5种食源性致病菌多重PCR检测方法的建立

本研究建立一种同时特异性地检测5种常见食源性致病菌的多重PCR方法。根据目前食品中常见病原菌副溶血弧菌Vibrio parahaemolyticus、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus、单核细胞增生性李斯特菌Listeria monocytogenes、肠炎沙门氏菌Salmonella enteritidis、福氏志贺氏菌Shigella flexneri的相关毒力基因,选择具有特异性的副溶血弧菌不耐热溶血毒素基因、金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因、单核细胞增生性李斯特菌编码溶血素O基因、沙门氏菌侵袭蛋白A基因及志贺氏菌侵袭性质粒抗原H基因,设计5对特异性引物进行多重PCR检测,对反应条件进行优化并评价了其特异性和灵敏度。通过对48份实际样品检测,验证了此多重PCR体系具有很好的可靠性和实用性。     

对虾6种病毒多重PCR检测方法的建立

本研究针对养殖对虾6种病毒,包括白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)、肝胰腺细小病毒(HPV)、桃拉综合征病毒(TSV)、对虾杆状病毒(BP)和传染性肌肉坏死病毒(IMNV),选择各自的基因分别设计特异性引物和探针,首先进行了单一病毒的PCR验证,在此基础上建立了同时特异性检测6种对虾病毒的多重PCR检测体系。对反应条件进行优化并进行特异性和灵敏度的验证。50μl反应体系,Mg2+的最佳浓度为5mmol/L,ExTaq酶最佳用量为3.75U,反应程序中最佳退火温度为55.5℃。6种病毒之间以及与对虾基因组都存在很好的特异性。最终经试验验证,该系统的检测灵敏度对WSSV可达104拷贝,IHHNV可达102拷贝,HPV可达104拷贝,TSV可达103拷贝,BP可达105拷贝,IMNV可达105拷贝。虽然该多重PCR方法灵敏度不如单一的PCR检测高,但是通过实际样品检测验证了该方法省时、消耗较少,又不失准确性,在实际应用中具有可靠性和应用价值。     

水产品中4种常见致病菌多重PCR检测方法的建立及评价

根据金黄色葡萄球菌的耐热核酸酶基因nuc、沙门氏菌的侵袭蛋白基因invA、志贺氏菌的侵染性质粒抗原H基因ipaH和副溶血性弧菌的毒力表达调控基因toxR设计引物,建立一种快速检测水产品中上述4种常见食源性致病菌的多重PCR方法。结果显示,沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌及副溶血性弧菌的多重PCR扩增片段产物大小分别为549、426、348和243 bp,该检测方法具有良好的特异性和灵敏度。设计优化了可用于水产样品中4种目标致病菌的共增菌培养基,该方法应用于35份实际水产样品的检测,并与国标方法对比验证,4种致病菌的整体符合率达94%以上,两种检测方法无显著性差异(P>0.05)。可见,该多重PCR方法可应用于水产品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌及志贺氏菌4种食源性致病菌的快速检测和分子流行病学调查。     

同时检测两种对虾病毒和4种弧菌的同步PCR方法的建立

通过检索、多重比对、分析和筛选GenBank中对虾白斑综合征病毒(WSSV)、传染性皮下和造血器官坏死病毒(IHHNV)、副溶血孤菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌的基因序列,设计了10对特异性引物,以已知毒株和菌株的DNA为模板进行PCR,均能扩增出与实验设计相符合的DNA片段,对PCR扩增条件进行优化,建立了可同时检测鉴别WSSV、IHHNV、副溶血弧菌、创伤弧菌、哈维氏弧菌和溶藻胶弧菌,并且能同时区分WSSV不同地理毒株的同步PCR方法.研究结果表明,该方法检测特异性好,检测通量大,适合于对虾多种病原的同时检测.     

多重PCR在创伤弧菌快速检测中的应用

建立多重PCR方法检测水体及海产品中的创伤弧菌。针对创伤弧菌的gyrB基因的不同位点设计了3对引物,扩增片断的大小分别为481、702、1065bp。该方法的灵敏度为10^2cfu／ml。共对3种海产品进行了创伤弧菌的检测,结果在3种海产品中均能特异性地检测到创伤弧菌。该方法快速,灵敏度高,特异性强。为海产品及水体中的创伤弧菌的检测提供了有效的方法。     

