NtMYC1a转录因子的克隆与功能初步分析

从烟草根系中克隆NtMYC1a基因,构建表达载体并在烟草中瞬时表达,探讨了NtMYC1a转录因子在烟碱生物合成中的作用。转基因烟草中的NtMYC1a表达显著升高,表明成功构建了NtMYC1a表达载体并转化了烟草;转基因烟草中的PMT表达量显著升高,表明NtMYC1a能够正调控烟碱的合成;茉莉酸与干旱处理烟草后,检测到NtMYC1a和PMT的表达量显著升高,表明在茉莉酸、干旱促进烟碱合成的生物学过程中,NtMYC1a具有正调控的功能。     

转录因子NtMYC2 b参与烟草烟碱含量杂种优势形成的机制研究

为探讨bHLH转录因子家族成员MYC2b基因与烟叶中烟碱含量及烟碱含量杂种优势表现的相关性,利用RT-qPCR分析NtMYC2b基因与烟碱合成途径关键酶基因的表达,测定烟碱含量和烟碱杂种优势表现。结果表明,移栽后80 d,NtMYC2b在烟草亲本GDH88和巴斯玛根部的表达量较移栽后66 d上调,其根和叶中烟碱含量增加,杂交种根中NtMYC2b、鸟氨酸脱羧酶基因(ODC)、精氨酸脱羧酶基因(ADC)、N-甲基转移酶基因(PMT)、N-甲基腐胺氧化酶基因(MPO)的表达量相对于亲本平均表达量均明显上调,且除MPO外,NtMYC2b与ODC、ADC、PMT、QPT(喹啉酸磷酸核糖转移酶基因)在强优势组合VA116×巴斯玛中的相对表达量均明显高于弱优势组合VA116×GDH88,根和叶中烟碱含量及其杂种优势表现也具有相同的趋势,表明NtMYC2b参与了烟碱的合成,还可能参与了烟碱含量杂种优势的形成。相关性分析表明,在亲本根部,NtMYC2b表达量与PMT表达量呈显著正相关;在杂交种根部,NtMYC2b表达量与ADC、MPO表达量呈显著正相关;在杂交种叶片中,NtMYC2b表达量与烟碱含量杂种优势呈显著正相关,PMT表达量与ODC、ADC表达量均呈显著正相关。关键酶基因启动子序列分析表明,ADC中含有1个MYC结合位点和1个G-box元件;PMT中含有7个MYC结合位点和1个G-box元件。推测NtMYC2b可能通过与ADC、PMT的顺式元件MYC结合位点或G-box元件特异性结合调控ADC、PMT的表达,进而促进烟碱的合成,且NtMYC2b还参与了烟碱含量杂种优势的形成。     

烟草NtNAC-R1基因内含子鉴定与瞬时表达分析

克隆烟草NtNAC-R1基因,并进行瞬时表达分析,探讨其是否含有内含子及其在烟碱生物合成中的调控作用.以烟草基因组DNA为模板克隆得到NAC转录因子NtNAC-R1,鉴定结果表明,该基因含有2个内含子.通过构建真核表达载体,建立瞬时表达分析体系,RT-PCR检测结果显示NtNAC-R1基因过表达,烟碱生物合成关键基因PMT表达量升高,JA信号途径标记基因PDF1.2和IAA响应基因IAA13表达量降低.瞬时表达分析表明,该基因受JA信号和IAA信号途径的交互对话影响,进而调控烟碱的生物合成.     

钾营养调控烟草烟碱生物合成关键基因研究

为明确钾营养供应对烟碱生物合成的影响规律,采用定量PCR和气相色谱-质谱联用法,研究不同供钾量条件下,烟草叶片烟碱含量和根系腐胺N-甲基转移酶(PMT)与喹啉酸磷酸核糖基转移酶(QPT)的表达情况。结果表明,低钾供应会增加烟叶的烟碱含量、促进根系PMT基因的表达;高钾供应对烟叶的烟碱合成和根系的PMT基因表达具有明显的抑制效应。低钾处理后再恢复正常钾供应水平,可显著降低由低钾供应对烟碱合成和PMT基因表达的促进作用。不同的供钾水平同样影响QPT基因的表达水平,但与烟碱积累量的变化不存在明显的相关性。因此,烟草植株的烟碱含量受供钾水平的影响,钾可能通过控制根系腐胺N-甲基转移酶基因的表达来影响烟叶中烟碱的积累。     

