马立克病病毒gB主要抗原决定簇融合基因的真核表达

为了合成由HA表位和串联的马立克病病毒(MDV)gB主要抗原决定簇基因所构成的融合蛋白基因,并在真核中表达,选取了MDV GA株gB 250位～460位氨基酸为目的片段,应用基因重组技术,通过一个由柔性氨基酸组成的linker,使该基因片段在体外串联,并在串联片段的前端加上HA表位,末端加上终止密码子,以形成完整的阅读框;通过测序分析证明,引入的HA表位序列以及融合基因的阅读框完全正确.将融合基因克隆入真核载体pIRES中,从而获得真核表达质粒pCMV-HAgB(L),利用脂质体将该表达质粒转染CHO细胞,通过间接免疫荧光(IFA)和RT-PCR鉴定,发现该融合基因可以在真核细胞中正确表达,为开发新型的马立克病疫苗奠定了基础.     

水泡性口炎病毒抗原决定簇单克隆抗体研究

用RT-PCR的方法扩增水泡性口炎病毒G蛋白抗原决定簇部分基因片段,构建克隆质粒pMD18-T-G_(660)和表达质粒pET-28a-G_(660),转化宿主菌BL21(DE3),经IPTG诱导后得到高效表达,表达蛋白质的分子量为30 Ku,占总蛋白的20.745%。切胶回收蛋白测定蛋白含量,作为免疫BALB/c小鼠的免疫原,免疫BALB/c小鼠4次,按单克隆抗体制备技术,获得3株稳定分泌抗表达的G蛋白的单克隆抗体L细胞株,抗体类型鉴定属于IgG亚类。     

口蹄疫病毒抗原位点研究进展

抗原位点是在空间结构上相互独立的蛋白结构域,并决定了蛋白的抗原特性。口蹄疫病毒有A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2和SAT3型7个血清型,口蹄疫病毒的抗原结构十分复杂,不同的血清型有着不同的抗原位点,并且存在广泛的抗原变异。对口蹄疫病毒的抗原位点进行分析一直是口蹄疫病毒研究领域中的热点,该研究将有助于了解病毒的致病机理和推动新型疫苗的研制。文章对病毒的基本特性、抗原位点的研究方法和研究概况做一综述。     

高浓度口蹄疫病毒抗原的稀释试验

用预备试验初选的4种稀释剂a、b、c、d，对经浓缩培养法繁殖的牛、猪。型口蹄疫病毒进行稀释，使其与普通毒(对照)浓度相当。然后将其与普通毒一起在不同温度下放置不同时间后，测定TCID50，并对测定结果进行方差分析和多重比较。结果显示，4种稀释剂稀释的病毒TCID50。存在显著差异；a和b稀释的病毒TCID50。之间无显著差异，但均显著高于c和d稀释的病毒TCID50；a和b稀释的病毒与普通对照毒的TCID50。也无显著差异。表明，a和b均可用于稀释口蹄疫病毒抗原，考虑到成本，宜选用b。     

苜蓿遗传转化的研究进展

综述苜蓿遗传转化研究中,再生体系构建及基因导入方法的研究进展.     

苜蓿遗传转化的研究进展

综述苜蓿遗传转化研究中,再生体系构建及基因导入方法的研究进展。     

Bar基因转化草原1号苜蓿的研究

利用农杆菌介导法将抗草丁膦的Bar基因导入草原1号苜蓿,经叶片筛选试验证实转基因植株对除草剂Basta具有抗性,通过多聚白酶连式反映检测,初步证实目的基因已转入到苜蓿基因组中.     

免疫压力下口蹄疫病毒的抗原变异

口蹄疫病毒(FMDV)属于小RNA病毒科口蹄疫病毒属成员,其能够感染猪、牛、羊等偶蹄类动物,引起烈性传染病口蹄疫(FMD)的发生.FMDV抗原的高频率变异给FMD的防控和根除带来了巨大困难,这也是影响FMD疫苗免疫效果不佳的主要原因.因此,FMDV抗原变异一直是突破口蹄疫防控难题的研究重点.本文主要从FMDV的结构蛋白...     

蒺藜苜蓿遗传转化体系研究进展

豆科植物作为重要的农作物和牧草资源, 是人类和动物的重要蛋白质来源。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)是豆科模式植物, 其遗传转化体系的建立和完善对促进豆科植物基因工程研究和功能基因组学研究均具有重要意义。本文结合国内外蒺藜苜蓿基因工程研究动态, 从转化方法、外植体类型、菌株型、载体和培养基使用等方面对R108、Jemalong 2HA、Jemalong J5、Jemalong A17和Jemalong M9-10a这5种生态型蒺藜苜蓿转基因研究进展进行了系统综述, 并对当前存在的问题及今后的研究趋势进行了讨论, 以期为豆科植物遗传转化体系进一步完善提供参考。     

