农杆菌介导的玉米遗传转化研究进展

农杆菌介导的转基因法是目前玉米遗传转化的主流方法之一。目前,模式玉米种质幼胚的转化体系已程式化,且开发了新筛选基因和获得不含筛选基因转基因玉米的方法,但是大多数育种骨干自交系转化频率低和转化受体基本上是幼胚。从农杆菌、受体及培养条件多方面各种因素对问题进行分析,多数研究认为针对特定基因型和受体材料建立好的受体再生系统,结合高效率农杆菌转化体系,获得多目的基因聚合（无其它外源片段）的转基因玉米将是农杆菌介导玉米转化体系研究的最终目标。本文主要从农杆菌介导（转基因）法应用于玉米遗传转化的历史、现状、问题等方面进行综述,为同领域的研究者提供一定的参考。     

甘蓝型油菜抗病虫双价基因转化体系的建立

以甘蓝型油菜（Brassica napus L.）品种浙双758子叶柄外植体为受体,建立农杆菌介导转化体系,研究乙酰丁香酮、羧苄青霉素浓度和潮霉素筛选浓度等对农杆菌遗传转化效果的影响。结果发现,羧苄青霉素对农杆菌的抑制效果以500mg/L最佳,且对子叶柄外植体愈伤组织诱导和分化的影响最小,愈伤组织诱导率和芽再生率分别为75.2%和65.1%。5.0mg/L的潮霉素能完全抑制未转化再生植株的生长,使其最终褐化死亡,在此潮霉素筛选浓度下,获得了32株转化再生植株。共培养时培养基中添加100μmol/L AS的芽再生率为3.9%,显著高于未添加AS的芽再生率（2.0%）,说明共培养阶段添加酚类物质乙酰丁香酮有利于转化载体T-DNA的转化。部分转化再生植株经PCR和Southern杂交检测呈阳性,病虫害接种试验表明转化植株对菌核病和小菜蛾有较好的抗性。     

CHI-PAT双价基因遗传转化贵州禾来拢

以贵州禾来拢幼胚为转化受体,用农杆菌介导法将几丁质酶和抗除草剂抗性双价基因（CHI-PAT）导入来拢幼胚,筛选出抗性愈伤组织并获得抗性植株.抗性植株经GUS组织化学及PCR检测呈阳性,转基因植株对50 mg/L的Basta溶液有抗性.初步证明CHI和PAT基因已整合进了水稻基因组中.     

农杆菌介导春小麦遗传转化体系的优化研究

采用携带GUS基因双元表达载体p1301-Pubi-Ecppc的根癌农杆菌菌株C58c1、LBA4404和EHA105对4个春小麦品种的幼胚愈伤组织进行了遗传转化。结果表明,3M1.5为最佳诱导培养基;扬麦158和扬麦10是用于小麦遗传转化的良好基因型。对农杆菌转化条件进行进一步优化,得出用农杆菌C58c1侵染预培养15d的扬麦158幼胚愈伤组织,当侵染液浓度为OD6000.8、侵染40min、共培养3d时,可以提高农杆菌介导小麦遗传转化的筛选频率和PCR阳性率。对所得到的具有hyg抗性的愈伤和抗性植株进行GUS基因化学组织检测和PCR分子鉴定,初步证明Ecppc基因已整合到小麦再生植株基因组中。本研究初步建立了农杆菌介导小麦的遗传转化体系。     

根癌家杆菌介导的玉米遗传转化体系的建立

用根癌农杆菌菌株LBA4404（pTOK233)转化多种基因型的玉米幼胚。幼胚与农杆菌共培养3d后，检测到了GUS基因的瞬时表达。利用GUS基因的瞬时表达对农杆菌转化玉米的条件进行了优化，共培养后的幼不经含潮霉素的培养基筛选培养两个月后，获得了多种基因型的抗性愈伤组织。其中综3自交系的抗性愈伤组织分化出植株，P9－10、综3自交系R0结实得到后代。Southern杂交分析证实了霉素基因在玉米自交系P9－10基因组中的整合，建立了农杆菌介导的玉米遗传转化体系。     

小麦不同品种外植体的农杆菌转化方法的研究

本实验在小麦中对农杆菌介导的大麦黄矮病病毒CP基因进行了转化，选择生产用小麦品种（系），对影响小麦组织条件和转化的主要因素进行研究，并获得了小麦转基因植株，研究表明，增加肌醇浓度有利于小麦愈伤组织的分化，而添加ABA却只对部分品种有效；采用幼胚和幼胚愈伤组织均能获得转基因植株；以茎尖和花药愈伤组织为受体未能获得阳性植株；小麦不同品种对不同农杆菌菌株的反应不同。     

甘蔗根癌农杆菌介导遗传转化研究

以根癌农杆菌（Agrobactrium tumefaciens)EHA105菌株介导将海藻糖合酶基因（TSase)遗传转化甘蔗（Saccharum officinarum)胚性愈伤组织，对转化材料进行连续的PPT抗性筛选。获得93株抗性植株。对部分植株的总DNA作PCR及Dot-Southern检测。结果3株呈阳性，而对照均为阴性，证明外源基因已整合到甘蔗基因组中。     

