欧拉羊胎儿皮肤细胞的培养、保存与鉴定

用胰蛋白酶对欧拉羊胎儿皮肤组织进行热消化分离并培养原代细胞,通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞,扩大培养至第3代时用液氮保存,复苏后进行活力、形态、生长曲线、微生物污染检测和连续传代培养试验。结果显示,欧拉羊胎儿皮肤细胞呈成纤维型,复苏活力93.5%以上,生长良好,细胞生长曲线呈“S”型,最大增殖量为3.31×10⁵ mL^-1,倍增时间为26.2 h;细菌、真菌、病毒、支原体检测呈阴性,连续传代培养在10代内生长正常。表明欧拉羊胎儿皮肤细胞分离培养成功,使这一重要种质资源在细胞水平上得以保存。     

兰州大尾羊肾和睾丸组织细胞的分离培养和鉴定

兰州大尾羊是中国濒临灭绝的物种,通过体细胞培养和长期保存,在细胞水平上保存珍贵的种质资源。采用胰蛋白酶消化分离并培养原代肾细胞和睾丸细胞,并通过差速消化和差速贴壁法纯化成纤维细胞并用液氮保存,细胞复苏后进行活力、形态、生长特性、微生物污染和染色体等检查,保存兰州大尾羊26个个体的肾细胞和9个个体睾丸细胞,保存细胞生长良好,均呈成纤维型,平均复苏活力为98.6%和95.2%,生长曲线均呈“S”型,最大增殖密度分别为3.15×10⁵ mL^-1 和2.92×10⁵ mL^-1,倍增时间分别为29.3 h和30.8 h,细菌、真菌、病毒和支原体检查均为阴性,染色体为2n=54,二倍体占88%和90%,说明成功分离培养并保存兰州大尾羊肾和睾丸组织细胞。     

鸡胚肺动脉内皮细胞与平滑肌细胞的分离培养及鉴定

探索简单快速实用的鸡胚肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞培养方法:在严格无菌条件下对肺动脉内皮细胞和平滑肌细胞分离培养,待细胞融合度达约80%时进行传代,得到的内皮细胞利用差速消化法纯化,并观察2种细胞形态特征及培养特性,待细胞稳定生长后,采用荧光免疫组化技术鉴定细胞,并进行冻存和复苏,观察复苏后细胞活性。结果显示:24 h后组织块周围即有少量细胞爬出,内皮细胞大量生长后呈突起状排列,立体感强,平滑肌细胞在培养后的第5天呈现峰谷样外观,经免疫荧光法证明是内皮细胞和平滑肌细胞的纯培养,冻存于液氮中1~2个月复苏后细胞的活性都较好,可以恢复旺盛生长。结论:本研究提出的组织贴块法能成功获得内皮细胞和平滑肌细胞的纯培养,比酶消化法操作简单,更适合小血管内皮细胞、平滑肌细胞的原代培养。     

鸡胚破骨细胞的分离培养与鉴定

从18日龄鸡胚长骨(股骨和胫骨)中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法.结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜(TEM)和扫描电镜(sEM)对其形态和功能进行观察鉴定.结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点:属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝.结论:鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞.     

鸡胚破骨细胞的分离培养与鉴定

从18日龄鸡胚长骨（股骨和胫骨）中机械分离破骨细胞于盖玻片和骨片上培养,以建立鸡胚破骨细胞体外培养方法。结合倒置相差显微镜、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）染色、甲苯胺蓝染色及透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）对其形态和功能进行观察鉴定。结果表明,直接分离的细胞具有典型的破骨细胞的形态特点：属多核大细胞,TRAP染色阳性,能在骨片表面形成吸收陷窝。结论：鸡胚长骨机械分离法可获得一定数量并具有骨吸收活性的破骨细胞。     

