牛冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

针对牛冠状病毒(BCoV)N基因保守序列设计合成了1对特异性引物,以体外转录法制备的cDNA标准品为模板,建立了检测BCoV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。在1个反应体系中模板最低检测限为7.8 copies/μL,比普通RT-PCR更加灵敏;与牛主要消化道和呼吸道病毒病病原均无交叉反应;批内、批间重复变异系数均低于1.5%;应用定量PCR检测了39份疑似临床病料,阳性检出率为51.28%(20/39),普通RT-PCR为41.03%(16/39)。结果表明,该方法特异性强、稳定性好、准确率高,本方法将为BCoV的临床诊断和流行病学调查提供技术保障。     

猪流感病毒SYBR GreenⅠ定量RT-PCR检测方法的建立及应用

为研究猪流感病毒(SIV)感染后SIV在体内的分布规律,本研究设计针对SIV NP基因保守区引物,建立了SIV SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。该方法对SIV核酸检测灵敏度为30TCID50,对健康猪肺组织cDNA、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)核酸呈阴性反应。采用建立的荧光定量RT-PCR方法对人工感染A/swine/Shanghai/1/2007/H1N2(Sw/SH/1/2007)猪进行检测,结果显示:病毒在猪鼻腔粘膜持续存在至感染后第8d;肛门拭子在感染后2d～8d可持续检测到病毒核酸;喉头、气管在感染后第3d可检到病毒核酸,并持续至第10d;肺部淋巴结、脾脏在感染后5d～7d检测到病毒核酸阳性;其它脏器均未检测到病毒核酸,从而确定呼吸道系统及脾脏是SIV定殖的主要场所,SIV感染猪后向外排毒周期约为1周。     

火鸡疱疹病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

针对火鸡疱疹病毒(HVT)特异性的sorf1区基因序列设计引物,建立检测HVT的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法,并对其特异性、敏感性和重复性进行检测。结果表明,建立的实时荧光定量PCR方法标准曲线的循环阈值(Ct)与模板拷贝数呈良好线性关系(r2=0.99),熔解曲线分析显示该PCR扩增具有良好的特异性、敏感性和重复性,试验表明该方法最低检测浓度为7×101拷贝/μL。利用该方法对野生型HVT和rHVT-pmpD-N在体内和体外的复制特性进行检测,结果表明重组后的HVT与野生型HVT的增殖速度基本一致。本试验建立的检测方法能够快速检测HVT,准确率高,特异性好,具有较高的灵敏度和稳定性,为监测HVT体内和体外的病毒含量和复制情况提供了一种有效的手段。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测猪流行性腹泻病毒方法的建立及应用

根据GenBank登录的猪流行性腹泻病毒株FJ473395的M基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出182 bp的片段。产物经回收与pMD18-T Vector连接后转化到基因工程菌DH5α中,提取重组质粒,经PCR及测序鉴定后,作为阳性模板建立SYBR GreenⅠ荧光定量PCR标准曲线,并做敏感性试验、特异性试验和重复性试验。结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度呈良好的线性关系,产物Tm在85～85.5℃之间,灵敏度为5.875拷贝/μL,特异性和重复性较好。本试验建立了检测PEDV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,为该病的早期诊断,并定量分析PEDV感染程度奠定了基础。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测PRRSV方法的建立

根据编码PRRSV M蛋白的基因序列设计用于SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR扩增的引物,通过温度梯度法优化反应体系;以不同科属常见猪致病性RNA病毒疫苗验证该检测方法的特异性,参考国内PRRSV分子流行病学特征,选择基因型代表性的2株疫苗株验证该检测方法的稳定性;以10倍梯度稀释的质粒为标准品扩增并构建标准曲线,探究该检测方法的灵敏度,随机挑取10份保存的PRRSV阳性病料和10份阴性病料同时使用农业部推荐的PRRSV RT-PCR检疫标准方法和建立的方法进行检测,以确定2种方法检测的符合率。结果显示,使用建立的方法可以在54.4℃80min内完成对PRRSV的检测,该检测方法具有特异性和稳定性;检测灵敏度为6.8×10拷贝/μL;以Ct值为横坐标,扩增序列拷贝浓度的对数值为纵坐标,得到标准曲线,方程为y=-3.411 x+39.002,R2=0.999;对随机挑取的10份PRRSV阳性病料和10份阴性病料进行检测,结果2种方法检测结果的符合率100%。结果表明,成功建立了PRRSV SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR快速检测方法,为临床提供了一种很好的检测手段。     

