Vibrio parahaemolyticus DQ068942.1的亲缘关系较近。通过纸片扩散法进行药敏试验,该菌株对氟苯尼考、卡那霉素、复方新诺明等7种抗生素敏感;对利福平、磺胺异恶唑、庆大霉素耐药。生理生化特性测定结果显示,菌株Vp-2的理化特性基本与标准菌株一致。人工回感试验表明,发病克氏原螯虾的症状与自然...     

副溶血性弧菌增菌培养基及培养条件的改进

对副溶血性弧菌增菌培养基及培养条件进行了改进和优化,建立一种更适用于副溶血弧菌增菌的方法。针对能够决定副溶血弧菌综合营养需求的2个最为关键的因素:混合蛋白胨、酵母浸膏以及两者交互作用,进行试验设计,结合统计学软件对结果进行直观分析和方差分析,验证最佳培养基和培养条件。直观分析表明,副溶血弧菌增殖过程中,混合蛋白胨是最主要因素,其次为酵母浸膏。方差分析表明,混合蛋白胨与酵母浸膏对副溶血弧菌生长的影响均显著。最佳培养基配方为:混合蛋白胨2%(胰蛋白胨1%、鱼蛋白胨1%)、酵母浸膏0.2%、NaCl 3.5%、pH8.6;最佳培养条件为:(36±1)℃+摇床120 r/min+2层牛皮纸封口。本优化培养基与培养条件用于副溶血弧菌增菌培养,在相同培养时间内,其增菌菌液浓度为GB/T4789.7-2008方法的(1.8±0.6)倍。