刺五加ATP合酶β亚基基因的克隆与序列分析

[目的]克隆刺五加叶绿体的ATP合酶β亚基cDNA并对其进行生物信息学分析。[方法]根据已知物种叶绿体ATP合酶β亚基基因的序列,设计1对同源引物,通过RT-PCR扩增得到刺五加ATP合酶β亚基cDNA,并对其进行序列比对及结构预测分析。[结果]RT-PCR扩增获得了长1099bp的刺五加ATP合酶β亚基cDNA,该基因编码366个氨基酸。序列比对及结构预测分析表明,刺五加ATP合酶β亚基基因编码的氨基酸与水稻的同源性最高,达96.41%。其二级结构中含有171个α螺旋（alpha helix）,占46.72%;53个延伸链（extended strand）,占14.48%;27个β折叠（beta turn）,占7.38%;115个无规则蜷曲（random coil）,占31.42%。第262～271位氨基酸为ATP合酶β亚基的标志性位点。整个多肽链无明显的疏水区域,初步认定为亲水性蛋白。[结论]该试验克隆得到的ATP合酶β亚基基因为叶绿体ATP合酶β亚基基因,为研究刺五加能量代谢对植物次生代谢的影响及了解植物ATP合酶的结构与功能提供了必要的信息。     

蝴蝶兰液泡型ATP酶E亚基基因的克隆及序列分析

E亚基是液泡型ATP酶(V-ATPase)多亚基复合体的重要组成部分,响应植物的非生物胁迫,对其基因的克隆及分析有助于阐释其逆境条件下的分子调节机制。根据蝴蝶兰低温诱导差异蛋白的序列设计简并引物,利用RT-PCR和RACE技术从蝴蝶兰叶片中克隆获得2条V-ATPase E亚基的c DNA序列,分别命名为Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb,Gen Bank登录号分别为KT758849和KT758850。Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb全长分别为960 bp和1 036 bp,二者均具有687 bp的开放阅读框,编码228个氨基酸,包含相同的v ATP-synt_E保守域;生物信息学分析表明,2个序列编码蛋白具有相似的二级结构和相同的亲水性,预测的三级结构也相同。系统进化树分析显示,蝴蝶兰Ph VHA-Ea和Ph VHA-Eb与单子叶植物液泡型ATP酶E亚基距离最近。     

小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA的克隆与序列分析

目的：构建小鼠蛋白激酶CK2β亚基cDNA重组表达质粒，以便深入进行CK2结构与功能的研究。方法：通过反转录PCR从NIH3T3小鼠成纤维细胞中获得小鼠蛋白激酶CK2β亚基编码区cDNA，PCR扩增酶为高保真DNA聚合酶。将NdeⅠ/HindⅢ彻底双酶切PCR产物定向连接到牛小肠碱性磷酸酶去5′端磷酸的同样彻底NdeⅠ/HindⅢ双酶切的表达载体pT7—7中，转化感受态大肠杆菌DH5α获得转化子，用0．8％琼脂糖凝胶电泳初步筛选转化予，将阳性克隆进行单和双酶切分析鉴定。随机挑选两个阳性克隆进行DNA测序。结果：转化子的阳性筛选率为100％，限制性酶切分析结果表明插入片段和重组质拉的大小与理论推测值相符。DNA测序结果表明：两个重组小鼠CK2β亚基克隆中的插入片段序列均与两种已报道的小鼠CK2β亚基cDNA编码区序列分别存在一个碱基差异，但我们报道的这2个差异碱基与大鼠、兔、猪和人CK2β亚基cDNA的编码区相应碱基序列一致。结论：本实验克隆的小鼠蛋白温酶CK2β亚基cDNA编码区序列可能是正确的序列。     