鸭胚睾丸支持细胞的分离培养与鉴定

为探究鸭胚睾丸支持细胞的分离培养方法,选取２４日胚龄的麻鸭鸭胚４０个,取出睾丸,采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶二步消化分离睾丸细胞,差异贴壁与低渗处理的方法进行纯化,于３７℃,体积分数５％二氧化碳条件下培养,最终得到纯度较高的支持细胞．经染色鉴定,发现罗丹明１２３染色显示支持细胞中富含线粒体;ＡＫＰ检测发现８０％的细胞呈ＡＫＰ阴性;吖啶橙染色显示支持细胞细胞质中富含ＲＮＡ;油红Ｏ染色显示睾丸支持细胞细胞质中含有大量脂肪滴,细胞核内可见双极小体．本试验结果说明采用胶原酶Ⅳ与胰蛋白酶结合消化,经差异贴壁与低渗出处理纯化,可得到较高纯度的支持细胞;结合罗丹明１２３染色法、ＡＫＰ染色法、吖啶橙染色法与油红Ｏ染色法可有效鉴定支持细胞．     

鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚肾细胞和气管环培养中的适应性比较

将６株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分别接种鸡胚肾细胞（ＣＥＫＣ）和气管环培养（ＴＯＣ）。６株病毒无论是否已经适应于鸡胚，都在气管环培养中能引起病变。病毒适应于ＣＥＫＣ，是与病毒在鸡胚和细胞培养上的传代次数有关。分别用ＳＰＦ鸡胚、非免疫鸡胚和普通鸡胚制备的ＴＯＣ测定ＩＢＶ－Ｍ４１株的ＩＤ５０，结果用ＳＰＦ鸡胚和非免疫鸡胚制备的ＴＯＣ测定的ＩＤ５０都获得较高滴度，而在普通鸡胚制备的ＴＯＣ中ＩＤ５０明显低。     

常用分离培养肾细胞方法的比较

[目的]采用常用的分离培养肾细胞方法比较分离培养肾细胞,并提出优化方案。[方法]A法:组织块培养法;B法:1%胶原酶消化分离法;C法:5%胰蛋白酶消化法;D法:0.5%胰蛋白酶-0.02%EDTA连续分离法。[结果]A法初期细胞生长不好,1周后生长良好;B法、C法细胞贴壁状况较好,但细胞生长不均一,呈丘陵状生长,细胞产量较少;采用D法消化肾组织块,能够快速获得大量细胞,并且细胞生长整齐、均一,能够满足后续实验的需要。[结论]使用D法分离培养肾细胞优于其他3种方法,试验效果最佳。     

茶多酚对人胚肺细胞和猴肾细胞毒性的实验研究

通过体外实验,研究了绿茶中提取、纯化的茶多酚对人胚肺细胞和猴肾细胞的毒性作用,结果表明：当细胞培养液中茶多酚浓度分别为５００μｇ和６００μｇ作用１２小时后,大约有５０％的人胚肺细胞和猴肾细胞的生长受到抑制,随着细胞培养液中茶多酚浓度的提高和茶多酚对细胞作用时间的延长,茶多酚对这两种细胞的毒性增强。     

鸡传染性支气管炎病毒在鸡胚肾细胞和气管环培养中的适应性…

将６株鸡传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）分别接种鸡胚肾细胞（ＣＥＫＣ）和气管环培养（ＴＯＣ）。６株病毒无论是否已经适应于鸡胚，都在气环培养中能引起病变。病毒适应于ＣＥＫＣ，是与病毒在鸡胚和细胞培养上的传代次数有关。分别用ＳＰＦ鸡胚、非免疫鸡胚和普通鸡胚制备在ＴＯＣＩＢＶ－Ｍ４１株的ＩＣ５０，结果用于ＳＰＦ鸡胚和非免疫鸡胚制的ＴＯＣ测定的ＩＤ５０都获得较镐滴度，而在普通鸡胚制备的ＴＯＣ中ＩＣ５０明显低。     

Study on Complete Mitochondrial Genome of Oula Sheep (Ovis aries)

Mitochondrial genome has been widely used in species identification and gene conservation. In the present study, the complete mitochondrial genome of Oula sheep (Ovis aries ) was determined using next-generation sequencing. This genome was 16618 bp (NCBI accession number: KU575248) and contained 13 protein coding genes, 22 transfer RNA genes, two ribosomal RNA genes, and a typical control region. The overall nucleotide composition was 33.7％ A, 27.4％ T, 25.8％ C, and 13.1％ G, with a total A+T content of 61.1％. The phylogenetic analysis of selected sheep breeds showed that Oula sheep were clustered within branch A and originated from approximately 6 ka. This mitochondrial genome will provide valuable information for molecular genetic research of Oula sheep.     

