七筋菇植物ISSR-PCR反应体系研究

为建立适宜于七筋菇Clintonia udensis Trautv.et Mey.ISSR-PCR分析的扩增体系,确定引物适宜的退火温度,利用正交试验设计,从Mg2+浓度、dNTP浓度、Taq DNA聚合酶单位、引物浓度4种因素4个水平,对七筋菇ISSR-PCR反应体系进行优化.结果表明,根据Tm-5℃±5℃设定引物的退火温度梯度,确定出不同引物的最适退火温度.对引物873来说,其最适退火温度为53℃.按照正交试验设计,测试不同引物各因子之间在不同水平的组合情况,确定不同引物的最佳组合体系.引物897在第10组合反应最佳即3.0 mmol · L-1Mg2+;0.2mmol · L-1dNTP;0.1μL Taq DNA聚合酶; 0.2μmol · L-1引物浓度.确定10μL的反应体系中,Mg2+为2.5～3.0mmol · L-1,dNTP为0.15～0.20mmol · L-1,引物浓度为0.20～0.25μmol · L-1,Taq DNA聚合酶为0.1μL,模板DNA用量为50ng.适宜的退火温度为48～62℃.     

大花君子兰ISSR-PCR反应体系的建立与优化

以大花君子兰为材料研究了PCR反应体系的主要成分及退火温度对君子兰ISSR扩增结果的影响,并对影响PCR反应体系的主要成分及退火温度进行筛选和优化,确立了适合君子兰ISSR-PCR分析的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Mg2+为2.0 mmol/L,模板DNA用量为50 ng/μL,Taq酶0.4 U,dNTPs浓度为0.15 mmol/L,引物浓度为0.4 mmol/L。筛选出了13个适宜君子兰遗传分析的ISSR引物,确定最适宜退火温度为52~56℃。     

桑树ISSR-PCR反应体系建立及优化

采用正交试验设计L_(16)(4~5)对桑树ISSR-PCR反应体系中的模板DNA、引物、Mg~(2+)、dNTPs和rTaq酶5个因素及反应程序中变性时间、退火时间、延伸时间和循环数进行优化分析。结果表明,各因素水平变化对反应体系的影响大小依次为DNA模板rTaq酶Mg~(2+)引物dNTPs。最终确立了最佳反应体系,即在10μL反应体系中,含25 ng/μL DNA模板1μL、10×PCR buffer 1μL、20μmol/L引物0.2μL、2.5 mmol/L Mg~(2+) 0.8μL、2.5 mmol/L dNTPs 1μL、5 U/μL rTaq 0.1μL。优化得到的反应程序为94℃预变性5 min;94℃变性40 s,合适的退火温度退火45 s,72℃延伸90 s,40个循环;72℃延伸10 min,16℃保存。通过梯度PCR,确定引物ID37的退火温度为49.5℃。稳定性检测表明该体系能用于桑树ISSR分析。     

盾叶薯蓣ISSR-PCR扩增条件研究

以盾叶薯蓣的叶片制备ISSR-PCR DNA 模板.通过单因子试验分别研究了模板DNA质量和浓度、Mg2 浓度、Taq酶用量、dNTPs浓度以及退火温度对盾叶薯蓣ISSR-PCR扩增的影响,建立了适宜于盾叶薯蓣的ISSR反应体系和扩增参数,即15μL反应体系中包括:20 ng/L模板DNA,1×Taq酶缓冲液,1.0 U Taq聚合酶,2.5 mmol/L MgCl2,0.2 μmol/L引物和0.3 mmol/L dNTPs.并从46个ISSR引物中筛选出10个带纹清晰、多态性丰富的引物,并确定了这些引物的适宜退火温度.     

薏苡ISSR-PCR扩增体系的优化

采用改进的SDS法提取薏苡种子胚基因组DNA,测试薏苡ISSR扩增的最适退火温度,并采用单因素试验,测试Mg2 、dNTP、BSA、引物浓度及模板DNA、TaqDNA聚合酶用量等6个因素对ISSR-PCR扩增结果的影响。结果显示,10μl PCR反应体积中包括:1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl pH值9.0,50 mmol/LKCl,0.1%Triton X-100),1.75 mmol/L Mg2 ,0.6 mmol/L dNTP,1 mg/ml BSA,10 ng模板DNA,20 pmol引物,0.45 UTaq酶。     

半矮生桃基因组DNA的提取及SSR-PCR反应体系的优化

为获得高纯度高质量的DNA和建立稳定的SSR-PCR反应体系,采用常规CTAB法和改进CTAB法提取半矮生桃基因组DNA。结果表明:改良CTAB法提取的DNA纯度高,多糖和蛋白质含量低,可用于SSR反应。同时,通过对影响SSR反应的6个要素设计正交试验,确定了最优的SSR-PCR反应体系,20μL反应体系为:25 mmol/LMg2+1.5μL、2.5 mmol/L dNTPs 2μL、5 U的Taq酶0.22μL、10×Buffer缓冲液4μL、10 mmol/L引物0.6μL、20 ng模板0.8μL,优化的退火温度为57.6℃。     