福建黄兔促卵泡素β亚基(FSHβ) cDNA序列的克隆与序列分析

从性成熟的福建黄兔母兔脑垂体中提取总RNA,经RT-PCR扩增目的片段,获得长为390bp的黄兔促卵泡素β亚基cDNA片段。将扩增的片段与pMD18-T载体连接,转化至DH5α感受态细胞中。随机挑选阳性重组子进行鉴定、测序,将测序结果与包括人、奶牛、绵羊、水牛、小鼠在内的多种哺乳动物基因序列进行同源性分析,同源性相似度72.2%~96.5%,同时遗传进化分析结果表明,兔形目的FSHβ基因与灵长目动物的亲缘性更高。对福建黄兔与日本白兔已提交的FSHβ亚基的cDNA序列进行比较,发现在81bp及219bp处存在C→T和G→A两处突变,但未引起氨基酸变化。     

固原鸡线粒体基因组ATPase 8基因的克隆及序列分析

[目的]扩增固原鸡（白羽、麻羽、红羽）、肉鸡品种AA鸡及蛋用品种罗曼鸡线粒体ATPase 8（ATP酶第8亚基）基因。[方法]从鸡血液中提取基因组DNA。然后,利用已经公布的鉴别检测鸡的源性成分的特异性引物,PCR扩增线粒体ATPase 8基因并测序。[结果]固原鸡不同品系和AA鸡的ATPase 8基因全序列为165 bp,罗曼鸡为168 bp。[结论]不同品系固原鸡的ATPase 8基因序列与罗曼鸡和AA肉鸡均有较高的同源性,但是与鹌鹑、鹧鸪、鸵鸟、鹅、火鸡的同源性相对较差。     

青蒿鲨烯合酶cDNA的克隆与序列分析

[目的]对青蒿鲨烯合酶进行cDNA克隆,并进行序列分析。[方法]根据GenBank上已发表的鲨烯合酶cDNA基因序列设计1对特异性引物,提取青蒿细胞总RNA,运用RT-PCR扩增出鲨烯合酶基因。将其与pMD19-T载体连接,并对克隆片段序列进行分析。[结果]SS基因全长1257bp,编码418个氨基酸;同源性分析表明,青蒿SS基因序列与人参、积雪草、金铁锁、大豆、辣椒、百脉根、远志、玉米、褐家鼠、小鼠以及人相应序列的同源性分别为77.21%、76.11%、75.66%、74.62%、73.83%、74.46%、73.03%、64.39%、52.22%、50.51%和50.12%;氨基酸同源性分别为79.43%、79.00%、75.84%、79.43%、77.27%、77.27%、77.03%、66.03%、40.65%、40.19%和40.09%。[结论]青蒿鲨烯合酶cDNA的成功克隆,为进一步研究SS基因结构、基因表达与调控提供了重要依据。     

沼泽型水牛促卵泡素基因β亚基的克隆与序列分析

根据GenBank公布的奶牛FSHβ亚基的编码序列设计1对特异性引物,成功克隆出广西沼泽型水牛FSHβ亚基cDNA,并将其序列提交到GenBank,获得接受号为EF710660。以DNA Star生物分析软件对其同源性进行分析,结果表明,广西沼泽型水牛与已公布的印度水牛（Bubalus bubalis）的FSHβ亚基cDNA序列的同源性最高,达99%,与绵羊（Ovis aries）为96%、牛（Bovine）为95%、山羊（Capra hircus）为95%、梅花鹿（Cervus nippon）为95%。     

杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因的克隆与表达分析

为探索杉木木材发育的分子机制,以杉木幼苗嫩叶总RNA为模板,利用反转录获得的cDNA进行聚合酶链式反应(PCR),获得杉木纤维素合酶(ClCesA2)基因。对该基因进行测序以及序列分析表明,该基因开放阅读框全长3 276 bp,共编码1 091个氨基酸,具有锌指结构和8个跨膜区域,及保守的DX……QVLRW结构域。荧光定量PCR结果表明,该基因在杉木的根、茎、叶中相对表达量有明显差异,茎的相对表达量最高,根次之,叶最低。系统进化树分析表明该基因与初生壁合成相关基因聚在一起,推测该基因可能参与杉木细胞初生壁的形成。     

