牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gG基因的PCR扩增

参考牛传染性鼻气管炎病毒全基因序列(GenBank)设计1对特异性引物,以牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株提取的总DNA为模板,运用PCR方法成功地扩增出牛传染性鼻气管炎病毒内蒙古分离株gG基因,并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。     

牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成GH-1、GH-2两条引物,分别以IBRV的Barta Nu/67株、IBRVBK125株基因组DNA为模板进行扩增,结果两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对其同属的伪狂犬病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒（HVT）及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）进行扩增均未见特异性条带;敏感性检测表明,该法对IBR病毒的检出限量为104.25TCID50/0.1mL.     

牛传染性鼻气管炎病毒LUXTM新型荧光PCR检测方法的建立

本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^TM引物，建立L刚新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应，而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性，检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明，LUX^TM荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0．04TCID50，比病毒分离敏感性至少提高10倍；对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品，L刚荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10^3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中，该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40TCID50牛抗凝全血、血清和临床精液中0．04TCID50的病毒，说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUXTM荧光PCR方法快速敏感，适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒双重PCR检测方法的建立

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中登录的IBRV gE和gB基因序列,设计2对特异性引物。结果表明,建立的方法特异性强,对牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛和羊布鲁菌进行检测,结果均为阴性。研究表明,所建立的双重PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于IBRV的检测。     

牛传染性鼻气管炎PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列设计一对引物,进行PCR检测,并对反应条件及反应体系进行优化。结果得到与预期大小(362bP)一致的特异性片段。最佳退火温度为58～64℃,Mg2 最佳浓度为1.6mM,dNTPS为0.36mM,引物为0.2pmol/uL,聚合酶0.8U/100uL。用这对引物扩增IBRV、HCV、PRRSV、PRV,只有IBRV扩增出特异性条带。该PCR方法的检测灵敏度为2.4ng/100uL,较其他方法敏感。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE基因LAMP检测方法的建立

根据Gen Bank收录的BHV-I NM06株的gE基因序列,利用软件Primer Explorer V4设计2对LAMP引物,建立IBRV gE基因的LAMP检测方法;利用重组质粒进行了敏感性检测,利用IBRV、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛轮状病毒等进行特异性试验,并对临床采集的50份奶牛鼻腔拭子DNA进行了检测。结果显示,建立的LAMP方法能对重组质粒DNA产生阳性反应,在58℃~65℃8个温度进行反应,结果无肉眼可见差异,反应最短时间达90 min时可见到阳性结果;该方法的检测下限是1.68×10~4拷贝/μL,对6种其他微生物呈阴性反应;50份临床样品中检出2份阳性。表明本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP快速检测方法,可用于IBRV分离株的鉴定以及临床样品的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒TK基因缺失株与野毒株PCR鉴别诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性敢管炎病毒（ＩＢＲＶ）ＴＫ基因和ｇＢ基因序列,应用Ｏｌｉｇｏ４．１程序设计两对引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２及ＰＢ１和ＰＢ２,分别对已构建的ＴＫ基因缺失（ＴＫ）ＩＢＲＶ以及ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行了ＰＣＲ扩增,结果显示７株ＩＢＲＶＤＮＡ用引物ＰＴＫ１和ＰＴＫ２扩增产生４５７ｂｐ的特异性片段,而ＴＫＩＢＲＶ只出现１１０ｂｐ     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测.结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应.本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测.     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示：该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10⁴和10³ copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%...     

牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。对临床收集的40份牛精液(其中8份已经鉴定为阳性)和10份牛鼻腔拭子(其中2份已经鉴定为阳性)用该体系进行检测,均得到预期结果。该方法的建立可用来对临床样品中BHV1的快速检测和实验室的质量控制。     

牛传染性支气管炎病毒PCR诊断方法的研究

根据已发表的牛传染性鼻气管炎病毒（ＩＢＲＶ）ｇＢ基因序列,应用ｏｌｉｇｏ４．１程序设计一对引物ＰＢ１／ＰＢ２,分别对ＩＢＲＶＬＡ株、洛精、美精、ＢａｒｔｈａＮｕ／６７株、Ｂ７株、云南－１和云南－２分离株进行ＰＣＲ扩增。结果显示７株ＩＢＲ病毒ＤＮＡ均有３９９ｂｐ的特异性片段。用此引物对其同属的伪狂犬病毒（ＰＲＶ）、马立克氏病毒（ＭＤＶ）、鸡传染必喉气管炎病毒（ＩＬＴＶ）进行扩增。均未见特异性条带,证     

