实时定量PCR方法检测转基因产品

实时定量PCR方法检测转基因产品，操作简单，省时省力，结果可靠、准确性高。该方法利用特异性荧光探针实时监测目的的基因的扩增，同时循环参数（Ct值）和PCR体系中起始DNA量的对数值之间有严格的线性关系。利用阳性标准样品的Ct值，制成标准曲线，再根据未知样品的Ct值就可以准确确定起始DNA的数量。高纯度探针和适宜的镁离子浓度是该方法准确定量的关键。实时定量PCR方法有效地解决了其他定量方法所存在的假阳性及定量准确度不高的难题。     

实时荧光PCR定性检测菜籽粕中转基因成分的研究

本文针对使用实时荧光PCR对深加工的饲料菜籽粕进行转基因检测的研究,就DNA抽提、纯化和实时荧光PCR过程中使用样品DNA的最适浓度等方面,对检测方法进行了适当的改进,并探讨了如何根据所得荧光曲线的Ct值判定菜籽粕中是否含有转基因成分.     

进口转基因玉米品系特异性检测

从文献、网站和数据库中收集了14个转基因玉米品系特异性定量检测方法,将这些方法应用于从美国进口的近60万t转基因玉米的检测,检出了国家批准的11个转基因品系,还在全国首次从大宗原粮中检出国家未批准转基因玉米品系MON89034。这为转基因玉米品系特异性检测标准的制定打下了基础。     

杜松烯合成酶作为转基因棉花PCR检测的内参照基因

根据棉属植物中棉酚合成的关键酶之一杜松烯合成酶[（＋）-d-cadinene syhnthase]基因序列，设计合成了该酶的实时荧光PCR的引物和TaqMan探针，经研究发现，此套引物探针能特异性检测海岛棉和陆地棉，有较高的检测灵敏度。同马铃薯、大椒、茄子、烟草、番茄、玉米、大豆、小麦、水稻和其它转基因作物无非特异性反应，可以作为转基因棉花检测的内参照。     

实时荧光PCR检测瓜炭疽病菌

采用实时荧光PCR技术建立了瓜炭疽病菌(Colletotrichum orbiculare)的检测方法。根据瓜炭疽病菌甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因和谷氨酰胺合成酶(GS)基因序列,设计了该病菌特异性引物和TaqMan探针,并对所设计的引物和探针的反应条件进行了优化。采用本试验建立的实时荧光PCR方法对瓜上的其他菌株及近似菌株进行检测,可将瓜炭疽病菌与其他病原菌区分开。灵敏度试验表明,25μL体系中只要有39.6pg的核酸量就可以被检测到,检测灵敏度达到1.584pg/μL,比普通PCR检测灵敏度高100倍。同时对田间采集的病株和未知样品进行的检测证明了引物和TaqMan探针的特异性。     

实时荧光PCR快速检测苹果蠹蛾

苹果蠹蛾(Cydia pomonella L.)是重要的国际检疫性害虫。本文根据苹果蠹蛾线粒体COI基因序列设计引物和探针,对苹果蠹蛾及其相似种进行实时荧光PCR检测,结果表明,不同虫态的苹果蠹蛾均能够与近似种类区分开来。该技术可快速准确地鉴定苹果蠹蛾,为检疫性害虫苹果蠹蛾的检疫提供了一种新的方法。     

丁香疫霉病菌PCR和实时荧光PCR检测

 为了快速、准确地检测丁香疫霉病菌 (Phytophthora syringae, PSY),根据GeneBank中PSY的ITS序列设计特异引物Psy1/Psy2和探针P-Psy,建立了常规PCR和实时荧光PCR检测方法。利用引物Psy1/Psy2扩增供试的26株PSY能得到585 bp的预期目标条带,但扩增其它61个非PSY供试菌株不能得到预期产物,检测灵敏度为12 pg菌丝DNA;探针P-Psy对供试26株PSY表现为阳性扩增,而对其它菌株和空白对照均表现为阴性扩增,检测灵敏度可达120 fg菌丝DNA,比常规PCR高100倍;引物Psy1/Psy2和探针P-Psy对5 g土壤中PSY卵孢子的检测灵敏度分别为20 000个和200个。样品检测试验表明两种PCR方法可用于口岸植物检疫中快速、准确和特异地检测丁香疫霉病菌。     