异育银鲫促甲状腺激素β亚基基因的克隆及序列分析

利用RT-PCR、RACE及克隆等方法获得了异育银鲫促甲状腺激素β亚基(TSHβ)基因全长cDNA序列。该cDNA全长926 bp,5’端非编码区68 bp;3’端非编码区372 bp;开放阅读框(ORF)486 bp,编码161个氨基酸。经序列分析显示,其编码的氨基酸序列与金鱼[Carassius auratus(goldfish)]、鲤(Cyprinus carpio)、鳙(Aristichthysnobilis)、斑马鱼(Danio rerio)、虹鳟(Salmo gaidnerii)、鲑(Salmo salar)、鳗鲡(Anguilla anguilla)具有较高的相似性,其相似性分别为91.3%、87.6%、83.2%、77%、58.6%、56.1%、43.55%,同源性较高,这说明TSHβ亚基在长期的进化中具有较高保守性。而且在比较中还发现:异育银鲫和其它7种鱼类相比在5’端多11个氨基酸序列,并且都含有定位保守的12个半胱氨酸残基和一个N糖基化位点。     

鸭梨过氧化物酶基因全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和RACE方法,从鸭梨(Pyrus bretschneideri Rehd)果实中获得过氧化物酶(Peroxidase)基因POD的cDNA全长,命名为PbPOD,并将该基因在GenBank上登录,登录号为JQ325052。基因序列分析表明,该基因的cDNA全长为1 487 bp,包含72 bp的5'非翻译区、404 bp的3'非翻译区和长度为1 011 bp且编码336个氨基酸的编码区(CDS)。氨基酸序列分析表明,该基因编码的蛋白具有POD家族保守存在的所有功能活性位点,且与甜瓜、拟南芥、烟草等植物POD相似性达92%以上。     

刺五加GAPDH 基因全长cDNA 的克隆与生物信息学分析

采用cDNA末端RACE技术,从刺五加叶片中克隆到GAPDH基因cDNA的全长序列,并运用生物信息学方法对该基因的cDNA序列、保守区、氨基酸序列、亲缘关系等特征进行分析,并预测其编码蛋白质的结构和功能.研究结果表明,刺五加GA PGH基因的cDNA全长为1 437 bp,开放阅读框全长为1 023 bp,编码一个具有340个氨基酸残基的蛋白,蛋白分子质量为37.070 ku,理论等电点(pI)为7.71.刺五加GAPDH蛋白不存在跨膜结构域,定位于细胞质中,属于亲水蛋白.     

刺五加Cu/Zn SOD的克隆及内生真菌对其表达的影响

利用RACE技术从刺五加(Eleutherococcus senticosus Harms)中克隆到铜锌型超氧化物歧化酶基因(Cu/Zn SOD)的cDNA序列.获得的刺五加Cu/Zn SOD的cDNA长641 bp.基因内部含有1个长度为459 bp的开放阅读框,编码长度为152个氨基酸残基的蛋白质,预测分子质量为15.162 ku,理论等电点为5.29.刺五加Cu/Zn SOD氨基酸序列与其它植物的Cu/Zn SOD具有很高的相似性.相对定量RT-PCR的结果表明,回接内生真菌菌株P116-1a、P116-1b、P109-4和P312-1后可显著提高刺五加Cu/Zn SOD基因的表达量(P＜0.05),最大表达量出现在菌株P312-1回接60d时,达对照的4.99倍.     

刺五加的同工酶与遗传分化的研究(Ⅰ)--花丝长度不同的刺五加植株同工酶电泳分析

采用聚丙烯酰胺凝胶电泳对花丝长度不同的刺五加植株进行了6种同工酶比较分析.结果显示,花丝长度不同的刺五加在酸性磷酸酶(ACP)、苹果酸脱氢酶(MDH)、乙醇脱氢酶(ADH)、异柠檬酸脱氢酶(IDH)、细胞色素氧化酶(CCO)和过氧化物酶(POD)等6种同工酶酶谱上表现出不同程度的差异,由此对花丝长度不同的刺五加的遗传分化做出推测.     