冷诱导转录因子AtCBF1转化紫花苜蓿的研究

为研究冷诱导转录因子CBF1(C-repeat-binding-factor)基因对我国优良豆科牧草紫花苜蓿的抗寒性改良作用,本实验以拟南芥基因组DNA为模板,利用PCR方法克隆得到了冷诱导转录因子AtCBF1基因,测序结果表明所克隆的DNA片段长度为642 bp, 将该序列与GenBank上的CBF1基因序列进行DANMAN序列比较分析,同源性可达99.84%。在此基础上成功构建了含有AtCBF1基因的植物表达载体pBI121-CBF1,并采用根癌农杆菌介导法对紫花苜蓿进行了遗传转化,获得了经卡那霉素筛选的抗性转化植株,进一步经PCR和RT-PCR检测,得到了650 bp左右的电泳条带,表明AtCBF1基因已在紫花苜蓿中得到表达。这为选育紫花苜蓿抗寒新品种奠定了良好的基础。     

紫花苜蓿基因转化的影响因素分析

通过农杆菌介导法对紫花苜蓿不同品种植株进行了抗旱基因转化的研究,得到了一套紫花苜蓿基因转化的优化体系。研究表明,100 mg/L的卡那霉素对苜蓿愈伤组织的生长有着显著的抑制效应。250 mg/L头孢霉素能够有效地抑制农杆菌菌株LBA4404的生长。紫花苜蓿供试材料被切后直接用OD600值为0.3~0.5的农杆菌LBA4404菌液侵染10~15 min;培养材料共培养3 d后在愈伤组织诱导培养基MS 2 mg/L 2,4-D 0.5 mg/LKT 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 250 mg/L Cef上诱导出愈伤组织;在体细胞胚分化培养基MS 1.0 mg/L BA 0.3 mg/L NAA 30 g/L蔗糖 9 g/L琼脂 50 mg/L Kan 250 mg/L Cef上促进体细胞胚的分化;分化出的体细胞胚在再生培养基上(同分化培养基,Kan为80 mg/L)进一步发育成抗性转化苗;转化的无根小苗在生根培养基1/2 MS 1.0 mg/L IBA 1%蔗糖 0.8%琼脂 100 mg/L卡那霉素上可生长出根系。     

豌豆清蛋白１（PA１）基因的克隆及对苜蓿的转化

 本研究用ＰＣＲ 方法从豌豆（食荚大菜豌）克隆出富含硫氨基酸、同时具有抗虫作用的双功能的蛋白质基因－豌豆清蛋白１（ＰＡ１）基因,并构建了植物表达载体ｐＣＡＭＢＩＡｌ３０１－ＰＡ１。采用农杆菌介导法转化了紫花苜蓿,并对其转化体系进行了优化,得到了多个转基因胚性愈伤组织及其再生植株。ＰＣＲ 和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交检测表明,ＰＡ１基因和潮霉素抗性基因已被整合到了宿主细胞。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ 分析表明该基因在再生植株中有一定表达。游离氨基酸分析表明,ＰＡ１基因的表达转基因苜蓿中蛋氨酸和半胱氨酸的含量从０．１％提高到０．４％。     

牛皮蝇HA抗原基因转化紫花苜蓿的研究

以“甘农1号”紫花苜蓿(Medicago sativa)7 d苗龄子叶和下胚轴为受体材料,建立了高效的苜蓿再生体系和遗传转化体系,筛选出MS+2,4 D 2.0 mg/L+6 BA 0.5 mg/L和MS+6 BA 0.5 mg/L+NAA 0.03 mg/L+GA3 2.0 mg/L为苜蓿子叶愈伤组织诱导和分化的适宜培养基;探讨了农杆菌浓度OD600约0.5、感染时间8~10 min、共培养时间2 d为适宜的转化条件。采用农杆菌介导法将Hyperdomin A（HA）基因导入紫花苜蓿,经PCR检测和Southern分子杂交分析,结果表明HA基因已经整合到苜蓿基因组中,可为牛皮蝇蛆病可食性疫苗的研究提供理论基础。     

北京地区紫花苜蓿最佳播种量试验

在顺义、通州、平谷和昌平进行不同播量试验,从9～24kg／hm2共设6个处理,试验表明：不同播种量对第1年紫花苜蓿Medicago sativa的生长影响大,随播种量的增加,单株分枝数减少;在第1年春季生长时,各播量对个体影响不大;随着苜蓿生长年限的增加,不同播种量对其生长发育的影响逐渐降低,产量之间的差异性越来越小;北京地区最佳播种量应控制在12～18kg／hm^2的范围内,播种量超过21kg／hm^2则群体生长发育有较大变化,影响产量。     