牛传染性鼻气管炎gE基因TaqMan-MGB与SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的荧光定量检测方法,本研究根据IBRV gE基因的序列设计了相应的探针和引物,分别建立TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法,并对2种方法进行了综合比较。结果显示,TaqMan-MGB探针和SYBR GreenⅠ定量荧光PCR方法的灵敏度分别达到1.0×10¹ copies/μL和1.0×10² copies/μL;2种荧光定量方法对除IBRV的其他牛病毒和细菌检测结果均为阴性;重复性检测中变异系数均小于2.3%;检测了130份来自西藏的牦牛样品,2种荧光定量PCR阳性检出率均为100%。以上结果表明,2种荧光定量方法都可用于检测IBRV,且TaqMan-MGB荧光定量PCR敏感性高于SYBR GreenⅠ荧光定量PCR。     

猪传染性胃肠炎病毒SYBR GreenⅠ模式实时定量RT-PCR检测方法的建立及初步应用

登录GenBank下载猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的N基因序列,依据保守区设计一对特异性引物,采用SYBR GreenⅠ随机结合渗入法,建立检测猪传染性胃肠炎病毒的实时定量RT—PCR检测方法,成功构建了检测TGEV的标准DNA模板,循环阈值（Ct）与标准DNA模板在1．0×10-1．0×10^7拷贝／μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0．9985。该方法用于检测TGEV具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪传染性胃肠炎病毒的快速检测。用建立的检测方法对82份临床样品进行了检测,和普通PCR检测结果100％相符。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×10⁴～5.474×10⁹拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R²=0.999 3。该方法最低检测限为5.747×10²拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R²=0.985 4。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。     

猪德尔塔冠状病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种猪德尔塔病毒(PDCoV)的快速检测方法,本研究根据NCBI公布的PDCoV序列设计了1对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增PDCoV的S基因,将其连接至pMD 19-T载体上,以构建正确的重组质粒作为标准品,建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的敏感性、特异性及重复性进行了验...     

猪细小病毒SYBR Green Ⅰ模式实时定量PCR检测方法的建立

根据GenBank猪细小病毒(PPV)的NS1基因序列,设计一对特异性引物,采用SYBR Green Ⅰ随机结合渗入法,建立实时定量PCR检测方法,构建了检测PPV的标准DNA模版,循环阈值(Ct)与标准质粒DNA模板在7.8×101～7.8×108拷贝/μl浓度范围内呈良好的线性关系,相关系数为0.997。该方法用于猪细小病毒的检测具有很高的特异性,其敏感性与常规PCR相比可以提高100倍,可以用于猪细小病毒的快速检测。     

鸡IL-2 mRNA SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用

根据GenBank提供的ChIL-2参考序列设计了特异性引物,并以鸡3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,以二者标准质粒为模板,应用SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR技术,并采用双标准曲线相对定量方法建立了ChIL-2 mRNA荧光定量RT-PCR检测方法.结果显示,该方法该可以在3h左右对低拷贝量的模板(200 copy/μL)进行检测,同时该检测方法具有很好的特异性和重复性.雏鸡免疫试验IL-2 mRNA检测结果显示,该方法可有效应用于鸡体内IL-2在核酸水平的检测,并为今后IL-2相对定量的检测研究提供参考依据.     

应用SYBR Green I实时荧光定量PCR检测Ⅱ型猪圆环病毒

Ⅱ型猪圆环病毒（porcine circovirus type2，PCV-2）为近年来引起多种综合征的重要病原，且经常与猪呼吸与繁殖障碍综合症、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪流感病毒发生混合感染。建立对于该病毒的快速检测及准确定量的方法，无疑对于病原诊断及病因学研究具有重要的意义。实时荧光定量PCR具有敏感性高、重复性好、速度快、操作简便和污染少等优点。     

SYBR Green Ⅰ实时定量PCR方法检测猪细小病毒

为建立特异敏感的猪细小病毒(PPV)的SYBR Green I实时定量PCR检测方法,本研究根据GenBank上PPV NS1保守序列设计合成了1对引物,利用本实验室构建的重组质粒(pMD18-T-PPV NS1)为标准模板,对反应条件进行优化,绘制标准曲线,并进行熔解曲线分析,建立了PPV的SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法.分别进行了特异性、敏感性及重复性检验,结果表明,本方法具有良好的特异性,与PRRSV、CSFV、PRV、PCV-2、SIV及阴性对照均为阴性;其最低检出量为7copies/μL,比PCR敏感100倍,且批内和批间重复性良好.用该方法对15份临床病料进行检测,并与常规PCR、环介导等温扩增(LAMP)方法进行对比,显示该方法灵敏度高、成本低,能够对样品组织中病毒进行定量检测,为快速检测PPV提供了有效的技术手段.     