烟草PR3b转录后剪切元件NRSE1与GUS融合表达后的可变剪切

【目的】烟草(Nicotiana tabacum L.)碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体(nic1和nic2)中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚。将PR3b的可变剪切元件NRSE1(nicotinesynthesis related splicing element 1)与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制。【方法】利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体。将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯(ET)和茉莉酸(JA)处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响。【结果】通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平。【结论】PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用。     

烟草转录因子NtMYC2对激素及 非生物因素胁迫的响应

为探究烟草转录因子NtMYC2对逆境胁迫的响应,以烟草幼苗为试验材料,用50μmol·L~(-1) MeJA,100μmol·L~(-1) ABA,200 mmol·L~(-1) NaCl,20%PEG6000,4℃和黑暗条件下分别进行激素诱导、高盐、模拟干旱、低温和暗胁迫处理,并取处理1,3,6,12,24和48 h时的烟草叶片提取RNA,反转录为cDNA后利用qRT-PCR技术分析NtMYC2的表达情况。结果表明,NtMYC2的表达受MeJA、ABA、干旱、高盐、低温和黑暗胁迫的诱导,且表达模式随激素和胁迫处理的不同而不同。NtMYC2的表达量随MeJA处理时间的延长呈先下降后上升的趋势,随ABA和黑暗处理时间的延长呈逐渐上升的趋势,都在48 h时达最高表达水平,但ABA诱导的表达水平最高,是对照的17.31倍。盐胁迫1h时,NtMYC2的表达量是对照的3.95倍,随后下降,6 h后与对照相当。低温诱导NtMYC2表达上调,在处理6h时表达量最高,48h时最低(与对照无明显差异);模拟干旱胁迫48 h可显著提高NtMYC2的表达水平。此外,利用PlantCARE软件分析NtMYC2启动子区域,结果显示启动子区域包含有脱落酸、生长素、低温、干旱、光等多种非生物胁迫相关顺式作用元件。     

3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因的克隆与分析

【目的】克隆3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因,分析其在不同条件下的表达特性;构建植物表达载体并转化烟草,对转基因烟草的耐盐性进行初步鉴定。【方法】根据已获得的cDNA序列设计引物,扩增MsERF5、MsERF8和MsERF11的DNA序列,并分析基因结构;利用半定量RT-PCR技术分析其组织表达特异性和胁迫条件下的表达特性;通过农杆菌介导的方法转化烟草,鉴定盐胁迫条件下转基因烟草的表型和生理生化特性,初步验证其功能。【结果】MsERF5、MsERF8和MsERF11都不包含内含子。MsERF5在根、叶和花蕾中的表达量高于茎和花;MsERF8在根和叶中的表达量高于茎、花蕾和花;MsERF11在叶中的表达量最高;3个基因都能被多种非生物胁迫（盐、干旱、铝）和激素（脱落酸、赤霉素、乙烯利、水杨酸和茉莉酸甲酯）诱导,但表达模式不同。在盐浓度为200 mmol•L-1的筛选培养基上只有导入目的基因的愈伤组织能产生不定芽,250 mmol•L-1 NaCl处理再生植株10 d,转基因植株和野生型植株叶片的电导率和可溶性糖含量均呈现上升趋势,但野生型植株叶片的电导率显著高于转基因植株,可溶性糖含量则显著低于转基因植株（P＜0.05）;转基因植株和野生型植株叶片的叶绿素含量均呈现下降趋势,野生型植株叶片叶绿素含量显著低于转基因植株（P＜0.05）;盐胁迫条件下,转化不同基因的再生植株的电导率、叶绿素和可溶性糖含量没有显著差异（P＞0.05）。【结论】3个紫花苜蓿乙烯应答因子基因都不包含内含子,其表达具有组织特异性,都能被多种非生物胁迫和激素诱导,能够使烟草愈伤组织在含盐培养基上形成不定芽并最终产生转基因植株,且转基因植株的耐盐性高于野生型植株。     

一个烟草葡糖基转移酶基因启动子的克隆与诱导表达

利用笔者所在的实验室从烟草中克隆的一个葡糖基转移酶基因(GT-like),通过PCR扩增得到该基因开放阅读框5′端-1150~0上游调控区。序列分析表明该启动子序列含有多个基因表达调控元件。将GT-like基因启动子与gus报告基因连接,构建植物表达载体pGT-gus,经根癌农杆菌介导法转化W38型烟草。转基因烟草植株GUS组织化学染色结果表明:该基因上游-1150~0序列具有启动子活性,能启动gus基因在烟草叶片中表达,而在根中的表达受时间和环境影响。GUS诱导活性的定量分析结果表明,该启动子的表达不但受甲基茉莉酸的强烈诱导,而且也受水杨酸的强烈诱导。对这一启动子的诱导表达机理的分析将有助于进一步研究甲基茉莉酸和水杨酸之间拮抗作用的相互关系。     