3种淡水鱼病原菌多重PCR检测方法的建立与应用

根据辽宁地区常见淡水鱼病原菌嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌、蜡样芽孢杆菌的相关毒力因子,选择特异性较强的嗜水气单胞菌的溶血素(hlyA)基因、迟钝爱德华氏菌的效应蛋白(eseD)基因、蜡样芽孢杆菌非溶血性肠毒素(nheA)基因为分子靶标,分别设计1对特异性引物,建立可同步检测3种菌的多重PCR检测体系。研究结果显示,在3个毒力基因引物浓度均为0.4μmol/L,模板质量浓度为2.5 ng/μL,dNTP和酶添加量分别为2.5μL和0.3μL,退火温度为55℃时,各目的片段均可较好地扩增。敏感性试验结果表明,建立的多重PCR对嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的最低检测量分别为4.8、3.0 ng和2.6 ng。对临床分离的菌株样本进行检测,与16S rDNA分子鉴定结果的符合率为100%。建立的多重PCR体系检测方法特异、灵敏、快速,可同步完成淡水鱼源的嗜水气单胞菌、迟钝爱德华氏菌和蜡样芽孢杆菌的检测。     

养殖大黄鱼病原弧菌多重PCR检测技术的建立和应用

溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、副溶血弧菌(vibrio parahaemolyticus)和哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是浙江省养殖大黄鱼(Pseudnosciaena crocea)弧菌病的主要致病菌.本研究选择针对溶藻弧菌和副溶血弧菌的胶原酶基因,哈维氏弧菌的部分ToxR基因的特异性,优化设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,建立了一种检测致病性弧菌的多重PCR检测方法.经过琼脂糖凝胶电泳后的条带分析判断,可以在一个PCR管中同时成功地检测这3种病原细菌,含溶藻弧菌、哈维氏弧菌和副溶血弧菌3种致病弧菌核酸的阳性对照样品分别扩增出大小为737 hp、382 bp和271 bp的预期产物,其灵敏度是102～102 CFU/mL.将该方法应用于检测人工感染后的养殖大黄鱼病鱼肝脏和肾脏,结果在6份组织样本中,5份检出原始感染菌株,与API 20E鉴定结果相符;对弧菌病流行季节采集的未发病的16份养殖大黄鱼组织样本和16份水体样本进行抽检,结果在1份大黄鱼组织样本中检出哈维氏弧菌,7份水体样本中检出这3种弧菌中的1种或2种,鉴定结果与API 20E鉴定结果符合率为93.75%.说明该方法不仅可以检测发病鱼,还可以检测无病症带菌大黄鱼以及带菌水样,且说明海洋水体中存在着大黄鱼弧菌病的致病菌.结果说明,多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,可以缩短检测时间,降低检测成本,该方法的建立对养殖大黄鱼弧菌病的快速诊断和分子流行病学的调查具有重要意义.     

致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的建立

致病性嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是近年中国各地大规模流行的淡水养殖鱼类暴发性疾病的主要病原,本研究针对GenBank中登录的致病性嗜水气单胞菌的气溶素基因(hlyA)、溶血素基因(aerA)以及为气单胞菌属所特有的内参照基因16S rRNA保守区设计了3对特异性引物,通过进行多重PCR反应体系优化,多重PCR产物的测序鉴定与特异性和敏感性实验,试图建立一种检测致病性嗜水气单胞菌的多重PCR检测方法。对8株嗜水气单胞菌、16株相关菌株进行多重PCR检测,结果显示,非致病性分离株均未扩增出毒力基因hlyA和aerA,而致病性分离株则至少含有hlyA基因;对40份送检的水产动物样品进行多重PCR检测,结果与常规微生物学检测符合率为97.5%。多重PCR检测方法具有较高的敏感性与特异性,最低可检测模板量为10 ng的样品。该方法的建立对水产动物嗜水气单胞菌病的快速诊断和分子流行病学的调查有重要意义。     

多重PCR检测对虾白斑综合症病毒和传染性皮下组织坏死病毒

采用对虾白斑综合症病毒和传染性皮下组织坏死病毒的特异引物,在一个PCR反应中同时扩增到大小分别为271 bp和356 bp的病毒特异片段,多重PCR条件优化后可从最少100 fg级病毒DNA模板中定性检测出此两种病毒。     

Development of a multiplex PCR system for the simultaneous detection of white spot syndrome virus and hepatopancreatic parvovirus infection

A multiplex PCR kit for simultaneous detection of white spot syndrome virus (WSSV) and hepatopancreatic parvovirus (HPV) was developed and field testing was conducted. A 604‐bp target sequence was selected from the vp28 gene of WSSV. A primer set was developed to amplify a 338‐bp DNA fragment at the junction of the NS2 and NS1 protein genes of HPV after alignment of eight sequences from different strains. Another internal positive control primer set produced a 139‐bp PCR fragment from the β‐actin gene by alignment of this gene from Litopenaeus vannamei, Fenneropenaeus chinensis and Penaeus monodon. The detection limits, tested using purified plasmids, for WSSV and HPV were 21.4 and 19.0 copies respectively. The optimum ratio for HPV, WSSV and β‐actin was 3:1:1, with an optimum annealing temperature of 57°C. Field test of the multiplex PCR with 170 L. vannamei individuals from 17 aquaculture farms showed 41.8% coinfection with WSSV and HPV, and 40.0% and 3.5% single infection with WSSV and HPV respectively. No virus‐free shrimp farm was found. Ten wild catch F. chinensis individuals showed 60% coinfection, and 40% were infected with HPV.     

