燕麦ISSR反应体系的建立与优化

以10个燕麦品种的基因组DNA为模板,从退火温度、TaqDNA聚合酶、Mg2+、dNTP、引物5个方面对ISSR分子标记体系进行摸索并设计优化试验,建立了一套燕麦ISSR优化反应体系,即:25μl反应体系中,18.3μlddH2O,2.5μl 10×buffer,2.0μmol/L Mg2+,250μmol/L dNTP,1.5 U Taq DNA聚合酶,0.3μmol/L引物,10ng DNA模板。反应程序为:94℃预变性3 min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸1 min,34个循环;72℃延伸5 min,4℃保存。     

鸭茅ISSR反应体系的建立及引物筛选

以鸭茅基因组DNA为模板，对ISSR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化实验，建立了一套鸭茅ISSR分子标记的最优化反应体系，同时筛选出了12个适于鸭茅基因组DNA且PCR扩增效果较好的ISSR引物。鸭茅ISSR分子标记的20μL最优化反应体系中，最终浓度：Mg^2＋为1．6mmol／L、dNTP为250mol／L、Taq酶为1．0 U、引物浓度为0．25μmol／L、模板DNA量为100ng。     

鸭茅ISSR反应体系的建立与优化(简报)

简单序列重复区间扩增多态性(Inter-simple sequence repeat,简称ISSR)是由zietkiewicz等于1994年创建的一种DNA标记技术^[1]。ISSR技术的原理和操作与SSR、RAPD非常相似,只是引物设计要求不同,但其产物多态性比RFLP、SSR、RAPD丰富,可提供更多的基因组信息,比RAPD技术更加稳定可靠,实验重复性好^[2]。     

东方蜜蜂ISSR反应体系的建立及优化

以东方蜜蜂(Apis cerana)为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的因素如模版DNA、Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物的浓度及退火温度进行了研究.确立了适合东方蜜蜂ISSR扩增的反应体系:25IX L反应体系中最适含量为:10×PCR buffer 2.5μL,2.5mmol/L MgCl2,0.2 mmol/L dNTPs,1UTaqDNA聚合酶,0.4 pmol/μL引物,20～40 ng模板DNA.PCR反应程序为:94℃预变性5 min,94℃变性1 min,52.3℃(引物UBC811优化后的退火温度,退火温度随引物不同而定)退火30 s,72℃延伸30 s,35个循环,72℃再延伸5 min,在4℃保存.优化体系的建立为进一步利用ISSR分子标记技术进行东方蜜蜂遗传多样性研究奠定了基础.     

鹰嘴豆ISSR反应体系的正交优化

鹰嘴豆(Cicer arietinum)ISSR反应体系的建立可以为鹰嘴豆种质资源遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位提供理论依据和技术参考。本研究以CTAB法提取的鹰嘴豆DNA为模板,采用L₁₆(4⁵)正交设计直观分析法,对鹰嘴豆ISSR-PCR反应中的4个主要因素(Mg²⁺浓度,引物浓度,TaqDNA聚合酶浓度,dNTPs浓度)在4个水平上进行优化,并在最优ISSR-PCR反应体系的基础上对引物UBC826的最适退火温度进行筛选。结果表明:Mg²⁺和引物浓度对PCR扩增结果有显著影响,dNTPs和Taq酶的浓度变化对PCR扩增结果无显著影响。鹰嘴豆ISSR-PCR优化反应体系(25 μL)为:3 mmol·L^-1 Mg²⁺,0.2 mmol·L^-1 dNTP,0.24 μmol·L^-1引物,2 U Taq DNA聚合酶。UBC826最适退火温度为56℃。     

紫花苜蓿ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过优化影响紫花苜蓿(Medicago sativa L.)ISSR-PCR的主要参数,建立适于紫花苜蓿的ISSR反应体系和扩增程序。在20μL体系中各反应物的最适含量为:15 ng模板DNA,0.2 mmol/L dNTP,0.4μmol/L ISSR引物,0.8 U Taq DNA聚合酶,2μL 10×PCR Buffer,1.5 mmol/L MgCl₂,2.5%去离子甲酰胺。PCR扩增程序为:94℃预变性4 min,94℃变性30 s,62℃(62℃~58℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共11个循环,每个循环退火温度降1℃;94℃变性30 s,52℃(52℃~48℃)退火45 s,72℃延伸1 min 45 s,共24个循环;72℃延伸5 min,25℃保温。     

百脉根ISSR-PCR反应体系的建立与优化

运用L16(45)正交设计对百脉根ISSR反应的5个因素,即DNA模板浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Mg2+浓度、TaqDNA聚合酶浓度在4个水平上进行优化实验,通过不同反应体系扩增效果比较,最终确定在20uL体系中各反应物的最适含量为:40ng模板DNA、2μL 10×PCR Buffer、0.15mmol/LdNTPs、0.75μmol/L ISSR引物、1.5mmol/L MgCl2、1UTaqDNA聚合酶。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行百脉根属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

