抗α-INF卵黄抗体的制备与鉴定

用人抑制素 ( 1 -2 6 )Tyr.Gly与KLH连接作免疫原 ,免疫本地良种母鸡 ,旨在获得大量抗抑制素卵黄抗体 (eIgY)。实验中 ,收集鸡蛋 ,观察了血清及卵黄中特异性抗体的应答 ,结果经免疫的鸡有免疫应答 ,所产卵的卵黄中可检出大量的有高度活性的抗体。综合运用pH值 ,非球蛋白沉淀法和球蛋白沉淀法 ,制得纯度较高的抗抑制素eIgY。采用阻断ELISA法证实所获得的eIgY具有高度的特异性。用eIgY被动免疫未成年昆明鼠 ,子宫重量明显增加。由此得出结论可以用鸡做生物反应器大量生产抗抑制素抗体 ,用于被动免疫家畜来提高家畜繁殖率     

抑制素基因免疫对小鼠生殖的影响

用编码抑制素α（1－32）的基因与pcDNA3.1真核表达质粒进行重组，构建抑制素基因疫苗NH。将30只2周龄ICR小鼠随机分为3组（每组10只），试验Ⅰ，Ⅱ组分别经脂质体介导肌肉注射iINH15μg()0μL,25μg(100μL)，对照组注射免疫空载体pcDNA3.115μg(100μL)。首次免疫后间隔3周加强免疫1次。小经pINH基因免疫后，用ELISA可从血浆中检测到抑制素抗体，表明pINH可在活体肌细胞内表达，表达产物具有制素抗原性，能激活免疫系统产生抑制素抗体。抑制素抗体P／N＞2视为阳性，阳性率为30％（6／20）。抑制素抗体阳性小鼠与阴性小鼠的产仔数，初生重和窝重等没有显著差异（P＞0．05）。抗体阳性组首次免疫后，雌鼠血浆FSH浓度略有升高，经过加强免疫后显著升高（P＜0．05）。由此可以看出，抑制素基因免疫可以诱导产生抗抑制素抗体，并促进促卵泡素的分泌。     

抑制素基因免疫的免疫反应性

通过应用抑制素真核表达质粒pcINH和抑制素融合表达质粒pCIS分别经肌肉注射免疫大鼠的2个系列试验，检测了免疫鼠抑制素抗体水平及抗体阳性鼠的比例。结果，抑制素质粒pcINH经脂质体介导免疫大鼠，50％（13／26）的个体产生了抑制素阳性抗体。40μg组产生的抗体水平最高；抑制素融合表达质粒pCIS免疫经盐酸普鲁卡因处理的大鼠，2次免疫获得了38.9％（23／54）的抗体阳性率。3次免疫获得55．6％（20／36）的抗体阳性率，100μg组产生的抗体水平最高；加强免疫可提高抗体的水平。但免疫剂量的增加并不一定能增加抗体阳性鼠的比例。     

抑制素α主动和被动免疫对哈萨克羊生殖激素含量的影响

为了研究抑制素α（INHα）主动和被动免疫对哈萨克羊生殖激素含量的影响，本试验在对抑制素α重组质粒表达菌株进行诱导表达的基础上，将经纯化、鉴定的抑制素α重组蛋白免疫接种新疆双峰骆驼，制备驼抗抑制素α多克隆抗体，并对其进行纯化，检测抗体效价，验证抗体的特异性。之后选择3~5岁、发情时间相近并处于间情期的45只成年哈萨克羊随机分为3组，分别作为抑制素α多克隆抗体免疫组（A组）、抑制素α重组蛋白免疫组（B组）及对照组（C组），每隔10 d连续进行3次加强免疫，应用ELISA法检测在绵羊繁殖活动中具有重要功能的5种生殖激素：促卵泡素（FSH）、促黄体素（LH）、孕酮素（P₄）、雌激素（E₂）、抑制素（INH），并检测血液生化指标。结果显示，IPTG的最佳诱导浓度是0.6 mmol/L，在4 h时诱导出产量较高的抑制素α包涵体蛋白，纯化后的抑制素α重组蛋白纯度较高，并具有较好的免疫原性，经进一步验证发现，制备的抑制素α抗体效价为1：512 000，该抗体可与抑制素α重组蛋白特异性结合。说明成功制备了具有免疫原性的抑制素α重组蛋白和高效价的驼抗抑制素α多克隆抗体。免疫后A组LH、P₄含量和B组FSH、LH、P₄、E₂、INH含量与C组相比差异不显著（P>0.05），而A组FSH含量和E₂含量显著高于C组（P<0.05），INH含量显著低于C组（P<0.05）。通过血液生化指标检测发现，抑制素α蛋白和抑制素α抗血清两种免疫制剂免疫后，试验动物均没有出现不良症状。说明两种抑制素α抗原均可对哈萨克羊血液生殖激素的分泌产生良好效果，相比之下抑制素α抗血清免疫效果更佳。     

