猪细小病毒病毒样颗粒研究进展

猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍和仔猪死亡的主要病原,疫苗免疫预防是控制该病的主要手段。由于对生物安全的担心,目前国内使用的疫苗仍以灭活苗为主。病毒样颗粒(VLPs)疫苗以其安全性高、免疫原性好成为各类病毒疫苗研究的热门方向。猪细小病毒病毒样颗粒(PPV-VLPs)是不含PPV DNA的空衣壳结构,由PPV VP2结构蛋白体外自行组装形成,形态上与天然病毒粒子相似,具有很强的免疫原性和生物学活性。论文就VLPs疫苗的免疫机制及PPV-VLPs的组装及其在国内外的研究进行综述,为PPV-VLPs研究提供参考。     

猪细小病毒研究进展

猪细小病毒 (PPV)是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一。 PPV最早是从培养细胞中发现并分离得到的一种小 DNA病毒。PPV按照其致病性与组织嗜性大致可以分为 4个类型。研究表明 ,PPV不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一 ,而且能够引起多种猪病。PPV基因组为单股负链 DNA,大小约为 50 0 0 bp,基因组有两个主要的开放阅读框架 ,基因组共编码 3种结构蛋白和两种非结构蛋白 ,即 VP1、VP2、VP3和 NS1、NS2。VP2蛋白是主要的免疫原性蛋白 ,可以诱导机体产生强烈的免疫反应 ,NS1蛋白是 PPV基因组本身编码的反式激活蛋白 ,对PPV早期和晚期的转录发挥着重要作用 ,另外有研究表明 ,NS1蛋白是具有多种功能的锚定蛋白 ,在 PPV体外感染过程中具有重要功能。随着对猪细小病毒研究的不断深入 ,目前已经在猪细小病毒病原学、诊断与防制以及分子生物学方面取得了进展。     

猪细小病毒结构蛋白VP2研究进展

猪细小病毒(PPV)是引起猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一,目前该病在世界很多国家均有流行和报道,给养猪业带来巨大损失。传统的灭活苗和弱毒苗又都存在各自的缺陷,新型诊断试剂及疫苗的研究迫在眉睫。VP2蛋白是病毒粒子的主要衣壳蛋白,具有在体外能自我装配成类病毒粒子,并能刺激机体产生抗PPV中和抗体,可作为抗原转运载体等特性,故VP2蛋白在猪细小病毒诊断试剂及新型疫苗研究领域具有很大的潜力。论文就VP2的分子生物学及其在该病诊断与预防等方面的研究进展进行了综述。     

猪细小病毒PPV—SD1株VP2全基因原核表达及间接ELISA检测方法的建立

猪细小病毒(PPV)是引起母猪繁殖障碍的重要病原之一,初产母猪感染PPV后,可引起流产、不孕、产死胎、木乃伊胎等,而母猪本身并不表现临床症状,其他猪感染后也无明显的临床症状,给养猪业造成巨大的经济损失[1].血清学试验证实,VP2蛋白可以诱导产生血凝抑制及中和抗体.本实验室对猪细小病毒PPV-SD1分离株的VP2基因进行了原核表达,利用纯化的蛋白建立了间接ELISA抗体检测方法,为PPV流行病学调查提供了物质基础.     

表达猪细小病毒VP2基因的重组伪狂犬病病毒构建及其免疫原性

猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)和伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)均可引起母猪的繁殖障碍疾病。本试验以PRV基因工程弱毒株rPRVSMX为载体,构建了表达PPV流行毒株VP2基因的重组PRV(rPRVSMX-VP2)。Western blot和IFA试验均证明了重组病毒在细胞中成功表达了VP2蛋白。动物试验结果证明重组病毒可以诱导猪体产生特异性的PPV抗体,首免后40 d血凝抑制抗体(HI)为1∶192±73.9,虽然低于PPV商品化灭活疫苗免疫后所产生的HI抗体,但此时免疫系统被认为是激活的水平;重组病毒诱导产生的PRV抗体与载体毒株rPRVSMX诱导产生的抗体相当。由此可见该重组毒株经过优化后,可以作为二联疫苗的候选毒株防控猪伪狂犬病和细小病毒病。     

猪细小病毒分子诊断技术与基因工程疫苗研究进展

猪细小病毒(PPV)最早是从培养细胞中发现并分离得到的一种小DNA病毒。研究表明,PPV不仅是引起母猪繁殖障碍的主要病原体之一,而且能够引起多种猪病。随着对猪细小病毒研究的不断深入,目前已经在病毒病原学、结构与非结构蛋白、感染机制、诊断与疫苗防制等方面取得很大进展。本文主要针对分子诊断新技术与基因工程疫苗防制等方面进行了阐述。     