白羊草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素、双因素设计结合的方法,对白羊草ISSR-PCR反应体系的Mg2+、dNTP、模板DNA、Taq DNA聚合酶及引物5种主要因素进行优化。确立了白羊草最佳反应体系及扩增程序:25μL体系中dNTP 0.2mmol/L、Taq酶1.0U、引物0.6μmol/L、Mg2+2.5mmol/L、DNA模板30ng、10×PCR Buffer 2.5μL;扩增程序:94℃预变性5min,94℃变性45s,50～60℃(退火温度随引物不同而定)退火60s,72℃延伸90s,共35个循环,72℃后延伸5min。     

冰草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

为进一步开展冰草属植物种质资源遗传多样性研究,寻找可用于冰草(Agropyron cristatum(L.)Gaertn.)的ISSR-PCR最适反应体系并建立与优化,具有重要的意义。通过优化影响ISSR-PCR体系的主要参数,最终确定在20μL体系中各反应物的最适含量为:40 ng模板DNA,0.2 mmol·L^-1dNTP,0.5μmol·L^-1ISSR引物,1 UTaq DNA聚合酶,2μL10×PCR Buffer,2.5 mmol·L^-1MgCl₂;引物815号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行冰草属种质资源的遗传多样性分析奠定了技术基础。     

假俭草ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以假俭草为材料,对影响ISSR—PCR扩增结果的因素进行了探讨,建立了适合假俭草ISSR—PCR分析的最佳反应体系。表明在20弘L总体积中,包含40ng模板DNA、ISSR引物0．4umol／L、dNTPs0．1mmol／L、Mg^2＋1．0mmol／L、0．1U TaqDNA聚合酶和10×buffer 2．0uL。扩增条件为．94℃预变性5min;94℃变性45s,55℃退火45s,72℃延伸1．5min,35个循环;72℃延伸7min。     

克氏针茅ISSR-PCR反应体系的建立与优化

采用正交试验与单因素设计相结合的方法,对克氏针茅ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA、Mg2 、TaqDNA聚合酶、dNTP及引物)进行优化筛选,确立了适合克氏针茅ISSR分析的优化反应体系。在25μL反应体系中各反应成分为:模板DNA 50 ng,Mg2 1.5 mmol/L,dNTP 0.2 mmol/L,引物0.8μmol/L,TaqDNA聚合酶1 U,10×buffer 2.5μL。这一体系的建立为今后利用ISSR技术进行克氏针茅遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

燕麦AFLP反应体系的建立与优化

在利用扩增片断长度多态性(AFLP)技术研究燕麦Avena sativa遗传多样性过程中,从引物筛选、酶切连接、扩增条件、检测方法等几个方面进行优化,建立燕麦AFLP最适反应体系为:800ng/μL DNA 用10 U EcoRⅠ和4 U MseⅠ在37 ℃ 7 h,65 ℃ 4 h温浴双酶切; 16 ℃下连接过夜;预扩增取连接产物1 μL,10 μmol/L预扩引物各0.6 μL, 10×buffer 2μL, dNTPS 2μL,ddH2O 补平至20 μL;取5μL稀释 20 倍后的预扩增产物,50 ng/μL EcoRⅠ、MseⅠ选扩引物各0.8μL,总体系20 μL进行选择性扩增.在此优化体系下,可以得到重复性好、稳定且多态性高的燕麦AFLP条带.     

豌豆ISSR-PCR反应体系的建立和优化

以豌豆(Pisum sativum L.)DNA为材料,对影响其ISSR-PCR反应体系中的5种主要因素(模板DNA量、引物浓度、dNTPs浓度、Taq酶量、退火温度)进行优化,最终确定了豌豆ISSR-PCR反应的最佳体系(20 μL)为:15 ng模板DNA, 0.15 mmol·L^-1dNTP, 0.5 μmol·L^-1ISSR引物, 1 U Taq DNA聚合酶,引物842号的最适退火温度为50℃。该体系的建立为今后利用ISSR技术进行豌豆属种质资源的遗传多样性分析、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

结缕草属植物SRAP－PCR体系的建立和优化

以ＳＤＳ法提取的结缕草属植物叶片ＤＮＡ 为模板,分别采用单因子试验和正交设计试验２种方法,对影响结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 的MG²⁺ 、ｄＮＴＰ、引物、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶和模板ＤＮＡ 五个因素进行优化试验。单因子试验分别研究各因素在多水平条件下对ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 反应体系的影响,得到最佳反应条件。正交设计采用Ｌ１６（４５）方案,综合考虑各因素间的相互作用,通过直观分析法获得各影响因素的最佳反应水平。根据４对引物对６ 份结缕草属植物材料扩增结果的验证比较,２种方法所获得的最佳反应体系存在一定的差异。通过综合比较和分析２种方法的优化体系扩增出的条带数、多态性条带数及多态性比率,最终建立了结缕草属植物ＳＲＡＰ－ＰＣＲ 的最佳反应体系：MG²⁺２．００ｍｍｏｌ／Ｌ、ｄＮＴＰ２２０μｍｏｌ／Ｌ、引物０．２０μｍｏｌ／Ｌ、ＴａｑＤＮＡ 聚合酶０．５０Ｕ、模板ＤＮＡ６０ｎｇ、２μＬ１０×ｂｕｆｆｅｒ,总体积为２０μＬ。这一优化体系的建立为今后利用ＳＲＡＰ标记技术进行结缕草属植物遗传多样性、种质鉴定、遗传连锁图谱及亲缘关系分析等方面的研究提供了科学的依据。