池塘养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物、附着基和底泥中的菌群结构及其相关性

2014年10月,利用PCR-DGGE技术分析了标准化养殖池塘中仿刺参(Apostichopus japonicus)肠含物及附着基和底泥中细菌的菌群结构及其相关性。结果显示,仿刺参肠含物、附着基、底泥中细菌多样性较高,分别平均获得30.00±1.00、15.33±1.70、21.67±2.62条带,肠含物中细菌种类数显著高于附着基和底泥。聚类分析和戴斯系数表明,不同池塘的仿刺参肠含物样本单独聚为一支,相似性达到0.785,附着基和底泥样品聚为一支,平均相似性达到0.532。不同样品DGGE图谱中20条优势条带的切割、克隆、测序,共获得了20条细菌序列,表明肠含物细菌种类以聚球藻属(Synechococcus sp.)、脱硫杆菌属(Desulfobacterium)、脱硫叠球菌属(Desulfosarcina sp.)、极地杆菌属(Polaribacter)、Algibacter sp.为主,附着基中主要以Robiginitalea sp.和Silicibacter sp.为主,底泥样品中主要以假单胞菌属(Proteobacterium)、噬胞菌属(Cytophaga)、Desulfosarcina sp.为主,肠含物中细菌特有种类的分离与鉴定为仿刺参养殖潜在益生菌的开发提供基础数据。     

海星棘皮投喂仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka)的效果

在饲料中添加海星棘皮,与两组商品饲料分别投喂体重为5.0–6.7 g的仿刺参(Apostichopus japonicus Selenka),进行60 d养殖试验,研究其对仿刺参平均增重率(AWGR)、特定生长率(SGR)、饲料系数(FCR)、摄食率(FR)和蛋白表观消化率(APD)的影响。结果显示,各组仿刺参生长良好,成活率无显著差异(P>0.05);60 d时,各组仿刺参的AWGR和SGR变化趋势相同,由高到低依次为市售2组、海星组、市售1组;海星饲料组仿刺参的FCR最低,与其他两组间差异不显著(P>0.05);海星饲料组与市售1组的FR间差异不显著(P>0.05),与市售2组FR间有显著差异(P<0.05);海星饲料组仿刺参的饲料转化率(FE)明显高于其他两组(P<0.05);海星饲料组仿刺参的APD最高,为67.28%,与市售1组的APD差异显著(P<0.05)。研究表明,添加海星棘皮可以较好地促进仿刺参的生长和提高饲料的利用,可添加到仿刺参幼参饲料中用作饲料源。     

南移池塘养殖仿刺参肠道菌群结构分析

本文基于MiSeq高通量测序技术对南移福建池塘养殖仿刺参(Apostichopus japonicus)肠道菌落结构进行分析。结果表明,仿刺参前肠(1 C_1)、中肠(1 C_2)和后肠(1C_3)测得的分类操作单元(OTUs)分别为424、444和414;三组样品的菌群物种丰度没有较大差别,但优势菌种存在较大差异;优势菌群方面,后肠的优势菌群为Haliea属和乳球菌属(Lactococcus)(分别占后肠总菌数的11.97%和10.37%),而前肠和中肠的优势菌群均是乳球菌属和芽孢杆菌属(Bacillus),两者在前肠菌落中的占比分别为27.91%和6.08%,在中肠中的占比分别为33.24%和6.97%。在重复性方面,三组样品的菌落组成都有重叠,重叠率为74.35%,其中前肠与中肠相似度较高,菌株种类有90%以上重叠。本文研究为仿刺参肠道益生菌的开发利用提供基础资料。     