抑制素基因免疫大鼠的免疫应答与基因表达

为了研究抑制素基因免疫对大鼠免疫应答和发情的影响及免疫后抑制素的组织分布,将60只大鼠分为5组,每只分别肌肉注射10（T1）、50（T2）、100μg pCIS（T3）,50μg pcDNA3.1（V）和生理盐水（S）。ELISA检测抑制素抗体水平,阴道涂片法检测大鼠的发情状况,免疫组化分析抑制素的组织分布。结果显示,不同剂量抑制素基因2次免疫10 d后抗体P/N值均显著升高（P〈0.05）,3次免疫10 d后T2和T3组抗体P/N值进一步显著升高（P〈0.05）,T3组抗体水平有高于T1和T2组的趋势（P〉0.05）;抑制素基因免疫对大鼠的发情无显著影响;3次免疫2周后心脏、肝脏、接种肌肉部位均未检出抑制素;卵巢、肾脏和垂体部位均检出抑制素;而脾脏部位,抑制素质粒免疫组检出抑制素,对照组则未检出抑制素。这些结果表明,免疫剂量和次数的增加没有导致大鼠产生明显的抑制素免疫耐受,抑制素基因免疫大鼠是相对安全的,抑制素的组织分布结果亦为抑制素基因免疫的作用机理研究提供了理论依据。     

牛卵泡抑制素抗体对小白鼠和大白鼠卵巢与子宫的作用

从用牛卵泡抑制素α－亚基片段免疫过的健康鸡所产蛋的卵黄液中提取抗体。得粗提物：然后用不同剂量的粗提物被动免疫２０只性成熟小白鼠和２０只发情周期大白鼠。并以生理盐水处理作为对照。结果发现,小白鼠用０．３ｍｌ抗体处理后,卵巢与子宫增重显著高于对照组（Ｐ〈０．０５）。大白鼠用０．６ｍｌ抗体处理后,卵泡平均数显著高于对照组（Ｐ〈０．０５）。这些结果表明,牛卵泡抑制素抗体被动免疫对小白鼠和大白鼠的子宫和卵泡     

抑制素主动免疫后波尔山羊的排卵反应

在不发情季节 ( 6月 ) ,用重组绵羊抑制素α亚单位 (r oIHN α)主动免疫 40只经产波尔山羊 ,每只试验羊的用量为 10 0 μgr oIHN α ,4周后用相同剂量进行强化免疫。每周采取血样 ,用放射免疫法测定血浆中抑制素抗体滴度。试验羊发情后每天配种 1～ 2次至发情结束。每天 1次从发情开始至发情结束后 48h ,用超声波检查卵泡发育和排卵情况。最后 1次配种后 6或 7d用非手术法回收胚胎。免疫 6个月后让试验羊配种、妊娠和产羔。抑制素免疫 1周后抗体滴度开始上升。强化免疫 2周后 ,抗体滴度达到最大值。抑制素抗体滴度与直径大于 4mm的卵泡数 (r=0 70 ,P <0 0 0 1)、排卵数 (r=0 5 5 ,P <0 0 0 1)和获取卵子或胚胎数 (r=0 5 0 ,P <0 0 0 1)存在显著的正相关。而抑制素抗体滴度与排卵率存在明显的负相关 (r =- 0 37,P <0 0 0 1)。抑制素免疫山羊的排卵率为46 %～ 70 %。从 8月至 11月排卵数超过 4枚。 40只母羊抑制素免疫 6个月后 ,第一情期配种 ,有 34( 85 % )只母羊怀孕 ,2 9只正常分娩 ,平均产羔羊 2 2 ( 1～ 4)只。试验结果表明 ,抑制素主动免疫能引起山羊超数排卵。抑制素免疫 6个月后卵巢机能恢复正常 ,母羊仍能正常繁殖。     

