利用重叠延伸PCR技术进行定点突变研究(英文)

[目的]建立一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。[方法]以重组人组织型纤溶酶原激活剂rPA(Reteplase)基因为模板,采用重叠延伸PCR技术对3个位点进行定点突变,将突变基因片段克隆到克隆载体pEASY-Blunt上,并通过测序验证突变结果。[结果]测序结果表明3个位点的突变结果与预期完全一致,即第10位引入单个碱基A、第137位碱基C突变为G以及第686位碱基G突变为A,通过重叠延伸PCR技术一次引入3个突变碱基,100%的实现目的位点的定点突变。[结论]该研究成功实现目的位点的定点突变,为rPA基因的进一步克隆和功能研究奠定了基础。同时也表明重叠延伸PCR技术是一种高效、便捷、经济的DNA定点突变方法。     

利用搭桥PCR技术对蛋白质内含子HP进行改造(英文)

[目的]利用搭桥PCR技术对蛋白质内含子HP进行改造。[方法]根据搭桥PCR中寡聚核苷酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板的原则设计多对引物,通过多次PCR扩增获得目的基因片段,进而实现对蛋白质内含子HP在基因水平上进行多个位点同时定点突变和添加Linker。[结果]搭桥PCR产物克隆经DNA测序分析,证明蛋白质内含子HP内部的4个半胱氨酸成功突变成丝氨酸,几个PCR前体片段也无缝的融合成HP基因片段,而且没有引进任何其他突变;经DNA测序,46bp的DNALinker成功的插入到设计好的HP基因序列中,且没有任何碱基突变和错配。[结论]该研究不仅实现了对蛋白质内含子HP的快速改造,而且扩大了搭桥PCR的应用范围,同时也为蛋白质内含子的基础改造提供了低成本、简捷、高效的方法。     

阿维链霉菌aveD基因的定点突变(英文)

[目的]获得aveD基因定点突变株,为阿维菌素的遗传育种提供理论依据。[方法]采用重叠延伸PCR技术对aveD基因进行定点突变,并通过体外酶切连接等分子生物学操作,构建了aveD基因的定点突变载体pDC3(pKC1139∷aveD、),导入阿维菌素(Avermectin)产生菌阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis)76-9的aveD基因缺失突变株489中。[结果]经过同源重组,获得aveD基因定点缺失突变株536。测序结果表明突变株536,aveD基因编码区中第69位碱基C突变为T,相应的氨基酸序列第23位由Thr突变为Ile。[结论]该研究为研制生产阿维菌素B的基因工程菌奠定了基础。     

定点突变麻鸡副黏病毒ZH-1株F基因及其鉴定

根据麻鸡副黏病毒ZH-1株F基因序列,采用PCR体外定点突变技术,设计2对引物(引物中含有突变位点)。应用重叠PCR延伸法,分3次PCR扩增F基因,从而得到突变后的F基因,命名为F变基因,将其克隆进入pGEM-T载体,并进行PCR、酶切测序鉴定,使突变后的F变基因编码的氨基酸裂解位点为112 Gly-Arg-Gln-Gly-Arg-Leu117,具有弱毒株的特点。     

努比亚山羊BMPR-IB基因多态性与其产羔性状的关联分析

[目的]明确努比亚山羊骨形态发生蛋白受体-IB(BMPR-IB)基因多态性与其产羔性状的关联,为山羊育种寻找新的遗传分子标记.[方法]采用DNA池结合PCR产物直接测序技术检测努比亚山羊BMPR-IB基因全部编码区的变异情况,以时间飞行质谱列阵技术对候选SNP位点进行基因分型,并分析BMPR-IB基因多态性与产羔性状(产羔数、初生重和断奶重)的关联性.[结果]努比亚山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位存在A→G碱基突变,内含子1第1664位和内含子9第11344位处存在G→A碱基突变.3个SNP位点(5'UTR 469th、Intron11664th和Intron911344th)存在3种基因型(GG型、GA型和AA型),对应的多态信息含量(PIC)分别为0.37、0.11和0.37,其中Intron11664th位点的基因频率和基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡状态(P?0.05),5'UTR 469th和Intron911344th位点则处于Hardy-Weinberg不平衡状态(P<0.05).关联分析结果表明,努比亚山羊BMPR-IB基因5'UTR第469位碱基由A→G,其GG型母羊比AA型母羊的产羔数和子代平均初生重有所减少,但子代平均断奶重增加;内含子1第1664位碱基由G→A,其GA型母羊比GG型母羊的产羔数和子代平均初生重均有所增加,但子代平均断奶重减轻;内含子9第11344位碱基由G→A,其AA型母羊比GG型母羊产羔数少,但子代平均初生重和平均断奶重均增加.可见,努比亚山羊BMPR-IB基因的3个SNP位点对其产羔性状均无显著影响(P>0.05).[结论]努比亚山羊BMPR-IB基因存在3个SNP位点(5'UTR 469th、Intron11664th和Intron911344th),但对努比亚山羊产羔性状影响不显著,说明BMPR-IB基因对山羊的产羔性状具有一定种属特异性.     