青、白刺参(Apostichopus japonicus)体壁营养成分的比较分析

通过对相同养殖环境条件下,青、白刺参(Apostichopus japonicus)体壁中营养成分(粗蛋白、粗脂肪、多糖、脂肪酸、氨基酸、微量元素等)的测定,比较两种剌参的营养品质与价值.结果显示,青、白刺参的出皮率,体壁中的水分、多糖和灰分含量差异显著(P＜0.05),粗蛋白和粗脂肪差异不显著(P＞0.05).青、白刺参体壁中均检测出20种主要脂肪酸,脂肪酸总量和多不饱和脂肪酸(PUFA)的含量差异不显著(P＞0.05),而青刺参饱和脂肪酸(SFA)含量显著高于白刺参,单不饱和脂肪酸(MUFA)含量显著低于白刺参(P＜0.05).MUFA中青刺参的花生四烯酸(AA)和二十二碳六烯酸(DHA)含量均显著低于白刺参(P＜0.05).青、白刺参体壁中检测出17种氨基酸,必需氨基酸(EAA)、鲜味氨基酸(FAA)和药效氨基酸(DAA)的含量均无显著差异(P＞0.05).青刺参体壁中天冬氨酸和精氨酸含量均显著低于白刺参(P＜0.05).青刺参体壁中Mn和Cr的含量显著低于白刺参(P＜0.05).重金属元素Pb、Cd、Hg、As的含量均符合相关食品卫生标准.综合评价认为,相同养殖环境条件下,白刺参的出皮率、多糖含量、脂肪酸中不饱和脂肪酸含量、AA和DHA的相对百分含量、氨基酸中天冬氨酸和精氨酸含量以及微量元素中Mn和Cr含量均优于青刺参.     

两种甘薯饲料原料的营养成分及其对仿刺参(Apostichopus japonicus)摄食与生长的影响

在刺参配合饲料中添加6个比例(10％、20％、30％、40％、50％、60％)的甘薯块根粉与甘薯蔓茎粉,测定两种甘薯饲料原料的营养成分及其对仿刺参摄食与生长的影响.结果显示,甘薯块根粉中粗蛋白含量为10.01％,甘薯蔓茎粉中粗蛋白含量为5.54％;每100 g甘薯块根与蔓茎粉中氨基酸总量分别为7.33 g和4.37 g.在30 d的实验期间,投喂添加甘薯块根粉饲料的实验组仿刺参平均体重随实验时间呈上升趋势,实验结束时,10％和20％组特定生长率(SGR)显著高于对照组(P＜0.05), 30％组SGR与对照组差异不显著(P＞0.05).投喂添加10％甘薯蔓茎粉的实验组仿刺参SGR与对照组差异不显著(P＞0.05),其余各组SGR均低于对照组(P＜0.05).投喂添加10％、20％甘薯块根粉饲料的实验组仿刺参食物转化率(FCE)显著高于对照组(P＜0.05),投喂添加10％甘薯蔓茎粉饲料的实验组FCE与对照组差异不显著(P＞0.05),其余各实验组仿刺参FCE显著低于对照组(P＜0.05).结果表明,当甘薯块根粉和甘薯蔓茎粉添加比例分别低于30％和10％时,可满足刺参的营养需求,提高饲料利用效率,保证并促进仿刺参的摄食与生长.     

刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘环境中优势益生菌筛选及其特性分析

2014年12月-2015年12月,在大连地区刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘进行了春、夏、秋、冬四季有益菌分离筛选,从其水体和底泥中共分离得到66株细菌.以刺参“腐皮综合征”主要病原菌——灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验,利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定,最后通过安全性实验得到潜在益生菌株YQ-2.结果显示,该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用,抑菌圈分别达到22 mm和24 mm;对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22 mm和36mm.安全性实验显示,该菌株无论是在108 CFU/ml浸浴还是投喂108 CFU/g的粉末饲料感染,30 d内供试刺参没有发病和死亡现象,健康程度好,且相对于对照组的体重明显增长,108 CFU/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31％.此外,本研究对YQ-2菌株的生理生化指标、16S rDNA序列进行了分析,其同源性与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain KLP2015相似度达99％,故将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌.该株枯草芽孢杆菌在大水面刺参池塘四季水体中数量为140-280 CFU/ml,高于其他菌株;同时,该菌株在水体中还具有较高的优势度,优势度分别为4.2％、3.5％、2.6％、4.6％,冬、春季节的优势度明显高于夏、秋季节;它属于土著分离菌株,对引起刺参腐皮综合征的2株病原菌具有较强的抑制作用,这对刺参大水面生态养殖具有较大的应用潜力.     