基于噬菌体展示技术筛选抑制素α亚基特异性纳米抗体

【目的】通过噬菌体展示技术构建抗抑制素α亚基(INHα)纳米抗体文库,并筛选出针对绵羊INHα的特异性纳米抗体,以期制备出新型抑制素免疫制剂,为提高绵羊外周血促卵泡素(FSH)水平和排卵率做前期准备。【方法】利用pET32a-INHA原核表达载体诱导表达INHα蛋白,并对诱导表达的INHα蛋白进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定;用Ni琼脂糖凝胶纯化后的INHα蛋白免疫新疆双峰驼。通过巢式PCR扩增制备骆驼噬菌体展示纳米抗体文库,通过三轮免疫亲和淘选及噬菌体ELISA从该文库中富集和筛选INHα特异性纳米抗体,并通过测序得知纳米抗体的基因序列;用蛋白-蛋白模拟对接初步鉴定该纳米抗体与INHα蛋白的亲和性。【结果】通过原核诱导表达及Ni琼脂糖凝胶纯化得到了大小为36 ku的INHα重组蛋白,通过Western blotting检测到约36 ku的蛋白条带;双峰驼通过6次INHα蛋白免疫抗体效价达到1∶1 024 000;通过巢式PCR获得了400 bp左右的VHH基因,通过电转化等试验构建了库容量为1.05×10¹²CFU的纳米抗体文库,文库阳...     

人抑制素主动免疫对母鸡产蛋和内分泌的影响

本文报道了主动免疫抑制素对母鸡卵泡发育、排卵率和外周E2 和P的影响。用人工合成人抑制素α亚基 ( 1 -2 6Tyr.Gly)片断与KLH连接作免疫原 ,免疫 8只母鸡 ,1 2只作对照 ,观察其产蛋率的变化、卵巢卵泡的发育 ;用放免法测定排卵周期中外周E2 和P。免疫组产蛋率比对照组高 (P <0 0 5) ,卵巢上≥ 1 0mm的卵泡数无显著差异 ,但白泡、小黄泡数差异较大。第 3、4、5次免疫后产蛋率显著提高 ,但在实验期抑制素免疫对蛋重没有影响。用放免法测定发现处理组外周基础水平的雌二醇比对照组上升     

双拷贝抑制素基因疫苗pcISI的构建和表达及免疫

为构建高免疫原性的卵泡抑制素（Inhibin,INH）DNA疫苗,将INH基因片段α1-32插入到pcIS中乙肝表面抗原（HBsAg）S基因第112-113氨基酸残基密码子之间,构建含2拷贝INH的融合表达质粒pcISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pcISI构建成功。脂质体包裹法将pcISI转染HeLa细胞,ELISA检测表达产物的INH免疫反应原性。结果表明,融合目的基因在HeLa细胞获得表达,ISI融合蛋白具有比IS融合蛋白更强的INH抗原抗体反应性。将pcISI免疫6只大鼠后,5/6的大鼠产生了抗INH抗体,抗体P/N值在免疫后第2-6周高于pcIS免疫组。这些结果表明,所构建的质粒pcISI可以表达抑制素,表达产物具有较强的免疫原性。     

猪生长激素抗独特型抗体的制备及免疫学鉴定

应用猪生长激素（Ag）纯品，通过杂交瘤技术制备了猪生长激素单克隆抗体（Ab1）。Ab1经免疫亲和层析柱纯化后免疫新西兰白兔，其血清经饱和硫酸铵纯化后获得猪生长激素抗独特型抗体（Ab2）。再应用ELISA等方法进行鉴别。Ab2与Ab1呈阳性反应，与BALB／c小鼠r球蛋白呈阴性反应；Ab2与Ag竞争结合Ab1；Ab2抑制Ab1与Ag的结合。Ab1是针对猪生长激素纯品的单克隆抗体。Ab2是具有猪生长激素抗原内影像的抗独特型抗体。     

抑制素基因免疫对京白鸡产蛋性能的影响

120只380 d京白鸡随机分为4组,分别腿部肌肉注射0、50、100、150 μg抑制素真核表达质粒pcISI,20 d后加强免疫1次.ELISA检测抗抑制素抗体水平,观察产蛋量,并进行鸡蛋品质测定.免疫4个月后全部捕杀,统计各级卵泡数.结果表明,抑制素基因加强免疫后抗体水平显著升高(P<0.05),3个剂量组间差异不显著(P>0.05).试验组全期产蛋量极显著高于对照组(P<0.01),大白泡和小白泡比对照组显著增多(P<0.05),优势卵泡、小黄泡和鸡蛋品质与对照组差异不显著(P>0.05).表明抑制素基因免疫京白鸡可产生抗抑制素抗体,并能提高京白鸡的产蛋性能.     