亮叶蜡梅ISSR反应体系的建立与优化

为了建立和优化亮叶蜡梅(Chimonanthus nitens Oily.)的ISSR反应体系,对模板DNA的浓度、引物浓度、Mg2+浓度等影响因子进行了筛选.结果表明:在25 μL的反应体系中,含有40 ng模板DNA、1 U Taq酶、0.2 mmol/L dNTP、0.3μmol/L引物、1.5 mmol/L Mg2+、2.5μL 10×buffer的扩增效果最好.利用该优化的反应体系,筛选出了12条稳定性强、清晰度高、多态性高的ISSR引物,并对筛选出的12条引物在不同退火温度(51～56℃)下的扩增效果进行了比较,从而确定了每个引物的最佳退火温度.     

丝瓜ISSR-PCR反应体系的建立

以丝瓜为试材,研究了ISSR-PCR反应体系的主要成分及退火温度、循环次数对丝瓜ISSR扩增结果的影响。结果表明:在20μl的反应体系中,Mg2+的用量为2 mmol/L,dNTPs浓度为0.2 mmol/L,引物的浓度为0.6μmol/L,TaqDNA聚合酶的用量为1 U,模板DNA的用量为30 ng,在适当的退火温度下,35个循环能得到清晰、多态性高的ISSR带谱。     

影响芥蓝×甘蓝RAPD标记稳定性的外部条件优化研究

通过对影响RAPD标记稳定性的引物浓度梯度、退火温度梯度、dNTP浓度梯度、Taq酶浓度梯度等外部条件的优化研究,确定了RAPD反应适宜的引物浓度为0.1~0.2pmol/μL,退火温度为48~52℃,dNTP浓度为0.3~0.15mmol/L及Taq酶浓度为0.3U/μL,提高了该反应体系中RAPD的稳定性。     

沙地云杉ISSR-PCR反应体系的初步优化

以沙地云杉叶基因组DNA为材料,采用单因素试验方法对ISSR-PCR体系中的主要成分Mg2+、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物浓度、退火温度进行筛选,建立并优化沙地ISSR-PCR反应体系。结果表明,UBC835是最适引物,适宜退火温度为50℃。沙地云杉ISSR-PCR分析的最适反应体系(20μL PCR反应体系)为:2.0 mmol/L Mg2+、1.0 U/μL Taq DNA聚合酶、0.25 mmol/L dNTPs、0.25μmol/L引物、50 ng/μL模板DNA。PCR扩增程序:94℃预变性4 min;94℃变性45 s,50℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环;72℃延伸7 min,4℃保存。     

濒危植物珙桐ISSR-PCR反应体系的建立

以珙桐叶片为材料,通过单因子试验分别研究了退火温度、TaqDNA聚合酶用量、dNTP浓度、Mg2 浓度、引物浓度和模板DNA浓度对ISSR-PCR反应的影响,建立了适宜于珙桐ISSR分析的扩增体系,即25μl的反应体系中:模板DNA20 ng,Mg2 1.5 mmol/L,引物0.6μmol/L,dNTP 0.20 mmol/L,TaqDNA聚合酶1.5 U。     

木荷ISSR反应体系的建立与优化

在利用ISSR技术对木荷的遗传多样性进行研究的试验过程中,对影响PCR扩增效果的一些因素诸如模板DNA用量、引物用量、牛血清白蛋白浓度T、aq DNA聚合酶用量、4×dNTP浓度、Mg2+浓度以及退火温度等指标进行筛选和优化,确立了可用于木荷ISSR-PCR分析最适宜的PCR反应条件:10lμPCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris-HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%TritonX-100),0.75 U Taq DNA聚合酶,1.5 mmol/L MgCl2,0.2 mol/L 4×dNTP,6 pmol引物,2 mg/ml牛血清白蛋白,10 ng模板DNA;适宜木荷ISSR扩增的退火温度为56.3℃。     

兜兰属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以兜兰为试材,用改进的CTAB法提取总DNA,采用正交试验设计,分析Mg2+浓度、dNTP浓度、引物浓度和Taq DNA聚合酶用量对ISSR-PCR扩增的影响,并通过梯度PCR确定最佳退火温度,最终建立兜兰ISSR扩增反应体系。最佳反应体系为:25μL体系中,含10×PCR buffer 2.5μL、1.5mmol/L Mg2+、0.15mmol/L dNTP、0.6μmol/L引物、1.0 UTaq酶和40 ng模板DNA。反应程序为:94℃5 min,94℃30 s,56.2℃45 s,72℃1 min,共40个循环;72℃延伸7 min。     

皱边石杉内生真菌ISSR-PCR反应条件的优化

以从皱边石杉中分离纯化出的99株内生真菌DNA为材料,优选出10条ISSR引物(UBC842、UBC848、UBC850、UBC856、UBC861、UBC864、UBC868、UBC873、UBC880、UBC887)的最适退火温度,并对其进行ISSR–PCR反应体系单因素试验及正交试验优化,建立皱边石杉内生真菌ISSR–PCR的优化反应体系,即25μL反应体系中,10×PCR Buffer(Mg2+浓度为2.0 mmol/L)2.5μL,dNTPs(10 mmol/L)0.6μL,引物(10 pmol/μL)2.0μL,Taq E(1 U/μL)1.5μL,DNA模板(10 ng/μL)3μL,无菌ddH2O 15.4μL。以UBC873引物对99株内生真菌基因组DNA进行PCR扩增,初步获知皱边石杉内生真菌资源的遗传多样性非常丰富。     