纯血马和百色马IGF1R基因蛋白编码区序列的多态性分析

[目的]研究纯血马和百色马IGF1R基因成熟蛋白编码区序列的多态性,为揭示马矮小性状的分子机理和马的分子育种提供理论参考。[方法]采集纯血马和百色马的血样各57份,按常规酚仿法抽提DNA。利用DNA混合池和PCR产物直接测序的方法检测IGF1R基因的多态位点,利用PCR-RFLP技术分析这些多态位点在纯血马和百色马中的基因型及其频率分布。[结果]在马IGF1R基因的第2、第5和第16外显子上存在4个多态位点,其中突变179627 T→C为纯血马和百色马共有,且两者在基因型频率上差异不显著;突变212077 G→A为纯血马所独有;突变406 T→C和212 110 G→A为百色马所独有。[结论]马IGF1R基因的多态位点可能与百色马的矮小和纯血马的高大有关。     

利用重叠延伸PCR定点突变衰退病P23基因

分析已知柑桔衰退病强毒系基因组并克隆CTV中一个重要的基因P23.利用重叠延伸PcR法的原理,成功的将P23基因保守序列第206位碱基由C突变成T,由此该位点成为限制性酶(SacI)的识别位点.把改良后的P23基因插入到T载体中,测序发现成功地突变掉目的位点.为进一步利用分子生物学手段研究CTV病毒,克隆突变CTV序列奠定了基础.     

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGF-I基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点.应用RFLP、CRS-RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布.结果表明:(1)IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1 317 bp、712 bp和1 941 bp;(2)在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G-A突变;内含子3的第40个碱基为一个 "A" 的插入-缺失突变,第307位为C-T突变,683位是G-A突变;内含子4上的696碱基处有一个20 bp的插入-缺失突变,在1 563位为G-A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;(3)内含子1上SNP G1070A的A等位基因能为Hind III限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型.根据内含子1上SNP G208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成Taq I酶切位点,建立CRS-RFLP检测方法.内含子4上SNP G1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型.试验结果显示,RFLP、CRS-RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;(4)在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNP G1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低.     

大口黑鲈IGF-I基因内含子1、3和4序列多态性研究

根据大口黑鲈IGF-I基因的cDNA序列设计引物,克隆IGFI基因内含子核苷酸序列,采用PCR产物直接测序方法,在中国养殖群体和美国野生群体中筛选IGF-I基因内含子上的多态位点。应用RFLP、CRS—RFLP和SSCP技术建立多态位点的检测方法,同时比较分析其中4个多态位点在两个群体中基因频率分布。结果表明：（1）IGF-I基因内含子1、3和4序列长分别为1317bp、712bp和1941bp;（2）在3个内含子上共发现7个多态位点,其中在内含子1的208和1070位为G—A突变;内含子3的第40个碱基为一个“A”的插入-缺失突变,第307位为C—T突变,683位是G—A突变;内含子4上的696碱基处有一个20bp的插入-缺失突变,在1563位为G—A突变,表明大口黑鲈IGF-I基因序列上存在较多的SNPs;（3）内含子1上SNPG1070A的A等位基因能为HindIII限制性内切酶识别,采用RFLP技术分型。根据内含子1上SNPG208A侧翼序列,设计错配引物,使错配碱基和A等位基因共同形成TaqI酶切位点,建立CRS—RFLP检测方法。内含子4上SNPG1563A采用SSCP检测方法,同时对内含子4上的插入-缺失突变进行PAGE电泳分型。试验结果显示,RFLP、CRS—RFLP和SSCP三种SNP检测方法简单易行,适于在水产动物SNP标记研究中推广应用;（4）在中国养殖群体中,只有内含子1上的SNPG1070A具有多态性,其它3个多态位点只在美国野生群体中存在多态,证实中国养殖群体的遗传多样性相对较低。     