鸡β-防御素-9的融合表达及其多克隆抗体的制备与鉴定

为制备鸡β-防御素-9(AvBD9)多克隆抗体,本试验将AvBD9基因插入pGEX-6 P-1载体,构建重组基因pGEX6 P-AvBD9大肠杆菌表达质粒。将通过切胶纯化获得的表达产物包涵体谷胱甘肽转移酶-AvBD9(GST-AvBD9)融合蛋白免疫新西兰大白兔,制备抗AvBD9血清,并检测抗体效价。结果表明,经间接酶联免疫分析(ELISA)及蛋白质免疫印迹(Western blot)方法证实,获得的融合蛋白免疫新西兰大白兔得到了特异性的多克隆抗体,抗体效价为1∶38 400。     

鸡源 Bursin-ScFv 噬菌体展示文库的构建及初步筛选

本研究利用抗三肽囊素(Bursin)单克隆抗体免疫SPF来航鸡,获得产生抗独特型抗体的脾细胞,从中提取总RNA,经反转录合成cDNA第一链.以cDNA第一链为模板,根据来航鸡 IgG 抗体重链(VH)、轻链(VL)可变区基因FR设计引物,进行PCR扩增.在体外扩增出该抗体的可变区VH和VL基因(大小分别约为370和320 bp).通过重叠延伸反应(SOE),以(Gly4Ser)3为连接肽,将VH和VL基因连接成为VH-Linker-VL ScFv,将ScFv DNA与噬菌粒载体pHEN1的连接产物转化于大肠杆菌TG1,经辅助噬菌体M13K07感染后,获得重组的鸡源抗三肽囊素独特型抗体全套单链噬菌体抗体库.并测得该库容量约为5×105,噬菌体中ScFv基因的插入率为80%,用辅助噬菌体援救后,得到滴度为1011PFU/mL的初级噬菌体抗体库.用抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)进行4轮"吸附-洗脱-扩增"的淘筛,出现特异性富集.经ELISA、动物试验表明所筛选的5个阳性克隆可与抗Bursin单克隆抗体(2F9-4/HU2)特异性结合,并能促进抗体的生产.     

MD病毒抗独特型抗体的研制

制备鸡马立克氏病病毒(MDV)抗独特型抗体(Ab2),探讨Ab2模拟抗原诱导免疫应答的能力.用MDV免疫SPF鸡,分离提纯鸡抗MD-IgG(Ab1),Ab1免疫BALB/C鼠,用鼠脾细胞与SP2/0细胞制备Ab2杂交瘤细胞株,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞株,经克隆、纯化2×株抗MDV独特型抗体杂交瘤细胞株(6E5,7A12),其中6E5培养上清、腹水ELISA效价分别为4000×、10000×,免疫20 d攻毒,具有抗MDV感染保护.     

卵黄抗体制备及在畜牧业中的应用

抗体是人和动物机体产生的抗感染物质，是机体在漫长演化过程中形成的对付病原菌入侵的最有效天然保护机制。卵黄抗体，是指从免疫禽蛋中提取出的针对特定抗原的抗体。当用某种抗原免疫产蛋母鸡时，母鸡经免疫应答后，可从其不断产出的鸡卵黄中得到大量均一高效的卵黄抗体IgY。卵黄抗体是特异性抗体最方便、最廉价的来源。     