新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞的原代培养及鉴定

[目的]建立一种高效、实用的新疆军垦细毛羊肾小管上皮细胞原代培养方案,为肾脏损伤引起的疾病研究奠定基础.[方法]取5～8个月大的出栏细毛羊肾脏皮质,剪成1～2 mm3大小组块,分别采用传统组织块法和改良组织块法,在含15;～ 20;新生小牛血清的DMEM的培养基中进行原代培养,无需研磨或使用酶和化学试剂,根据上皮细胞自身的生长特性,首次结合刮除法,相差消化法和差速贴壁法,分离纯化上皮细胞,再选用0.037 mm孔径网筛过滤除去肾小球上皮细胞,分离纯化培养肾小管上皮细胞,细胞免疫组化进行鉴定.[结果]改良方法与传统方法相比,细胞贴壁早,生长快,处理时间短,减少了污染机率,提高了细胞培养效率,分离培养的肾小管上皮细胞,纯度达90;以上,细胞呈多角形,鹅卵石状,折光性强,连接紧密,可传至第9代,免疫细胞化学(CK - 18)染色鉴定为阳性.[结论]改良的组织块培养与传统的组织块培养以及常用的酶消化培养相比,经济、简单、不易污染,分离培养的肾小管上皮细胞,活性高,纯度高,是一种高效、实用的细毛羊肾小管上皮细胞培养方法.     

引进肉羊胚胎移植技术应用的研究

利用胚胎移植技术对引进优质肉羊品种进行快速繁育,是加速育种进程与迅速提高我国绵羊肉用品质的捷径。本次非繁殖季节胚胎移植平均每只供体羊冲出可用胚4.8枚,最高为21枚,鲜胚移植妊娠率86.67%,总体达国内领先水平。     

无角道塞特羊胚胎移植技术研究

(1)超排处理无角道塞特绵羊163只,育成羊(76只)只均回收胚胎5.53枚,可用胚3.91枚,经产母羊(87只)只均回收胚胎7.55枚,可用胚6.34枚。经产羊平均回收胚胎总数高于育成羊(P<0.05)。春季和秋季之间超排效果差异不明显。重复超排羊和非重复超排羊之间平均回收胚胎总数和可用胚胎数差异均不显著(P>0.05)。(2)共处理受体876只,春季和秋季受体的同期发情率分别为56.37%和89.02%,发情受体利用率分别为84.67%和88.77%。(3)移植受体545只,妊娠318只,产羔396只,受体移植妊娠率为58.35%,移植胚胎成羔率为57.47%,在移植受体中,小尾寒羊的妊娠率最高为61.2%,同羊和内蒙细毛羊分别为54.62%和56.58%,受体品种之间移植妊娠率差异不显著(P>0.05)。受体黄体数对移植妊娠率及胚胎成羔率有一定的影响。胚胎的发育阶段对移植妊娠率也有影响,移植囊胚受体妊娠率最高为64.76%,明显高于早期桑椹胚移植妊娠率42.86%(P<0.05)。胚胎成羔率从桑椹胚到囊胚差异不显著(P>0.05)。     

蒙古绵羊胚胎大肠黏膜上皮的组织发生

[目的]研究蒙古绵羊胚胎大肠黏膜上皮的组织发生。[方法]利用组织学常规方法。[结果]蒙古绵羊胚胎大肠黏膜上皮的发育经历了单层细胞到复层细胞再到单层细胞的过程;杯状细胞在37 mm胚初见;90 mm胚直肠腺开始发育,142 mm胚盲肠、结肠肠腺开始发育。[结论]蒙古绵羊胚胎大肠黏膜上皮经历了单层细胞到复层细胞再到单层细胞的发育过程。     