紫花苜蓿尿黑酸植基转移酶的克隆、表达分析以及遗传转化研究

维生素E是一种人体必需,却不能自主合成的脂溶性维生素。尿黑酸植基转移酶(HPT)是维生素E生物合成途径的关键限速酶,直接影响植物体内维生素E的总量。本实验利用同源克隆的方法,根据截形苜蓿的序列从紫花苜蓿中克隆得到HPT基因的完整开放阅读框(ORF)。NCBI Blast分析结果表明,该基因编码412个氨基酸,属于异戊烯转移酶UbiA超家族。多序列比对结果表明,该序列与其他物种的HPT蛋白序列相似度高达80%,将其命名为MsHPT。进化树分析结果表明,MsHPT与截型苜蓿MtHPT亲缘关系最近,蛋白序列相似度为96.84%。通过染色体步移技术得到该基因的启动子序列,分析结果显示,该基因的启动子区域含有胁迫响应元件、激素响应元件(脱落酸、赤霉素和乙烯)以及大量的光响应元件。实时荧光定量PCR检测结果表明,MsHPT基因在紫花苜蓿各组织中均有表达,叶片中的表达量最高,根次之。经低温、NaCl、PEG、GA₃和ABA诱导后该基因表达均上调,表明其可能参与了植物的抗逆性调控。扩增MsHPT基因的开放阅读框,对其进行双酶切后转入双元表达载体pBI121中,通过农杆菌介导的方式将该基因转入拟南芥。通过PCR鉴定,得到7株阳性苗。本研究为进一步探索MsHPT在紫花苜蓿维生素E的合成以及紫花苜蓿抗逆调控中的作用奠定了基础。     

紫花苜蓿二氢黄酮醇还原酶基因(MsDFR)的克隆与分析

二氢黄酮醇还原酶(dihydroflavonol reductase,DFR)是缩合单宁生物合成途径中的关键酶,在单宁的合成中起着重要的作用。根据同源克隆的原理,利用RACE技术,从“中苜一号”苜蓿中克隆得到DFR基因(MsDFR),并对其进行了序列分析及不同胁迫条件下的表达模式分析。结果表明,MsDFR基因cDNA全长1 402 bp,包括开放阅读框1 023 bp,编码340个氨基酸,在N端存在1个NADP结合位点“VTGASGFIGSWLVMRLMERGY”,中部存在1个底物特异性结合的氨基酸基序“TLNVTEDQKPLWDESCWSDVEFCRRV”。实时荧光定量PCR结果表明,该基因在荚果中表达量较高,根中较弱;在NaCl和GA₃诱导下,MsDFR基因表达受到抑制;在黑暗条件下,该基因被诱导表达。由此推测“中苜一号”苜蓿中可能存在不依赖于GA₃信号的单宁合成途径。     

中国苜蓿品种种子产量性状的遗传多样性

在田间穴播条件下，对国内28个3龄苜蓿品种种子产量性状的遗传多样性进行了研究。结果表明绝大多数品种的种子产量及产量构成因素的品种内变异大于品种间变异，参试品种的单株种子产量平均为3.88g，变幅在0.2-23.4g之间：品种间变幅为1.20-8.00g，品种间变异占总遗传变异的14.2%-37.7%，而品种内变异占总遗传变异的62.3%-85.8%。参式各品种的种子产量与产量构成诸因素呈不同程度的显著正相关。绝大多数品种的实际种子产量占潜在产量的百分比小于1％。     

AtSOS基因在紫花苜蓿中的表达及其耐盐性研究

本研究采用基因工程技术改良紫花苜蓿耐盐性,通过种植转基因耐盐紫花苜蓿达到改良土壤的目的。以紫花苜蓿子叶节为外植体,通过农杆菌介导法将来源于拟南芥的AtSOS1-AtSOS2-AtSOS3多基因表达载体导入阿尔冈金紫花苜蓿中,经PCR检测、抗除草剂筛选和RT-PCR鉴定,获得了能稳定表达的转基因株系。以转基因的紫花苜蓿和野生型紫花苜蓿为材料进行盐处理,每个处理重复3次,测定其生理生化指标、株高、Na⁺和K⁺含量、细胞膜透性、叶绿素含量。结果显示,在不同盐浓度处理下,所有植株的株高均有所增长,但在100和200 mmol·L^-1的NaCl处理下,转基因植株的长势显著高于野生型植株;随着处理时间的增加,所有植株的叶绿素含量均呈先上升后下降的趋势,且野生型植株叶绿素含量均低于转基因植株;在100和200 mmol·L^-1的NaCl处理下,转基因植株的细胞膜透性、超氧化物歧化酶活性和脯氨酸含量的增加量均小于野生型植株,而过氧化物酶、过氧化氢酶活性和可溶性糖含量的增加量均大于野生型;各植株中丙二醛含量均下降,且野生型植株下降的更为明显;盐处理后,转基因植株根系中Na⁺的积累比野生型植株少,而K⁺的吸收多于野生型植株。转AtSOS基因的紫花苜蓿通过发挥AtSOS途径的作用,促进了植物体将细胞内的Na⁺外排,从而减轻盐胁迫对植物体的伤害,提高了转基因植株的耐盐性。     

AtPCS1基因表达载体构建与转化苜蓿的研究

扩增拟南芥(Arabidopsis thaliana)螯合肤合成酶(AtPCS1)全长基因;构建AtPCS1植物表达载体pBI 121-AtPCS1,进一步转化农杆菌EHA105;利用转化的农杆菌EHA105侵染甘农一号苜蓿(Medicago satiua)叶片,经过80～100 d的筛选与培养,获得57株再生转基因植...