刺五加多向耐药性转运蛋白基因的克隆及其表达对皂苷含量的影响

利用简并引物进行聚合酶链式反应(PCR)扩增获得长度为693 bp的刺五加(Eleutherococcus senticosus)多向耐药性(pleiotropic drug resistance,PDR)转运蛋白基因,GenBank登录号为KC473536,其编码的231个氨基酸的蛋白属于PDR转运蛋白的核苷酸结合结构域。氨基酸序列与毛果杨(Populus trichocarpa)、蓖麻(Ricinus communis)和水稻(Oryza sativa)的PDR氨基酸序列一致性分别为8874%,9004%和8831%。RT PCR法检测PDR在刺五加不同生长发育时期和不同器官中表达情况和分光光度法测定刺五加总皂苷含量的结果显示: 刺五加PDR基因在整个生长期中均有表达,与皂苷在整个生长期中均有合成的特点相符,但两者的相关性未达显著水平。PDR基因在叶片和叶柄中高表达的特点与刺五加皂苷仅存在于叶中的特点相符,两者间存在显著的正相关关系(P<005)。     

烟草多酚氧化酶基因的克隆与序列分析

多酚氧化酶(PPO)在高等植物中广泛存在,其利用分子氧催化氧化酚类物质为醌,对植物的抗虫和抗病起着一定的作用,同时它介导的酶促反应也是烤制中烟草褐变的主要原因。本文采用RT-PCR,成功地从野生烟草(Nicotiana tabacum)叶片中克隆出了PPO c DNA序列。序列分析表明,烟草PPO基因ORF长为1773 bp,编码590个氨基酸,基因登陆号为KC540916,烟草与其他物种PPO的核苷酸序列与氨基酸序列同源性达80%以上,并包含两个高度保守的铜离子结合区域。烟草PPO基因的克隆为烟草的抗性研究和褐化反应的控制研究提供了良好的理论基础。     

“冷俊”槭查尔酮异构酶基因(CHI)片段克隆及序列分析

以槭树品种"冷俊"为试材,利用RT-PCR技术,根据GenBank中登录的相关物种查尔酮异构酶基因(CHI)的保守序列设计简并引物,提取其秋季变色期叶片中的总RNA并扩增出CHI基因的cDNA片段。测序结果表明,该片段长553 bp,编码183个氨基酸。序列分析表明,该片段与龙眼、橄榄、山茶、沙梨等的同源性在81%～90%以上,证明已成功克隆到槭树变色期叶片CHI基因的cDNA片段,在GenBank中登录号为KC121346。     

刺五加内生真菌分离及分布研究

采用平板粘插法分离刺五加内生真菌,并对内生真菌的形态进行鉴定,比较不同产地刺五加内生真菌的分布情况。结果表明,从5地区刺五加体内共分离出75株内生真菌（分属于12个属及未产孢类群）。     

地衣芽孢杆菌BL03脂肪酶基因LIP的克隆及序列分析

[目的]克隆地衣芽孢杆菌BL03的脂肪酶基因LIP并对其序列进行分析。[方法]以地衣芽孢杆菌BL03基因组核酸为模板,PCR扩增得到地衣芽孢杆菌脂肪酶基因,用pMD19-T载体克隆后进行PCR鉴定及序列测定和生物信息学分析。[结果]测序结果表明该片段完整开放阅读框大小为615 bp,与已发表的地衣芽孢杆菌LTP基因(GeneID:3098655)相比,核酸序列相似为99.67%;推导编码氨基酸序列相似性为99.02%。[结论]该基因的获得为其异源表达及相关研究奠定了基础。