对虾IHHNV荧光定量PCR检测方法的建立

根据G enBank中对虾传染性皮下和造血器官坏死病毒( IHHNV) 保守基因序列( AF218226), 设计合成了1对引物和1条TaqM an探针, 建立了检测IHHNV的荧光定量PCR技术。将建立的荧光定量PCR检测方法与常规PCR对比。结果显示, 所建立的荧光定量PCR 方法灵敏度可达2个拷贝, 比常规PCR 灵敏度高1 000倍。对保存的15份经常规PCR检测为IHHNV 阳性的DNA 样品进行荧光定量PCR检测, 结果都为阳性, 检测的病毒含量为2. 15 @ 107 ~ 4. 21 @ 104 拷贝/LL。用该方法对不同浓度的样品进行了重复检测, 表明该方法具有良好的重复性, 可满足IHHNV的临床诊断需要。     

采用OIE标准检测养殖对虾中传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)的PCR检出类型

利用世界动物卫生组织(OIE)推荐的4对引物(389F/R、392F/R、77012F/77353R 和309F/R),通过普通 PCR 方法,对本实验室2011?2012年采集于国内不同地区的对虾样品进行 IHHNV(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus)检测,并对国内存在的 IHHNV 检出类型进行初步分析。检测结果显示,在凡纳滨对虾、斑节对虾、中国对虾、宽沟对虾中均检测出了 IHHNV,而在脊尾白对虾中未检出。其中凡纳滨对虾阳性率最高,中国对虾阳性检测率最低。对虾样品2011年阳性率高于2012年,华东地区高于华北、华南两地。此外,根据4对引物的检测结果,得到国内 IHHNV 的4种 PCR 检出类型。     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)微卫星多重PCR体系的建立及其在家系亲权鉴定中的应用

为了在遗传分析研究中提高效率并节约成本,本研究从已报道的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)微卫星位点中选取多态性较高的位点,基于各位点的扩增片段大小及退火温度等因素进行微卫星位点的组合.通过不断优化位点组合、反应体系及反应程序,成功建立了1个五重、2个四重和1个三重PCR反应体系,并将其应用于11个凡纳滨对虾家系的亲权鉴定.结果显示,四组多重PCR体系中的16个微卫星位点在11个凡纳滨对虾家系中的平均等位基因数(Na)为6,平均多态信息含量(PIC)为0.5813,平均观测杂合度(Ho)为0.513,平均期望杂合度(He)为0.636.利用Cervus3.0软件,对已知系谱关系的11个凡纳滨对虾家系进行亲权分析,其第一亲本累积排除率(CE-1P)、第二亲本累积排除率(CE-2P)和双亲累积排除率(CE-PP)分别为0.99525487、0.99990862和0.99999986.进一步分析表明,当同时使用四组多重PCR体系进行亲权分析时,其模拟配对率和亲权鉴定准确率均为100％,全同胞和半同胞家系鉴别效果良好,表现出准确的鉴别能力.本研究所建立的四组凡纳滨对虾微卫星多重PCR体系均可为后续的凡纳滨对虾遗传多样性分析和亲权鉴定提供高效、准确的检测手段.     

Detection of tilapia lake virus (TiLV) infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia (Oreochromis niloticus) from Lake Victoria

Tilapia lake virus disease (TiLVD) has emerged to be an important viral disease of farmed Nile tilapia (Oreochromis niloticus) having the potential to impede expansion of aquaculture production. There is a need for rapid diagnostic tools to identify infected fish to limit the spread in individual farms. We report the first detection of TiLV infection by PCR in farmed and wild Nile tilapia from Lake Victoria. There was no difference in prevalence between farmed and wild fish samples (p = .65), and of the 442 samples examined from 191 fish, 28 were positive for TiLV by PCR. In terms of tissue distribution, the head kidney (7.69%, N = 65) and spleen (10.99%, N = 191), samples had the highest prevalence (p < .0028) followed by heart samples (3.45%, N = 29). Conversely, the prevalence was low in the liver (0.71%, N = 140) and absent in brain samples (0.0%, N = 17), which have previously been shown to be target organs during acute infections. Phylogenetic analysis showed homology between our sequences and those from recent outbreaks in Israel and Thailand. Given that these findings were based on nucleic acid detection by PCR, future studies should seek to isolate the virus from fish in Lake Victoria and show its ability to cause disease and virulence in susceptible fish.     