马MxA基因第13外显子的多态性研究

[目的]研究4个品种马MxA基因第13外显子的多态性。[方法]根据GenBank中已公布的MxA基因序列设计引物,利用PCR技术从三河马、锡尼河马、乌审马和巴尔虎马血液基因组DNA中扩增MxA第13外显子基因片段,利用PCR-SSCP方法检测该基因片段多态性并进行测序。[结果]只有乌审马MxA基因第13外显子存在多态性,第2 018位点发生了突变,鸟嘌呤（G）→腺嘌呤（A）,由此导致氨基酸发生改变,由谷氨酸（G lu）→丙氨酸（A la）。[结论]该研究为探讨马MxA蛋白基因抗病毒作用奠定了基础。     

pGEX-4T-1-cMC4R原核表达载体的构建与表达

[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。     

利用pHDE-Cas9构建巨桉CTX基因家族CRISPR载体

[目的]利用高效基因编辑系统(pHDE-Cas9)构建巨桉细胞分裂素氧化酶/脱氢酶(CTX)基因家族规律成簇的间隔短回文重复(CRISPR)载体,为开展巨桉CTX基因家族功能验证研究打下基础.[方法]设计巨桉CTX基因靶位点和引物,扩增pCBC质粒上的目的片段,BsaⅠ酶切pHDE载体并与目的片段连接形成重组质粒,转化DH5α感受态细胞.提取单克隆进行菌液PCR初步验证、重组质粒PCR验证,挑选阳性克隆质粒进行测序分析,构建CTX基因家族CRISPR载体.[结果]重组质粒PCR鉴定及测序结果表明,重组载体序列无突变,与预期序列高度一致.成功构建了巨桉CTX基因家族pHDE-CTXA、pHDE-CTXB和pHDE-CTXC同源表达载体.[结论]利用pHDE-Cas9成功构建了巨桉CTX基因家族CRISPR载体,构建过程快速、高效,为桉树基因组定点编辑打下了基础,也可为其他桉树CRISPR/Cas9表达载体的构建提供借鉴.     

草鱼羧肽酶A4基因部分序列多态性及生长性状关联分析

[目的]筛选出更多与草鱼生长相关的SNP位点标记,为草鱼分子育种研究提供理论依据.[方法]根据草鱼EST数据库中属于消化酶的羧肽酶A4基因的cDNA序列设计引物,采用PCR产物直接测序法,对含预计SNP位点的cDNA序列进行扩增、测序,并寻找新的SNP位点.[结果]cDNA上预计的SNP位点不存在,但在内含子3上检测到两个SNP位点,分别位于内含子的第40、241个碱基处,命名为A40G位点和G241T位点.经创造酶切位点的限制性片段长度多态检测(CRS-RFLP),发现A40G位点AA型占50.3%、AG型占23.8%、GG型占25.9%,G241T位点的GG型占48.6%、GT型占47.9%、TT型占3.5%.利用一般线性模型(GLM)将两个SNP位点与草鱼6个生长性状进行关联分析,结果表明,A40G位点的GG型个体在体重、体长、体高均高于AA型和AG型,但差异不显著(P>0.05);G241T位点TT型个体最重,GG型最轻,但差异不显著( P>0.05);A40G和G241T两个位点组成的7种双倍型个体的体重、体长、体高、尾柄高等重要生长性状差异也不显著(P>0.05).[结论]在草鱼羧肽酶A4基因的内含子3上发现两个SNP位点(A40G位点和G241T位点),每个SNP位点都可分为3种基因型,但两个SNP位点的不同基因型以及由其组成的双倍型与草鱼的重要生长指标均不存在显著相关.     

PPVSC-1株VP2基因的定点突变及真核表达载体的构建

以PPV VP2为基础,利用重叠延伸PCR技术分别将VP2蛋白中第402位(A)和214位(B)的半胱氨酸突变为精氨酸,并将突变体克隆入pMD19-T Simple载体中;经酶切、PCR和测序鉴定后,利用KpnⅠ和BamHⅠ酶切位点,定向克隆入真核表达载体pPI-2.EGFP中,构建突变体与报告基因EGFP融合表达的pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)真核表达载体;利用脂质体法将重组质粒分别转染COS-7细胞。结果:成功构建了突变体的真核表达载体;在转染后的荧光观察中发现,pPI-2.EGFP.VP2(A)和pPI-2.EGFP.VP2(B)质粒转染细胞后,两者表达后的荧光信号不同,A样品的荧光呈颗粒状分布于细胞中,而B样品的荧光信号均匀分布于细胞中。提示,突变是引起表达差异的主要原因。     

桫椤atpB-rbcL序列2种测序方法的比较分析

［目的］比较2种方法进行桫椤atpB-rbcL序列测定的测序效果。［方法］通过PCR产物直接测序和克隆测序对桫椤叶绿体atpB-rbcL基因间隔序列进行测定与分析。［结果］结果表明,桫椤atpB-rbcL序列直接测序所得峰形紊乱,PolyT后出现多重峰;克隆测序结果峰形清晰,无干扰。［结论］对于桫椤atpB-rbcL序列测定,克隆测序优于直接测序。