国内猪细小病毒疫苗及免疫程序

猪细小病毒(PPV)可以引起猪的繁殖障碍性疾病,控制该疾病最为行之有效的方法就是疫苗免疫。本文概述了猪细小病毒的基本概况,并对国内市场上生产的PPV疫苗、种类及免疫程序进行了综述。     

猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪细小病毒抗体检测方法,参照猪细小病毒(PPV)VP2蛋白的基因序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增了VP2蛋白主要抗原区域,将目的片段克隆至p ET30a原核表达载体中,获得了以可溶形式表达的重组VP2蛋白,重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测显示具有良好的抗原性;以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)方法的符合率为94.49%;应用该方法检测869份疫苗免疫猪血清样品,免疫合格率为87.92%;检测248份未免疫疫苗猪血清样品,阳性感染率为7.25%。     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

重组外源基因的猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒的构建与鉴定

将猪圆环病毒2型（PCV2）Cap蛋白第165-200位氨基酸多肽基因嵌合在猪细小病毒（PPV）VP2 N端,然后重组到腺病毒pAdEasy-1表达系统中,转染HEK-293A细胞,获得重组腺病毒（rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap）。IFA和Western blotting分析分别可见特异性荧光和大小约为64 ku的特异性带,表明rAd-PPV∶VP2-PCV2∶Cap在HEK-293细胞中成功地表达了PPV∶VP2和PCV2∶Cap蛋白。红细胞凝集试验证实,表达的嵌合PPV∶VP2-PCV2∶Cap蛋白具有与PPV全病毒类似的血凝活性。电镜观察嵌合PPV∶VP2-PCV∶Cap蛋白的粗提物,发现可自行装配成许多病毒样粒子[PPV∶VLP（PCV2）]。     

猪细小病毒病的诊治

作者对某猪场的病死猪进行临床症状观察、病理剖检及实验室诊断,通过病毒的分离培养及鉴定,确诊病死猪为猪细小病毒感染。鉴于养殖场中该病的存在及对养猪业的危害,建议加强对猪细小病毒的诊断及监控。     

猪细小病毒的分离与鉴定

本试验从福建省某猪场疑似猪细小病毒病死胎的淋巴结、肝脏中分离到1 株病毒。病料接种PK-15细胞36 h后出现了圆缩、集聚、脱落等细胞病变,猪细小病毒阳性血清能特异性地中和该分离病毒。根据已发表的细小病毒(PPV) VP2基因的序列设计并合成了一对引物,采用PCR方法可扩增531 bp DNA片段。测序结果表明,分离株VP2基因与NCBI公布的NADL-2株的同源性高达99.2％,证实分离的病毒株为猪细小病毒。为进一步开展该病毒致病机理、流行病学、诊断研究与疫苗免疫等奠定了基础。     

猪细小病毒BQ-C毒株VP2基因的鉴定及表达

本研究从临床发病猪采集病料,以PK15传代细胞进行病毒分离,通过PCR、血液凝集试验(HA)和电镜鉴定为1株猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV),命名为BQ-C。对分离的毒株进行测序,结果显示该毒株与GenBank登录的PPV BQ株同源性为100%。为获得该毒株结构蛋白VP2基因的表达产物,将VP2基因片段插入到原核表达载体pET-30a(+),得到表达重组质粒。经双酶切和测序鉴定,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。SDS-PAGE结果表明,获得的重组蛋白分子质量约为71.5 ku,与预期大小相符。Western blotting结果显示获得的重组蛋白能与PPV阳性血清特异性结合,表明重组蛋白具有良好的反应原性。结果表明,本研究成功分离了1株PPV BQ-C株,且表达的VP2重组蛋白可用于PPV血清学诊断和疫苗的研发。     

Detection of Porcine Circovirus Type 2, Porcine Parvovirus and Porcine Pseudorabies Virus from Pigs with Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome by Multiplex PCR

Multiplex PCR was established to detect porcine circovirus type 2 (PCV-2), porcine parvovirus (PPV) and porcine pseudorabies virus (PRV) and applied to samples from 137 piglets exhibiting clinical signs of postweaning multisystemic wasting syndrome (PMWS). PCV-2 DNA was detected from all samples. Moreover, 43 samples were positive for PPV but negative for PRV; 11 samples were positive for PRV but negative for PPV; and 35 samples were positive both for PPV and PRV. These results suggests that PCV-2 co-infection with PRV and PPV may play an important role in PMWS. Also, multiplex PCR is an appropriate candidate method for diagnosis of PCV-2, PRV and PPV simultaneously in field cases.     