农杆菌介导玉米转基因的影响因素研究

研究了农杆菌介导玉米转基因过程中涉及的外植体选择、高渗和农杆菌共培养、选择培养基筛选转化体等因素对愈伤组织生长及转化效率的影响。结果表明,同一基因型玉米自交系中有少数幼穗幼胚诱导出的愈伤组织生长速度快,转化效率高;高渗和农杆菌共培养以及除草剂筛选抑制愈伤组织的生长,致使部分转基因愈伤不能分化成苗,并提出其解决途径。     

花生转化和再生研究进展

90年代以来,随着花生遗传转化和再生技术的进步，美国已分别获得抗病和抗虫转基因花生，取得突破性进展。目前，成功的农杆菌介导遗传转化以花生幼苗嫩叶、子叶为外植体，通过卡那霉素筛选，器官发生再生转化植株；基因枪介导的遗传转化是以胚愈伤为转化材料，通过潮霉素筛选转化体胚，再生转化植株。     

农杆菌介导的花生遗传转化体系的优化

以花生胚小叶及其诱导形成的愈伤组织为转化受体,采用农杆菌介导法,通过评估外植体GUS基因瞬时表达率,优化花生遗传转化条件。结果表明,侵染液中添加表面活性剂2-氮吗啉乙烷磺酸(MES)150mg/L或烟草提取物0.5ml/30ml有利于提高胚小叶外植体GUS瞬时表达率;采用针刺法辅助农杆菌介导转化,其胚小叶外植体多点GUS瞬时表达率(29.1%)明显高于未针刺的对照(12.1%);利用愈伤组织作为转化受体,其多点GUS瞬时表达率高达70.1%。利用此优化体系进行花生遗传转化,获得的抗性苗2011年经嫁接、移栽于试验田,PCR检测获得了T0代转基因植株,2012年部分T1代植株也检测出目的条带。     

人工合成gna基因在小麦中的表达及其抗蚜虫效果研究

利用经密码子优化的、人工合成雪花莲凝集素(Galanthusnivalisagglutinin),gna基因及RbcS启动子构建了高效特异表达载体pBAC202,通过基因枪轰击小麦幼胚和幼穗,将外源gna基因导入到3个高产小麦(TriticumaestivumL.)品种中,获得42个转基因后代株系。对转基因后代植株进行了DNA点杂交、PCR及PCR-Southern验证,确认外源gna基因已成功地整合到小麦基因组中。进一步的凝集素活性检测表明,小麦叶片中表达的凝集素可使红细胞凝集,并具有正常的生物学活性。转基因植株在人工饲养条件下进行抗蚜虫(Rhopalosiphumpadi)试验,蚜口密度抑制率从19%～73%不等,部分株系抑虫效果较好。利用转基因的方式可将外源抗虫基因gna导入到小麦中,并可有效地增强小麦的抗蚜能力,为选育具抗虫特性的优质小麦提供新的途径。     

由根癌农杆菌介导将葡萄糖氧化酶基因转入水稻

摘要:将具有广谱抗病作用的葡萄糖氧化酶（glucose oxidase , GO）基因插入具有潮霉素抗性选择标记的双元载体pCAMBIA1301，新构建了水稻高效表达载体pCAG1301。将此质粒导入根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens ）菌株LBA4404后,转化粳稻(Oryza. sativa L.ssp.japonica )品种日本晴(Nipponbare)的幼胚，并由筛选出的潮霉素抗性愈伤组织分化再生植株。对所得潮霉素抗性水稻植株的Southern杂交分析表明，GO基因已整合到受体基因组。淀粉-碘化钾显色反应检测到了转基因植株产生的过氧化氢，证实GO基因表达产生的葡萄糖氧化酶已经在水稻中发挥功能。抗病性鉴定表明，所得转基因水稻对稻瘟菌(Magnaporthe grisea )具有良好的抗性。     

辐照花粉对小麦与中间偃麦草杂交及其胚胎发育的影响

用γ射线辐照中间偃麦草散粉期的穗,用其花粉授予普通小麦“J-11”和“中国春”,研究不同剂量辐照花粉对普通小麦与中间偃麦草杂交结实率、杂交种子含胚率、杂种幼胚培养和杂种幼苗获得率的影响。结果表明,5~9Gy低剂量γ射线略提高了中国春×中间偃麦草的结实率,表现出低剂量辐射的刺激效应,但对J-11×中间偃麦草却未表现出刺激效应。所有剂量的辐射对杂种幼胚均有伤害作用,杂交种子含胚率、杂种幼胚成苗率随剂量增加而下降。30Gy处理时有12.9%~14.5%的杂种幼胚发育成了植株,但该剂量应用到小麦中难以获得后代。在50~100Gy高剂量γ射线处理杂交种子胚发育不良,通过幼胚培养未能得到植株。将花粉辐照技术与幼胚拯救技术、花药培养技术有效结合,可以快速获得突变体,提高诱变育种效率。     