牛传染性鼻气管炎活疫苗安全性和免疫保护效果研究

本试验使用牛传染性鼻气管炎弱毒活疫苗进行安全性和免疫保护效果研究,将该疫苗分别接种1月龄犊牛、6~8月龄牛及后备母牛,接种剂量为2 mL(10头份),检验疫苗安全性。将疫苗接种6~8月龄牛,接种剂量为1 mL(1头份),疫苗接种后28 d使用检验用强毒进行攻毒,检验疫苗对攻击用强毒的保护效力。结果表明,不同月龄牛接种疫苗后体温正常,无任何临床可见异常,后备母牛接种疫苗后精神状态及食欲均良好,无流产、死胎及木乃伊胎出现。疫苗接种牛对强毒攻击可产生较好的抵抗力,攻毒保护率达5/5。 研究结果表明,该疫苗对牛安全,且免疫保护效果良好。     

牛传染性鼻气管炎病毒攻毒方式的对比研究

本试验旨在建立牛传染性鼻气管炎病毒的攻毒模型,明确病毒在牛体内的分布及确定最佳攻毒方式,建立牛传染性鼻气管炎的发病标准,用来评价IBRV LNM弱毒疫苗的保护效力。试验共使用健康断乳牛9头,设鼻内喷雾组、滴鼻组和对照共3组,每组3头牛。将实验室分离保存的IBRV LN01/08强毒株采用鼻内喷雾和滴鼻两种方式接种试验组动物后,连续14 d,每日观察临床症状,监测体温及采集鼻拭子,对收集的试验数据进行对比分析。选取临床发病不同时期剖杀动物,采取主要脏器进行病毒分离。结果显示,所有动物攻毒后有不同程度的临床表现,以鼻内喷雾组临床表现最为严重,剖检可见肺部病变明显。病毒主要分布在呼吸道和眼结膜组织中。研究结果显示,采用IBRV自然感染方式攻击动物,喷雾方法攻毒临床效果明显强于滴鼻方式,保证了临床发病模型的建立,可以用来IBRV疫苗免疫效果评价,为研制IBR疫苗提供前提基础。     

牛传染性鼻气管炎弱毒与牛病毒性腹泻弱毒抗原免疫干扰的研究

本试验使用3~6月龄健康易感牛9头(牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗原、抗体均阴性),共分3组,每组3头犊牛。第1组首免肌肉注射IBRV-LNM弱毒疫苗株种毒,接种1周后,每头牛接种BVDV-SM弱毒疫苗株;第2组只接种BVDV-SM弱毒疫苗株种毒,接种时间同第1组;第3组为对照组,接种MDBK细胞培养液。接种BVDV-SM疫苗毒后每周采血至疫苗毒接种后28 d,测定接种后BVDV抗体效价,并采用BVDV-JL检验用强毒进行攻毒试验。结果表明,第1组与第2组试验动物血清中牛病毒性腹泻病毒抗体水平无明显差异,能够抵抗BVDV-JL强毒攻击达到免疫保护的效果,说明牛传染性鼻气管炎病毒IBRV-LNM弱毒疫苗株接种后在牛体内对牛病毒性腹泻病毒BVDV-SM疫苗毒不产生免疫干扰作用。     

牛传染性鼻气管炎病毒tk基因的克隆

根据牛传染性鼻气管炎病毒ＬＡ株的物理图谱及Ｃｏｐｅｒ株和ＬＡ标ｔｋ基因在基因组中的定位，将ＬＡ株ＤＮＡ ＨｉｎｄⅢＡ片段中的ＳａｌＩ－ＳａｌＩ亚片段、ＢｇｌⅢ－ＳａｌＩ双酶切亚片段分别克隆到载体质粒ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＳＫ中，筛选出３个重组质粒ｐ＾ｔｋ－１，Ｐｔｋ－２和Ｐｔｋ－３，其外源片段大小分别为２．７ｋｂ，１．１ｋｂ和１．６ｋｂ。经酶切分析及同源核酸探针杂交试验表明，２．７ｋｂ ＳａｌＩ－     