SYBR Green Ⅰ荧光定量RT-PCR检测犬瘟热病毒方法的建立及应用

根据GenBank发表的犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(NP)基因序列,设计合成一对引物,建立了基于SYBR Green Ⅰ Real-time RT-PCR检测CDV核酸.以含有83 bp扩增产物的pGM-T载体质粒为参考,构建了标准曲线.对该方法的特异性、敏感性、可重复性进行了评价,与常规RT-PCR及胶体金免疫检测技术(GIA)进行了敏感性比较.结果表明,该方法能特异性检测到CDV的扩增信号;检测范围在5.2×102～5.2×108拷贝之间有良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为96.80%;敏感度高,最低检测限为52拷贝,比常规RT-PCR高103倍,比GIA高105倍;组内变异系数为0.51%～1.90%,组间变异系数为1.96%～2.63%.用建立的Real-time RT-PCR检测11例临床病例.CDV阳性率为100%.对犬瘟热弱毒活疫苗中的CDV进行定量,其含量在1.24 X105～4.88 X 105拷贝/头份之间.该方法的建立为CDV的早期快速诊断、分子流行病学调查及疫苗质量监测等提供了一种新的快速定量检测手段.     

牛Th1/Th2型细胞因子实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立及应用

根据GenBank中牛Th1/Th2(BoTNF-α、BoIFN-γ、BoIL-2、BoIL-4、BoIL-6、BoIL-8、BoIL-10)型细胞因子的基因序列,在保守区设计并合成各自特异引物,并以牛3-磷酸甘油脱氢酶(GAPDH)基因为内参,采用SYBR GreenⅠ染料以建立实时荧光定量PCR检测方法。将Th1/Th2型细胞因子基因克隆至pMD18-T载体上,转化大肠杆菌DH5α,经PCR及测序鉴定后得到阳性重组质粒,作为标准品模板建立SYBR-GreenⅠ荧光定量RT-PCR标准曲线和溶解曲线,并做灵敏性、特异性和重复性试验。对建立的Th1/Th2型细胞因子SYBR-GreenⅠ实时荧光定量RT-PCR方法进行分析,结果表明牛IFN-α、IFN-β、IFN-γ和GAPDH基因的Ct值与标准品稀释度在1×101～1×108 copies/μL范围分别呈良好的线性关系,相关系数均大于0.991。溶解曲线分析表明产物为特异的单峰,具有较高的灵敏性和特异性,重复性较好。建立了检测Th1/Th2型细胞因子的实时荧光定量RT-PCR方法,为在mR-NA水平对牛Th1/Th2型细胞因子的定量分析奠定了基础。     

牛精液中基因I型牛病毒性腹泻病毒荧光探针定量RT-PCR检测方法的建立

为建立牛精液中基因I型牛病毒性腹泻病毒(BVDV-1)的快速检测方法,本研究采用Sephycral S-400凝胶对牛精液过滤处理后提取病毒核酸,根据BVDV-1 5'UTR保守区基因序列,设计特异性引物和荧光探针,通过反应条件的优化,建立了牛精液中BVDV-1荧光定量RT-PCR检测方法.该方法可以检测到牛精液中含量为0.0125 TCID50的病毒,灵敏度比病毒分离方法高200倍～2000倍,比常规RT-PCR方法高10倍.对从同一个牛场6个月内采集的120份新鲜牛精液和40份冷冻牛精液用该荧光RT-PCR方法检测,没有检测到BVDV-1阳性样品.对其中的10头牛定期检测精液中病毒的同时,并同步检测了全血中的病毒和血清抗体,结果血清抗体阳性牛精液中没有检测到病毒,本研究结果表明,不能以血清抗体阴阳性做为精液是否带毒的依据.     