外源硒对仿刺参(Apostichopus japonicus)重要生理相关酶活性及体内硒含量的影响

在水温为16-18℃时,将平均体重为(60.75±0.32)g的仿刺参(Apostichhopus japonicus)饲养在150 cm×120 cm×60 cm的水箱中,通过在基础饲料中添加富硒酵母,使7组饲料中硒的浓度分别为0、0.20、0.40、0.80、1.60、3.20和6.40 mg/kg,进行为期28 d的生长实验,并对其体壁、消化道、呼吸树、肌肉等不同组织消化酶活力、免疫酶活力进行测定,探讨不同水平的外源硒对仿刺参生长、相关酶及体内硒含量的影响,并用氢化物发生-原子荧光光谱法进行仿刺参体内硒含量分析.结果显示,添加适宜浓度的硒提高了仿刺参的成活率(最高达100％)、消化酶和免疫酶的活性,蛋白酶(35.13 U/mg prot)和淀粉酶(0.51 U/mg prot)的最高活性分别为对照组的2.45倍和2.07倍.硒浓度为0.80-1.60 mg/kg时,仿刺参各组中的超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)活性最高,显著高于其他组;仿刺参各组中的硒含量均有不同程度的上升,有机硒的提高倍数大于无机硒,说明富集到体内的硒以有机硒为主.研究表明,硒浓度为0.80-1.60 mg/kg时,仿刺参的养殖效果最佳.本研究丰富了仿刺参的营养学内容,为仿刺参健康、高效、可持续养殖提供了一定的参考依据.     

生物絮团对水质的调控作用及仿刺参(Apostichopus japonicus)幼参生长的影响

采用模拟实验与现场实验相结合的方法,通过添加3种微生态制剂及碳水化合物作为碳源,研究了其在生物絮团形成与水质调节中的作用,并分析了其对水中无机氮含量、悬浮物、细菌总数及幼参生长的影响,为阐明生物絮团在刺参工厂化苗种培育中的生态环境调控作用提供依据。结果表明,亚硝态氮易于在培育池水体中累积,可高达0.25 mg/L;添加芽孢杆菌后,水中总悬浮物含量和细菌总数均为最高值,且未检测到弧菌和大肠菌群;第20天,仅添加蔗糖组幼参增重与特定生长率均明显高于其他复合碳源组和对照组(P0.05),分别为44.34 g和2.19%/d;而添加蔗糖和芽孢杆菌组增重与特定生长率均明显高于其他处理组和对照组(P0.05),分别为66.60 g和3.01%/d;复合碳源组幼参增重与特定生长率随着玉米淀粉含量增加而逐渐降低,但与对照差异均不显著(P0.05)。结果显示,以蔗糖为碳源,添加芽孢杆菌形成的生物絮团不仅可以改善水体水质和微生态结构,还可以明显促进幼参的生长。     

中国刺参(Apostichopus japonicus)与韩国刺参杂交子一代生长和抗病力比较

采用完全双列杂交法对刺参中国群体(C)和韩国群体(K)进行群体间杂交和群体内自繁,获得C(♀)×C(♂)、K(♀)×K(♂)、K(♀)×C(♂)和C(♀)×K(♂) 4个交配组合的子一代。分析了各交配组受精率、孵化率、附着变态率、浮游幼体和幼参阶段的生长和抗病能力以及杂交子代的杂种优势。结果显示,杂交组与自繁组在受精率和孵化率等方面不存在显著性差异,杂交组附着变态率高于自繁组。C(♀)×K(♂)组在幼参期体长平均值均大于其他3个组,并表现出显著性差异,其体长杂种优势率在9.43%–23.75%之间;其体重从150日龄后表现出杂种优势,在4.09%–34.96%之间。而K(♀)×C(♂)组在幼参期体长和体重除在150日龄时表现为杂种优势,其他时间均表现为杂种劣势。K(♀)×C(♂)组抗灿烂弧菌病能力最强,杂种优势率为26.21%。     