猪细小病毒在兔体内的垂直传播

以猪细小病毒（ＰＰＶ）细胞复壮毒接种于妊娠后１１～１３ｄ的初妊母兔,接毒的初妊母兔均于妊娠后３０～３２ｄ分娩。分娩后立即扑杀接毒母兔及其死产仔兔、对照母兔及其仔兔,分别无菌采集其肝脏和肾脏,按常规方法处理后以银加强胶体金技术进行检测,结果试验兔样本均为阳性,而对照兔样本均为阴性,这表明ＰＰＶ也可在兔体内垂直传播,并引起繁殖障碍。初妊母兔可替代妊娠母猪作为ＰＰＶ人工感染试验的动物模型。     

Vaccination Against Porcine Parvovirus Infection

Of 13 gilts 7 were vaccinated twice at an interval of 3 weeks with an inactivated vaccine against porcine parvovirus (PPV) infection, while the 6 nonvaccinated gilts served as controls. Starting after the 1st vaccination the gilts were bred and, after about 40 days of gestation, challenged intravenously with virulent PPV. The vaccinated gilts produced an antibody respons after the 1st and 2nd vaccination compatible with a primary and a secondary immune response, respectively. The nonvaccinated gilts remained low-titered or PPV antibody negative until after challenge. The gilts were killed after about 90 days of gestation, and their litters were examined. All of 53 fetuses from the vaccinated gilts were alive, and infection with PPV could not be demonstrated. Conversely, 50 of 65 fetuses from the non-vaccinated gilts were infected with PPV, and 43 were dead.In a field study comprising 2 herds, PPV seronegative or lowtitered gilts were vaccinated before mating. There were no obvious signs of reproductive disorders in the 2 herds during the vaccination trials, and the reproductive performance of vaccinated gilts did not differ significantly from that of non-vaccinated gilts.     

散养户猪群细小病毒感染的血清学调查

为了解大理地区猪细小病毒(PPV)感染的情况,从大理地区58个散养户采集了243份猪血清,采用间接ELISA方法对血清样本进行细小病毒抗体检测。结果显示,243份猪血清中抗PPV抗体阳性率为85.60%,表明大理地区散养户猪群细小病毒病已经普遍流行,结果值得关注。     

猪细小病毒VP2的原核表达与多克隆抗体制备

克隆猪细小病毒(PPV)VP2基因全长1 740bp,构建其原核表达载体后进行蛋白的表达与纯化,接种家兔制备多克隆抗体。用PCR方法扩增PPV VP2全长基因,扩增产物克隆至表达载体pET-32a并转化至E.coli BL21(DE3)感受态中。分别用不同诱导时间、IPTG浓度、温度诱导表达VP2重组蛋白,经SDS-PAGE电泳切胶回收纯化目的蛋白。对家兔进行3次免疫后,采集血清制备抗体。PCR扩增得到1 740bp的VP2基因片段;构建原核表达载体pET-32a-VP2,经37℃,IPTG浓度1.0mmol/L诱导表达4h可得分子质量大小约为82ku目的蛋白;间接ELISA检测抗体效价可达1∶12 800;Western blot证明所制备的抗体能够有效的应用于PPV VP2抗原的检测。本研究成功构建了表达PPV VP2基因的原核载体,获得了VP2蛋白,制备了兔抗多克隆抗体,为建立检测PPV VP2蛋白ELISA方法奠定了基础。     

PPV培养细胞的选择及在ST细胞中的增值规律

猪细小病毒毒株在不同细胞系上的生长情况不尽相同,如不能掌握其规律,将难以生产出优质的疫苗.本研究对PPV（M2株）在PK15和ST细胞上生长情况进行了研究,得出ST细胞更适合其生长。之后将PPVM2毒株同步接种于ST细胞,用测定HA和TCID50的方法研究了其在ST细胞上增殖的基本规律。病毒在接种后24h可在细胞较稀的区域看到非常轻微的病变,病毒TCID50测定结果也表明,接毒后17h,病毒已经明显增殖。当病毒培养到约40h,其TCID50即接近高峰,并进入平台期,病毒的TCID50已达到10^7.5／0．hmL以上。继续培养,最高可达到10^8.5／0．1mL以上,且直到122h,也不见明显降低。病毒培养40-122h,不管是用Gibco血清还是用Hyclone血清培养病毒,其差异都非常小,变异系数都在5％以内。病毒HA价也出现同样的平台期,但HA价的平台期出现比TCID50的平台期出现更晚。