抗牛传染性鼻气管炎病毒囊膜gD糖蛋白的单链抗体在昆虫细胞中表达及活性检测

为了获得具有生物学活性的牛传染性鼻气管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV） gD蛋白特异性单链抗体,试验采用PCR方法扩增杂交瘤细胞的cDNA单链抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因,通过重叠延伸PCR及Linker序列获得完整的单链抗体基因,将单链抗体基因克隆至杆状病毒载体pFB-LIC-Bse中,构建重组转移载体pFB-VH-VL,将其转化至大肠杆菌DH10Bac感受态细胞中制备重组杆粒rBacmid-VH-VL,将重组杆粒rBacmid-VH-VL转染至Sf9细胞中获得携带单链抗体基因的重组杆状病毒。该重组杆状病毒在Sf9细胞中表达了分子质量约为30 ku的单链抗体蛋白。Western blotting结果显示,重组单链抗体蛋白能被His标签抗体特异性结合,也能特异性结合gD蛋白。间接免疫荧光试验结果显示,该单链抗体蛋白能够识别感染牛肾细胞MDBK中的IBRV。本研究在昆虫细胞中成功表达了具有识别IBRV的gD蛋白特异性单链抗体,为牛传染性鼻气管炎的诊断与治疗奠定了基础。     

Expression and Biological Activity of Single Chain Antibody Against gD Glycoprotein of Infectious Bovine Rhinotracheitis Virus in Insect Cells

For preparation of bioactive single chain fragment variable (ScFv) which was targeted against envelope glycoprotein D (gD) of infectious bovine rhinotracheitis virus (IBRV),VH and VL genes were amplified from the cDNA of lymphocyte hybridoma, then VH and VL genes were integrated with a Linker by SOE-PCR,and the ScFv gene was cloned into the baculovirus vector pFB-LIC-Bse, which was transformed into Escherichia coli DH10Bac competent cells to construct a recombinant bacmid rBacmid-VH-VL. Finally,ScFv was expressed by transfected rBacmid-VH-VL into insect Sf9 cells, its molecular weight was about 30 ku. The result of Western blotting suggested that ScFv generated in Sf9 cells was specifically binds to His antibody,the protein also showed high affinity to gD of IBRV. The result of indirect immunofluorescence assay showed that ScFv could recognize IBRV which infected bovine kidney cells (MDBK). The study indicated that the recombinant ScFv was expressed in Sf9 cells, and could bind to gD of IBRV specifically. The result could provide the basis for the diagnosis and treatment of infection of IBRV.     

牛传染性鼻气管炎诊断方法研究进展

牛传染性鼻气管炎(IBR)是由牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),即牛疱疹病毒1型(BoHV-1)所引起的以上呼吸道炎症为主的一种牛的急性、热性、接触性传染病,呈世界性流行。IBR的早期准确诊断,对该病的防控具有不可忽视的作用。目前,IBR的诊断方法主要包括病原学诊断和血清学诊断方法。病原学诊断具有特异和敏感及准确等特点,而血清学诊断具有敏感、快速、方便和价廉等特点。为了实施IBR的净化和根除计划,部分国家和地区已逐渐采用IBR基因缺失疫苗,配套使用鉴别诊断方法来鉴别IBR疫苗免疫和自然感染。论文就牛传染性鼻气管炎常用诊断方法的研究进展进行综述,以期为IBR的诊断和防控提供参考。     

牛传染性鼻气管炎诊断和防治

牛传染性鼻气管炎又被称为坏死性皮鼻炎,是由牛传染性鼻气管炎病毒感染引发的一种急性呼吸道疾病。不同年龄的牛感染传染性鼻气管炎病毒后表现的临床症状存在一定差异,年龄较小的牛会表现为明显的临床症状,年龄较大的牛呈现隐性感染或持续性感染,患病牛长时间或终生携带病毒,污染周围环境后造成病情反复流行,病情难以控制、难以消灭。牛传染性鼻气管炎造成的死亡率相对较低,但是会严重影响牛群正常生长与采食,需要掌握该类传染性疾病的流行特点,并进行严格诊断,然后构建有效的防控措施,降低发病率。该文分析牛传染性鼻气管炎的流行病学、临床症状、病理变化、诊断方法和防治措施。