普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参不同组织基因组DNA的MSAP研究

本研究分别以普通刺参(Apostichopus japonicus)和白刺参基因组DNA为实验材料,应用甲基化敏感扩增多态性(Methylation-sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术对刺参体壁、呼吸树和消化道3个组织的DNA甲基化水平和甲基化模式进行了研究,初步探讨了DNA甲基化对刺参组织间基因特异性表达的影响.结果显示,筛选得到的9对引物组合能够在普通刺参和白刺参两个群体中得到稳定扩增,在两群体刺参中分别检测到5932和5208个位点,均以未甲基化位点为主,普通刺参和白刺参未甲基化位点数分别为4317和3944,分别占总扩增条带数的72.78％和75.73％.普通刺参体壁的甲基化水平为31.07％,呼吸树为23.36％,消化道为26.34％;白刺参中体壁的甲基化水平为29.88％,呼吸树为23.25％,消化道为19.45％,由此可见,体壁的甲基化率在两群体中是最高的.普通刺参和白刺参同一组织间的甲基化水平和甲基化模式不同,同一群体体壁、呼吸树和消化道不同组织间的甲基化水平和模式也不同.甲基化在普通刺参和白刺参组织分化和发育过程中可能发挥着十分重要的作用.在检测的3个组织中,CCGG序列的全甲基化位点较半甲基化位点多.     

养殖仿刺参溃烂病病因初探

从患病仿刺参分离获得的两株优势菌2004—A1和2004—A2,经人工感染回接健康参试验,均获得与原发病相同症状,证实此两株菌是病原菌。另通过人工创伤感染试验确认海参受外伤后,容易感染发生溃烂病。     

利用塑料大棚晒水进行刺参种苗越冬试验

2002年11月~2003年4月,在瓦房店市交流岛前哨海参育苗厂800 m3水体室内水泥池中,投放平均规格为5000头/kg,刺参种苗196 kg(98万头)。在没有锅炉进行水加温条件下,利用600 m3水体塑料大棚晒水进行刺参种苗越冬,水温2.0~13.2℃,平均盐度31.2,pH值8.2,DO>7 mg/L,经过近6个月的培育,共培育出规格为876头/kg的参苗836 kg(73.2万头),成活率74.7%,总重量增加了8.5倍。     

复合蛋白酶在即食海参加工中的应用

用复合蛋白酶处理盐渍海参,作为加工冻干即食海参的预处理样品,研究其酶处理最适工艺。试验结果表明,酶处理温度40℃,处理50 m in,水浸泡13 h,酶用量为肉重0.075%时,处理后的海参胶原蛋白溶解度(DD%)为(38.14±0.52)%,与水发海参接近[(39.34±0.47)%],口感达到最佳。从酶处理海参和盐渍海参的红外光谱分析可知,二者的营养成分无明显差异,达到生产冻干即食海参的要求。     

发病仿刺参细菌的分离鉴定和生长特性的研究

从发病仿刺参中分离到5株菌,分别为痢疾志贺氏菌、有毒威克斯菌、奥斯陆莫拉氏菌、缺陷短波单胞菌和动物溃疡伯杰氏菌.经革兰氏染色和胞外酶活性剂生理生化特性的研究,确定了痢疾志贺氏菌、有毒威克斯菌、奥斯陆莫拉氏菌、缺陷短波单胞菌和动物溃疡伯杰氏菌的最佳生长条件分别是:35 ℃,pH 9,盐质量分数5%;25 ℃,pH 7,盐质量分数5%;25 ℃,pH 7,盐质量分数1%;25 ℃,pH 7,盐质量分数3%;35 ℃,pH 7,盐质量分数3%.能分解淀粉和蛋白,不能分解酯类.     

参虾池塘高效混养技术

7-9月刺参夏眠期间正是日本对虾快速生长的季节,在对虾池中人工造礁,第1年4月放入规格为80～120头/ kg的海参苗1740 kg,每年7月放入体长0.7～1.0 cm的日本对虾虾苗1.2×105尾,将刺参与日本对虾混养.在养殖过程中,刺参不投喂,只用卤虫、人工饲料、杂色蛤和四角蛤蜊投喂日本对虾,严格控制养殖池内的杂鱼虾,保持水质新鲜,可提高日本对虾和刺参的成活率,利用两者饵料和空间互补性,可显著提高虾池的利用率和经济效益.     