抑制素与乙肝表面抗原融合基因免疫对大鼠生殖能力的影响

90只大鼠随机分为5组(n=18),分别肌肉注射10、50、100μg抑制素与乙肝表面抗原融合基因表达质粒(pCIS)、50μg空载体(pcDNA3.1)和100μL生理盐水。20 d后加强免疫1次,对每组中的12只大鼠进行2次加强免疫。结果发现抑制素抗体P/N值随着免疫次数的增加而提高。100μg剂量组2次和3次免疫的成熟卵泡发育数分别比对照组多6.9和7.5个(P<0.05)。3次免疫后大鼠成熟卵泡发育数比2次免疫后显著提高(35.2±2.73 vs 31.0±0.92,P<0.05)。抑制素基因免疫组的胎盘数和窝产仔数高于对照组(P>0.05),抗体阳性鼠高于阴性鼠(P<0.05)。pCIS 3次免疫后抗体阳性鼠的抗体水平与成熟卵泡发育数的相关系数为0.45(P>0.05),与胎盘数的相关系数为0.77(P<0.05)。pCIS免疫大鼠动情期和产后血浆FSH水平高于对照组,抗体阳性鼠的血浆FSH水平高于阴性鼠,其中2次免疫后阳性组动情期FSH浓度极显著高于阴性组(P<0.01)。这些结果表明,抑制素基因免疫大鼠可促进大鼠的卵泡发育,提高血浆FSH水平,为抑制素基因免疫大动物提供了试验依据。     

牛支原体P48蛋白卵黄抗体的制备

为了研究牛支原体P48抗原蛋白的免疫学功能及相应卵黄抗体的生物学特性,探究其抗体效价随免疫时间的变化规律,试验采用牛支原体P48蛋白疫苗免疫健康产蛋母鸡,定时采血并收集鸡蛋,用水稀释法结合硫酸铵盐析法制备特异性卵黄抗体,利用间接ELISA法检测血清抗体(IgG)和卵黄抗体(IgY)效价。结果表明,低、中、高剂量组均能诱导蛋鸡产生有效免疫应答,血清抗体效价与卵黄抗体效价的变化趋势基本一致,但卵黄抗体的产生滞后于血清抗体,在首次免疫后8~10周Ig Y效价达到峰值,其中中剂量组的免疫效价最高,最高效价为1:212。经SDS-PAGE检测,制备所得的纯度达86%以上,得率在8.6 mg/m L以上。说明采用牛支原体P48蛋白免疫蛋鸡可制备高效价、高纯度的抗牛支原体P48蛋白卵黄抗体,从而为卵黄抗体在牛支原体的检测与防控方面的研究奠定了基础。     

鸡阿黑皮素原多肽抗体的制备与鉴定

根据NCBI GenBank中报道的鸡阿黑皮素原(Pro-opiomelanocortin,POMC)一级结构信息,用TMHMM 2.0和DNA Star软件分析POMC蛋白的跨膜结构域、二级结构、疏水性、亲水性以及抗原性等,综合考虑抗体设计的其他因素,设计出1段12个氨基酸的多肽。将合成后的多肽与牛血清白蛋白(albumin from bovine serum,BSA)偶联,用与BSA偶联的POMC多肽免疫新西兰兔,3个月后获取血清,亲和纯化出抗POMC多肽抗体。通过ELISA法检测效价,Western blot和免疫组化法检测抗体特异性。通过该方法得到了高效价与高特异性的鸡POMC多肽抗体,ELISA法测定其效价可达到1∶128 000,而且该抗体可用于免疫组化,说明所制备的鸡POMC抗体具有高特异、高效价等特点,将为鸡POMC基因的功能研究提供有用的研究材料。     

非洲猪瘟病毒p54抗原C端的原核表达及多克隆抗体的制备与鉴定

利用大肠埃希菌表达非洲猪瘟病毒核心抗原p54蛋白C末端55个氨基酸的肽段(命名为p54-2),制备了多克隆抗体并进行了纯化,以进一步用于非洲猪瘟ELISA试剂盒的研发。将PCR扩增获得的p54-2目的片段与表达载体pGEX6p-1质粒均经过限制性内切BamHⅠ和XhoⅠ双酶切后,构建pGEX6p-1-ASFV-P54-2原核表达质粒。将该质粒转化到大肠埃希菌BL21中,诱导蛋白大量表达,并纯化获得高纯度的蛋白。将纯化的p54-2蛋白免疫小鼠,获得p54-2多克隆抗体并进一步纯化多抗。用ELISA、Westernblot对纯化的多克隆抗体进行效价滴定及特异性鉴定。结果显示,成功构建了pGEX6p-1-ASFV-P54-2重组质粒,在大肠埃希菌中IPTG诱导下,能够高效表达重组p54-2蛋白。用p54-2蛋白免疫Balb/c小鼠获得的多克隆抗体经ELISA检测其抗体效价为1∶128000,说明该蛋白有很好的免疫原性。Westernblot结果显示,制备的多克隆抗体能特异性识别非洲猪瘟病毒p54胞内区,具有较高反应性和特异性,可以用于ELISA检测方法研究和p54抗原表位的鉴定。