牛肠道病毒TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立快速、准确地检测牛肠道病毒(BEV)及对北京周边地区牛群中BEV感染情况进行检测,本研究通过设计合成扩增BEV 5＇UTR序列的引物及探针建立了检测BEV的通用型TaqMan荧光定量RT-PCR快速检测方法并对反应条件进行了优化.该方法对BEV的最小检测量为0.1 TCID50/0.1mL,敏感性比病毒分离法高10倍.而且该方法对其他牛相关病毒均无交叉反应.用3批试剂对3个稀释度的BEV培养物进行批内和批间重复性试验,其变异系数均小于1.1％,表明该方法具有良好的重复性.采用该方法对北京周边地区牛群采集的852份临床样品进行检测,并与病毒分离方法比较,两种方法检测结果完全一致.因此,本研究所建立的BEVTaqMan RT-PCR检测方法具有快速、准确、特异性强、敏感性高、重复性好的优点,为国内BEV的检测提供了有力的技术支持.本研究首次通过病毒核酸检测证明了我国部分地区的牛群中存在BEV感染.     

鸭呼肠孤病毒TaqMan与SYBR Green荧光定量检测方法的建立及比较

本研究旨在针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)建立两种快速、敏感、特异的荧光定量PCR诊断方法并对其临床实用性进行比较。试验根据呼肠孤病毒S1基因序列设计合成1对特异性引物和1条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR GreenⅠ两种荧光定量PCR检测方法,并对两种方法的特异性、灵敏性、重复性进行比较。结果显示,两种检测方法标准曲线的相关系数均为0.999,对鸭细小病毒(DPV)、A型鸭甲肝病毒(DHV-1)、C型鸭甲肝病毒(DHV-3)、鸭传染性支气管炎(IBV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鹅星状病毒(JSHV)的检测结果均为阴性,特异性良好。SYBR GreenⅠ法的最低检测限度为10⁰拷贝/μL,TaqMan法的最低检测限度为10¹拷贝/μL,前者的灵敏度比后者高10倍。SYBR GreenⅠ法和TaqMan法重复性试验的组内和组间变异系数均分别小于2.1%和1.8%。利用这两种方法对临床30份疑似病料进行检测,其中TaqMan法检出29份,SYBR GreenⅠ法检出30份,符合率为97%。综上,两种荧光定量方法均可用于临床NDRV...     

Development of a real-time SYBR Green PCR assay for the rapid detection of Dermatophilus congolensis

Methods such as real time (RT)-PCR have not been developed for the rapid detection and diagnosis of Dermatophilus (D.) congolensis infection. In the present study, a D. congolensis-specific SYBR Green RT-PCR assay was evaluated. The detection limit of the RT-PCR assay was 1 pg of DNA per PCR reaction. No cross-reaction with nucleic acids extracted from Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis, Staphylococcus aureus, or Austwickia chelonae was observed. Finally, the RT-PCR assay was used to evaluate clinical samples collected from naturally infected animals with D. congolensis. The results showed that this assay is a fast and reliable method for diagnosing dermatophilosis.     

牛呼吸道合胞体病毒RT-PCR检测方法的建立及初步应用

本研究旨在评估日粮补充以枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌组成的复合益生菌对育肥猪生长性能、小肠绒毛形态及肝脏脂代谢相关指标的影响。试验将208头体重接近的18周龄三元育肥猪随机分为2组,每组4个重复,每个重复26头。对照组育肥猪饲喂基础日粮,处理组育肥猪饲喂基础日粮+1.5 g/kg由乳酸菌、枯草芽孢杆菌和酵母菌组成的复合益生菌,饲养试验时间为8周。结果：处理组试验28 d育肥猪体重、1～28 d和1～56 d平均日增重较对照组显著提高2.28%、10.33%和4.56%（P＜0.05）,但1～28 d和1～56 d料重比显著降低11.15%和5.72%（P＜0.05）。处理组空肠绒毛高度、绒毛高度与隐窝深度比值较对照组分别显著提高5.45%和17.52%（P＜0.05）,而隐窝深度显著降低10.27%（P＜0.05）,对照组与处理组育肥猪血清低密度脂蛋白和高密度脂蛋白浓度及肝脏胆固醇、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白浓度无显著差异（P＞0.05）,但处理组育肥猪血清甘油三酯和胆固醇浓度及肝脏甘油三酯浓度显著低于对照组（P＜0.05）。结论：在本研究条件下,日粮添加1.5 g/kg以枯草芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌组成的复合益生菌可通过改善空肠绒毛形态,提高育肥猪生长前期和全期的平均日增重和饲料效率,降低肝脏和血清胆固醇浓度。 [关键词]益生菌|育肥猪|生长性能|绒毛形态|脂代谢