大豆促苗期根系发育相关基因Gmr937在烟草中的功能分析

将构建好的植物过表达载体pCAMBIA3301-Gmr937和RNAi表达载体pCAMBIA3301-Gmr937-RNAi,通过农杆菌介导的叶盘法将植物表达载体转入烟草。经PCR检测得到T_1代过表达载体阳性植株13株,RNAi表达阳性植株11株。对阳性植株进行荧光定量PCR,测定目的基因的表达量。结果表明:正常条件下,Gmr937基因在转化烟草根、叶片中表达量较高,在茎中表达量较低;转干扰表达植株目的基因在根、叶片中表达量是对照0.8倍,在茎中的表达量是对照的0.85倍。干旱条件下,转Gmr937超表达载体烟草在叶片中表达量是对照组的14倍,在根中表达量是对照组的12倍;转Gmr937-RNAi载体在根、茎中表达量是对照组的0.8倍,在叶片中表达量是对照组的0.7倍。以CaMV35s启动子为探针进行Southern杂交检测,在适宜条件下,转化的目的基因以单拷贝整合到受体烟草基因组中。测量适宜条件下培育的转基因烟草侧根总长的结果表明,超表达转基因植株和RNAi干扰转基因植株的侧根平均总长均比干旱条件下长,且不同条件下超表达侧根总长都比对照长,说明Gmr937基因对烟草侧根的发育有促进作用。对干旱处理7 d后的转基因烟草的抗旱生理生化指标进行测定,结果表明Gmr937基因在烟草中超表达并提高了烟草植株的耐旱性。     

烟草PR3b转录后剪切元件NRSE1与GUS融合表达后的可变剪切

【目的】烟草（Nicotiana tabacum L.）碱性几丁质酶基因PR3b在低烟碱突变体（nic1和nic2）中存在转录后mRNA可变剪切现象,但其可变剪切的发生机制仍不清楚。将PR3b的可变剪切元件NRSE1（nicotine- synthesis related splicing element 1）与GUS融合表达,分析NRSE1元件的独立可变剪切特性,以揭示其作用机制。【方法】利用PCR扩增方法获得PR3b cDNA序列中的NRSE1元件片段,并利用基因重组技术构建了烟草PR3b可变剪切元件NRSE1与GUS的融合表达载体。将融合表达载体导入农杆菌LBA4404后,通过农杆菌介导的叶盘转化法培育了表达NRSE1与GUS融合子的低烟碱突变体nic1和nic2及野生型烟草转基因植株;通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出阳性植株后,利用RT-PCR分析NRSE1与GUS融合表达后在低烟碱突变体和野生型烟草中的可变剪切特性;对转基因植株的幼苗进行乙烯（ET）和茉莉酸（JA）处理,通过GUS染色方法分析ET和JA处理对转基因植株中GUS活性的影响,并通过RT-PCR方法分析ET和JA处理对转基因植株中NRSE1与GUS融合子的可变剪切特性影响,以及对转基因植株中NRSE1与GUS融合子表达水平的影响。【结果】通过RT-PCR检测及GUS染色鉴定出表达NRSE1元件与GUS融合子的低烟碱突变体和野生型烟草转基因植株;RT-PCR检测及测序分析证明,NRSE1元件与GUS融合表达后仍能在低烟碱突变体发生高水平的可变剪切,剪切修饰区段的序列变化与烟草中PR3b的mRNA可变剪切修饰一致;利用ET和JA处理转基因植株进行的GUS染色表明,ET和JA处理对转基因植株的GUS活性有不同程度的影响;但利用ET和JA处理转基因植株进行的RT-PCR分析表明,ET和JA处理不改变NRSE1元件原有的诱导剪切特性,也不影响转基因植株中NRSE1元件与GUS融合子的表达水平。【结论】PR3b的可变剪切元件NRSE1与GUS在烟草中融合表达后,仍能在低烟碱突变体nic1和nic2中发生高水平的可变剪切;NRSE1在烟草中的可变剪切不依赖PR3b的其他mRNA区段,是烟草PR3b发生可变剪切的独立元件;ET和JA处理对NRSE1元件与GUS融合表达植株的GUS活性具有一定影响,可能存在翻译水平的调控作用。