仿刺参线粒体全基因组序列结构及比较研究

利用已构建的仿刺参cDNA文库得到的线粒体DNA(mtDNA)相关基因序列设计扩增引物,测定了大连仿刺参线粒体基因组全序列,并对其进行了基因构成和进化分析。仿刺参线粒体基因组序列长16 109bp,其基因构成与其他后口动物基本一致,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和3个主要的非编码区。在其37个基因中,ND6、tRNASer(AGN)、tRNAGln、tRNAAla、tRNAVal、TrnaAsp位于L链上,其余均位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除ND1的起始密码子为GTG外,其余均以ATG作为起始密码子;除Cytb以"T"作为终止密码子外,其他蛋白质基因均具有完全的终止密码子,且在已知的棘皮动物线粒体蛋白质基因中,部分基因的起始和终止密码子表现出一定的纲内特异性。比较分析了大连、青岛、威海仿刺参线粒体基因组,三者的基因组成和排列相同,碱基组成相近,蛋白质编码基因的起始和终止密码子完全一致,但存在核苷酸和氨基酸序列的差异。三者的控制区序列存在多个插入/缺失和SNP位点。根据COI、Cytb和ND4计算了三者之间的遗传距离为0.006～0.018,遗传距离分析和系统进化关系分析都显示青岛仿刺参和威海仿刺参的关系较大连仿刺参更近。     

刺参(Apostichopus japonicus) 4个群体棘数的重复力估计

为了研究刺参(Apostichopus japonicus)棘数的重复力、棘数所需度量次数和棘数最大可能生产力(MPPA),本研究针对韩国自繁群体(KK)、多刺自繁群体(DD)、山东自繁群体(SS)和三元杂交群体(DK)4个刺参群体,采用数量遗传学方法估计了12–17月龄刺参棘数的重复力,计算并比较了4个群体棘数所需的度量次数、MPPA 及其与刺参体重的相关系数。结果显示,在12–17月龄时,4个群体刺参棘数的重复力从高到低依次为 DD(0.29)>DK(0.28)>SS(0.20)>KK(0.19),且均为低度重复力;对 DD 和 DK 群体棘数测量5次,测量相对准确率可达80%以上,而 SS 和 KK 群体则需要测量8次才能达到80%以上准确率;4个群体刺参棘数的 MPPA 从高到低依次为 DD(41.3)>DK(40.8)>KK(39.8)>SS(39.1),但仅 DD 和 SS 群体间存在显著差异(P<0.05);各群体内刺参棘数MPPA 与体重均呈现显著的表型正相关(P<0.05)。以棘数作为育种目标性状,其重复力和 MPPA 可作为选择群体的依据。研究表明,DD 和 DK 群体的棘数多于另外2个群体,并且具有更高的选育潜力,更利于性状测定。因此,可作为重点群体进行进一步选育。     

仿刺参纤维胶凝蛋白基因的分子特征及表达分析

纤维胶凝蛋白是非特异性免疫系统中的重要分子。通过转录组测序及cDNA末端快速克隆技术得到一条仿刺参纤维胶凝蛋白基因的全长cDNA序列,并将其编码的蛋白命名为仿刺参纤维胶凝蛋白-1。获得的基因cDNA全长为1951bp,其中5′-末端非翻译区为397bp,3′-末端非翻译区为666bp,开放阅读框为888bp,编码295个氨基酸,N端16个氨基酸为信号肽,信号肽后面有两个G-X-Y重复序列,C端为纤维蛋白素原结构域。采用实时荧光定量PCR方法分析了仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参幼参不同组织及细菌脂多糖刺激后的时序表达规律,结果显示仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有表达,且肠道的表达量最高;脂多糖刺激后,4种组织的仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因表达量均有变化,且以肠道和体壁表达量的变化最为显著;此外,仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参4种组织中的表达量变化具有不同的时序性,表明仿刺参纤维胶凝蛋白-1可能在仿刺参免疫应答中起重要作用。     

仿刺参甘露聚糖结合凝集素基因对脂多糖刺激的免疫应答

甘露聚糖结合凝集素是天然免疫系统中重要的模式识别分子。分析了仿刺参甘露聚糖结合凝集素在仿刺参不同组织及脂多糖刺激前后的表达规律,结果显示仿刺参甘露聚糖结合凝集素mRNA在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有组成型表达,且体壁的表达量最高;细菌脂多糖刺激后,4个组织的仿刺参甘露聚糖结合凝集素表达量均得到上调,且以肠道和体腔细胞表达量的变化最为显著;另外,肠道、体腔细胞、体壁中仿刺参甘露聚糖结合凝集素表达量峰值的出现具有明显的时序性,而呼吸树自刺激后6h直至取样结束,其表达量呈稳步上升趋势。