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV) PCR检测方法的建立

对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)病是国际兽疫局(OIE)划定的甲壳类其他重要疾病之一,它分布较广,危害严重,对世界对虾养殖业发展影响重大.本文根据Genbank登录的IHHNV基因序列(AF218266),设计了1对特异性引物,从纯化的IHHNV DNA和感染IHHNV凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)组织DNA中成功地扩增出产物大小为703bp的DNA片段,该对引物对IHHNV DNA的检测灵敏度为19.85fg(8.83×103病毒拷贝),与健康对虾组织DNA、对虾白斑综合征病毒(WSSV) DNA及对虾肝胰腺细小病毒(HPV) DNA无交叉反应.本方法可快速、灵敏、特异地检测出对虾感染和携带IHHNV状况,为对虾健康养殖、无特定病原(SPF)种群选育及流行病调查提供了有效的检测手段.     

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)及虾肝肠胞虫(EHP)的荧光定量PCR检测

2013年,河北、天津等地区养殖的凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)育苗期出现死苗、出苗率低的情况,生产上,仔虾个体大小差异较大,造成了严重损失.本研究采用荧光定量PCR方法(Real-time PCR)对天津大港地区采集的108尾凡纳滨对虾仔虾样品进行单尾病原检测.结果显示,传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus,IHHNV)和虾肝肠胞虫(Enterocytozoon hepatopenaei,EHP)均有检出.IHHNV阳性检出率100％,每微克对虾组织DNA的病毒拷贝数为103-107,且个体较大的样品(1.2-2.0 cm)携带病毒拷贝数偏高;EHP阳性检出率为49.1％,每微克对虾组织DNA的拷贝数为103-105,且集中于个体较小样品(0.7-1.1 cm).对IHHNV和EHP阳性凡纳滨对虾样品进行生物学体长与病毒载量指数相关性分析,显示IHHNV载量指数与对虾生长速率呈正相关,虾组织IHHNV平均载量达8.51×104 copies/μg DNA,为较高的感染水平;EHP的载量与对虾生长速率呈负相关关系,与较大个体阳性检出率较低相对应,虾组织EHP平均载量达到2.19× 104 copies/μg DNA,为较高的感染水平.由此,该批凡纳滨对虾仔虾患病为IHHNV和EHP的混合感染所致,本研究数据为IHHNV和EHP病原混合感染流行情况及其对养殖育苗期仔虾生长的影响提供科学依据.     

洪湖碘泡虫单管半巢式PCR检测方法的建立及应用

在异育银鲫（）引起的“喉孢子虫病”常会导致池塘养殖苗种和成鱼大量死亡。因此,建立一种特异性强、灵敏度高和易于操作的检测方法对于该病的早期诊断以及防治具有重要意义。本研究基于洪湖碘泡虫18S rDNA基因序列设计合成两组特异性引物,通过外引物组和单条内引物组合及条件优化,建立了洪湖碘泡虫单管半巢式PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度及临床应用分别进行了验证。结果显示,该检测方法特异性好,只有洪湖碘泡虫扩增为阳性,瓶囊碘泡虫（Thelohanellus wuhanensis）及异育银鲫肌肉样品等均为阴性;最低检测灵敏度极限为4.2 copy/μL;对疫区养殖池塘健康异育银鲫的卵巢、肾脏及脾脏组织样品检测发现洪湖碘泡虫阳性率分别为40%、32%和8%,检出率显著高于普通PCR。因此,本研究所建立的检测方法特异性强、灵敏度高,可应用于洪湖碘泡虫的早期快速检测。     

Estimating oxygen consumption of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) in a raceway: A Precision Fish Farming approach

The Precision Fish Farming (PFF) approach was applied to the estimation of fish oxygen consumption of rainbow trout in a raceway farm. A dynamic model, simulating the evolution of Dissolved Oxygen concentration, was identified: the daily oscillation of fish oxygen consumption rate was simulated by means of a sinusoidal function. The model was applied to the data set collected during a four-week field study, which was carried out in July 2019. Water temperature and Dissolved Oxygen concentration were measured with an hourly frequency in farm influent and effluent. Fish biomass was monitored on a daily basis by combining the data provided by a state-of-the art system for non-invasive estimation of fish weight distribution with mortality counting. The monitoring period was partitioned into two time-windows, as fish was not fed during the first two weeks. These windows were further partitioned into a calibration and validation set. Three model parameters, i.e. the average daily respiration rate, the amplitude of its daily oscillation, and its phase were estimated by fitting the model output to the time series of DO concentration in the effluent. The results of the calibration show that: 1) the daily average oxygen consumption rate is consistent with the literature; 2) the amplitude of the daily oscillation when fish is regularly fed is more than twice that estimated for fasting fish. The results of the validation suggest that the model could be used to implement a cost-effective automatic control of oxygen supply, based on the short-term prediction of oxygen demand.