欧拉型藏羊Callipyge基因多态性与生长性状相关性研究

利用PCR-SSCP方法,对215只欧拉型藏羊Callipyge基因序列的多态性进行了检测,并分析了AA和AB基因型与生长性状的相关性.结果表明:Callipyge基因存在AA、BB和AB 3种基因型,其基因型频率分别为0.823 3、0.009 3和0.167 4;测序结果显示:基因多态的产生是在扩增序列的第176bp处发生了C→T的突变;χ2检验表明,该群体在这一位点上处于Hardy-Weinberg平衡状态(P0.05),遗传杂合度和多态信息含量分别为0.168 7和0.154 5.对生长性状(体重、胸围和胸深)的相关性分析表明:AA和AB 2个基因型个体之间生长性状的差异不显著,但AB型有大于AA型的趋势.     

夏季放牧补饲对欧拉型藏羊羔羊育肥效果的研究

[目的]为藏羊羔羊夏季的育肥提供参考。[方法]选用6月龄欧拉型藏羊羔羊90只分为放牧组(对照组)和放牧补饲组(试验组),在夏季牧草旺盛期进行补饲育肥,研究青藏高原夏季不同育肥方式对藏羊羔羊育肥性能和肉品质的影响。[结果]试验组羔羊的净增重和平均日增重显著高于对照组(P0.05)。试验组羔羊的宰前活重、胴体重、屠宰率、胴体净肉重和胴体净肉率均极显著高于对照组(P0.01),而试验组羔羊的骨重、肉骨比、花油重和板油重均显著高于对照组(P0.05)。试验组羔羊的肌肉内脂肪含量为3.43%,显著高于对照组(P0.05)。试验组欧拉型藏羊羔羊的肉色评分、大理石和熟肉率均显著高于对照组(P0.05)。试验组和对照组羔羊肉中异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸酪氨酸的含量均高于FAO/WHO的标准模式。[结论]通过夏季补饲可进一步提高欧拉型藏羊羔羊的育肥效果。     

杜泊羊冷冻胚胎移植的影响因素

为进一步提高杜泊羊的冻胚移植成功率,于春秋两季同期处理湖羊和小尾寒羊受体共997只(次),同期发情782只(次),发情率达78.4%,其中湖羊春秋两季平均发情率为84.6%,显著高于小尾寒羊(73.9%)(P＜0.01),秋季两品种平均发情率83.3%,显著高于春季75.8%(P＜0.01);对431只发情受体羊进行移植,总妊娠率为58.5%(252/431),产羔率为58.0%(250/431).其中湖羊为受体的春秋两季平均妊娠率62.5%,高于小尾寒羊(54.7%);秋季两品种的平均妊娠率为64.8%,显著高于春季(52.5%).囊胚移植后的平均妊娠率为61.5%,显著高于桑椹胚(41.5%),其中A级囊胚为67.4%,显著高于B级囊胚(P＜0.05)和所有桑椹胚(P＜0.01);B级囊胚显著高于B级桑椹胚(P＜0.05),B级囊胚与A级桑椹胚间及A、B级桑椹胚间均无显著差异;C级囊胚和桑椹胚均未见妊娠.此外,受体羊卵巢黄体发育状况及移植技术熟练程度对妊娠率也有显著影响.     

牡丹胚离体培养的研究

[目的]探寻牡丹胚离体培养的最佳培养基。[方法]比较牡丹离体胚在添加有不同浓度的6-BA和NAA组合的MS基本培养基上的生长情况,筛选出最佳培养基。[结果]6-BA促进子叶生长,当浓度增大时对根的生长有抑制;NAA促进愈伤组织形成,抑制根的生长。[结论]0．2mg／L6-BA可以促进牡丹胚的胚轴、真叶、根的生长,有利于幼苗形成。