茶树ISSR-PCR反应体系的正交优化

对茶树ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶浓度(U/(20μL))、Mg2+浓度(mmol/L)、模板DNA质量浓度(ng/(20μL))、dNTP浓度(mmol/L)、引物浓度(μmol/L))在4水平上进行正交优化试验,筛选出各因素的最佳水平,建立茶树最佳ISSR-PCR反应体系,即20μL反应体系中,TaqDNA聚合酶为1.0U/(20μL),Mg2+为2.0mmol/L,模板为40ng/(20μL),dNTP为0.20mmol/L,引物为0.25μmol/L.对茶树ISSR-PCR最佳反应体系进行梯度退火试验,确定引物ISSR1、UBC881的最适退火温度分别为52.4、59.0℃.     

田野菟丝子ISSR-PCR反应体系的建立与优化

利用ISSR技术对田野菟丝子的遗传多样性进行了研究,通过筛选引物并对影响PCR扩增效果的一些因素如Mg2 浓度、牛血清白蛋白浓度、4×dNTP浓度、模板DNA用量、引物用量、TaqDNA聚合酶用量以及退火温度等指标进行优化,建立了可用于田野菟丝子ISSR分析最适宜的反应体系:10μl PCR反应体积中,1×Taq酶配套缓冲液(10 mmol/L Tris.HCl,pH值9.0,50 mmol/L KCl,0.1%Triton X-100),2.5 mmol/L MgCl2,2.0mg/ml牛血清白蛋白,0.2 mmol/L4×dNTP,10 ng模板DNA,6 pmol引物,0.3 UTaqDNA聚合酶。引物UBC811的最适退火温度为50.7℃。     

葛属植物ISSR-PCR扩增条件的正交优化

利用正交试验设计法L9(34),从引物浓度、TaqDNA聚合酶浓度、Mg2+浓度和dNTP浓度4种因素3个水平,对葛资源ISSR-PCR反应体系进行优化分析,并在此基础上对PCR反应的退火温度进行梯度筛选。结果表明,25μL最佳的葛资源ISSR-PCR反应体系是:1×PCR buffer、0.20 mmol/L dNTP、0.4μmol/L引物、2.5 mmol/L Mg2+和0.5 U TaqDNA聚合酶,引物UBC809的最佳退火温度为57.9℃。     

旱稻孢囊线虫ISSR反应体系的建立与优化

采用正交设计对旱稻孢囊线虫ISSR–PCR反应体系的4因素(Taq酶、模板DNA、d NTPs、引物)在4个用量水平上进行优化试验。结果表明,旱稻孢囊线虫ISSR–PCR最佳的反应体系为:在25μL反应体系中,含Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.3μL﹑模板DNA 1μL﹑d NTPs(2.5 mmol/L)2μL﹑引物(10μmol/L)1μL﹑10×PCR Buffer(20 mmol/L Mg2+plus)2.5μL。引物UBC887最适退火温度为48℃。优化的旱稻孢囊线虫ISSR–PCR的反应体系和程序有较好的重复性和稳定性。     

中国鲎微卫星引物扩增圆尾鲎DNA的PCR反应体系优化

采用正交设计法,从dNTPs浓度、引物浓度、Mg2＋浓度、Taq DNA聚合酶用量4个因素3个水平出发,优化设计圆尾鲎DNA的PCR反应体系（引物为中国鲎微卫星引物）.并采用直观分析方法分析正交试验结果,最终建立了圆尾鲎SSR-PCR最佳反应体系：总体积20μL,Taq DNA聚合酶1.5 U、dNTPs 0.16 mmol/L、引物0.2μmol/L、Mg2＋2.0 mmol/L;并通过PCR梯度实验进一步优化模板DNA质量浓度、退火温度及退火时间,获得最佳反应条件：模板DNA质量浓度为30 ng/μL,退火温度为48℃,退火时间为20～25 s.对最佳反应体系和反应条件进行了检验,结果显示该反应体系稳定性高、重复性好.     

悬铃木SSR反应体系建立及引物筛选

以三球悬铃木组培苗为试验材料,对影响SSR-PCR扩增效果的退火温度、dNTP、引物浓度、Taq酶量及悬铃木DNA等因素的筛选,建立适宜的悬铃木SSR-PCR分子标记反应体系。结果表明,在20μL-1体积中,50℃退火温度、4 ng.μL-1模板DNA、0.2 mmol.L-1 dNTP、0.05 U.μL-1 Taq酶量和0.6μmol.L-1引物浓度是悬铃木的最适SSR反应体系。此外,利用该体系筛选出了54对适合悬铃木SSR扩增的引物。