HSP27基因在牦牛卵母细胞和体外早期胚胎中的表达

为了探讨牦牛HSP27(heat shock proteins27, HSP27)基因在牦牛卵母细胞和早期孤雌激活胚胎中的表达情况及定位,本试验通过实时荧光定量PCR检测牦牛HSP27基因在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的相对表达量,用免疫荧光染色法检测HSP27蛋白在未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及孤雌激活不同时期胚胎中的表达与定位情况。结果显示,HSP27基因在牦牛未成熟卵母细胞和成熟卵母细胞以及体外培养孤雌激活不同时期胚胎中均可表达,其中在未成熟卵母细胞中的表达量显著高于成熟卵母细胞;在孤雌激活胚胎中,2~4细胞期表达量最高,囊胚期胚胎表达量最低,随着胚胎的发育,HSP27的表达量呈现逐渐降低的趋势;在2~4细胞期和囊胚期胚胎中的表达与其他组表达存在显著差异性,在5~8细胞期和桑椹胚中的表达无显著差异。免疫荧光染色结果表明,HSP27蛋白在牦牛卵丘细胞和卵母细胞中均有表达,在牦牛孤雌激活2~4细胞期、5~8细胞期和桑椹期胚胎中主要表达于细胞核内和细胞质中,在囊胚期主要表达于细胞核中;而HSP27蛋白的表达水平与基因表达水平基本一致。本研究为后续研究HSP27基因在牦牛生殖生理过程中的作用机制提供了参考。     

玉米未成熟胚胚性愈伤组织诱导率与内源激素含量的关系

以胚性愈伤组织诱导率高低不同的9个玉米自交系未成熟胚为外植体,用改良N6培养基诱导培养愈伤组织。酶联免疫法测定不同培养时间后未成熟胚,以及由此诱导的胚性和非胚性愈伤组织,内源脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3、GA4)和细胞分裂素(DHZRI、PA、ZR)含量。结果发现,胚性愈伤组织诱导率与未成熟胚ABA和IAA含量正相关,与胚性和非胚性愈伤组织ABA含量正相关,与胚性愈伤组织GA3含量负相关。在胚性愈伤组织开始发生之际,外植体的ABA和IAA含量出现峰值,GA3含量出现低谷。因此认为,未成熟胚高水平的ABAI、AA含量和低水平的GA3含量,有利于胚性愈伤组织的诱导。但是胚性愈伤组织的ABA含量却低于非胚性愈伤组织,且胚性愈伤组织诱导率与胚性愈伤组织IAA含量负相关。由此看来,胚性愈伤组织的诱导和保持,可能还与各种激素的协同作用有关。     

玉米幼胚和成熟胚愈伤组织诱导过程中内源激素的比较

以玉米自交系87-1的幼胚和成熟胚为材料,采用酶联免疫法测定了不同培养时间诱导的幼胚及成熟胚愈伤组织内源脱落酸(ABA)、吲哚乙酸(IAA)、赤霉素(GA3)和细胞分裂素(ZR)含量的动态变化。测定结果表明,在0～7d时,幼胚及成熟胚的IAA和GA3含量均急剧下降, 说明在胚萌发阶段IAA和GA3需求量较大。在幼胚胚性愈伤组织发生初期（14 d左右）,两种激素含量出现峰值,反映出幼胚较高水平的IAA和GA3含量,有利于胚性愈伤组织的诱导。在胚萌发后的愈伤诱导阶段,成熟胚愈伤中IAA、GA3和ABA含量以及IAA/ABA和GA3/ABA比值明显高于幼胚愈伤,且IAA/ABA和GA3/ABA比值均大幅度上升; 而幼胚愈伤组织中IAA/ABA和GA3/ABA比值则稳定地维持在较低的水平上。可以认为, 成熟胚愈伤组织中过高水平的IAA、GA3和ABA含量及IAA/ABA和GA3/ABA比值大幅度的上升可能是导致其难以形成胚性愈伤组织的主要生理原因之一。     

水稻OsWRKY19基因启动子的分析

利用PCR技术从水稻(Oryza sativa)秀水11品种中克隆了转录因子WRKY19编码区5'上游大小为1 404 bp的调控序列，命名为OsW19p, 将它和长度为105、378、977、1 106、1 205和1 306 bp的5'端缺失体分别与gus基因融合，构建植物表达载体。用根癌农杆菌介导法将所有载体转化水稻，GUS组织化学分析和荧光测定结果表明：(1)培养基中的2,4-D强烈抑制 gus基因在愈伤组织阶段的表达；(2) gus基因在转基因植株的根、茎、叶和花中均有表达，在花粉和成熟种子中无表达，在种子萌发时胚有表达，在苗期种子根和不定根及它们的侧根均有表达但根尖无表达，成熟期根部只有侧根有表达；(3)除p105以外OsW19p (p1404)和其它5个不同长度的缺失体均可驱动gus基因在转基因苗叶片中的表达，p1205活性最高，p977和p1306的活性减弱,由此推测-1404～-1306 bp和-1205～-977 bp间包含正调控元件，-1306～-1205 bp和-977～-378 bp间包含负调控元件。