冬生疫霉的实时荧光PCR检测方法

冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)是我国检疫性病原菌。本研究根据冬生疫霉的ITS基因序列,设计了实时荧光PCR引物PH-F和PH-R及TaqMan-MGB探针PH-Pr,建立了冬生疫霉的实时荧光PCR检测方法,可检测到冬生疫霉DNA最低浓度为50 fg/μL,而冬生疫霉的近似种、近缘种和空白对照,无荧光信号增加。因此,利用该方法可以稳定、高效的检测出冬生疫霉。     

兰花褐斑病菌实时荧光PCR检测

兰花褐斑病菌(Acidovorax avenaesubsp.cattleyae)是兰花上一种重要进境检疫性有害生物,可通过植株和种子远距离传播,其传染性强,对兰花危害性大。根据核糖体ITS序列设计了TaqMan-MGB探针并建立了实时荧光PCR检测方法。该方法能够特异性检测兰花褐斑病菌,所有供试的目标菌株检测结果均为阳性,而其它28个对照菌株(含同属内其它种及avenae种下其它亚种)均为阴性。利用该方法从发病兰花植株总DNA中检测到该病菌。本方法灵敏度高,检测极限达9×10-9μg DNA,操作方便快速,结果可靠,适合于口岸兰花的进出境检疫及兰花种苗健康质量控制。     

实时荧光PCR检测马铃薯白线虫技术研究

马铃薯胞囊线虫是马铃薯上最重要的有害生物之一,也是我国特别关注的重要植物检疫性线虫.针对马铃薯白线虫ITS序列,我们设计了引物和TaqMan探针,使用15种马铃薯胞囊线虫群体和4种其它胞囊线虫样品进行验证,可高度灵敏地检测单个马铃薯白线虫的胞囊或幼虫,最高检测灵敏度达到10fs;同时开展了混合样品和未知样品的检测,证明了引物的专化性和TaqMan探针特异性.该检测方法可自动化检测马铃薯白线虫并进行定量,适合进行标准化的常规检测.     

二重荧光定量PCR检测转基因大豆DAS81419

本文针对大豆内源基因Lectin和转基因大豆DAS81419品系的5′端插入位点序列,设计特异性引物及探针,建立了同时检测转基因大豆DAS81419品系和大豆内源基因Lectin的二重荧光定量PCR方法,运用15种转基因大豆、3种转基因玉米、1种转基因油菜、1种转基因水稻和非转基因大豆对该方法进行了特异性评价,并分析了该方法的灵敏度和稳定性。结果显示,该方法能准确从20种转基因样品和1种非转基因样品中检出靶目标,检测结果与待检样品信息一致,表明本方法具有良好的特异性;灵敏度高达0.01%;并具有良好的重复性。该方法特异性强、灵敏度高、稳定性强,适用于各口岸实验室进行转基因大豆DAS81419的快速、准确的检测。     

杂交诱捕实时荧光PCR检测番茄环斑病毒

 番茄环斑病毒(Tomato ringspot nepovirus,ToRSV)广泛分布于欧美及大洋洲,能侵染葡萄、桃、苹果、樱桃、番茄及烟草等150多种植物,引起多种病害,严重时导致绝产^[1]。     

木质包装中松材线虫的实时荧光PCR检测

松材线虫是进境木质包装中的重要检疫对象之一。本研究以进境木质包装中截获的12种伞滑刃属线虫,包括4种不同来源的松材线虫、3种不同来源的拟松材线虫、豆伞滑刃线虫、大尖尾伞滑刃线虫、阿苏里伞滑刃线虫、伯氏伞滑刃线虫及拟小刺伞滑刃线虫为材料,进行实时荧光PCR检测。结果显示,仅松材线虫可观察到明显的荧光强度变化,而其他线虫的荧光强度没有变化。通过研磨样品的方法,提取单条松材线虫的DNA,进行实时荧光PCR试验,检测成功率为100%,且不论是雄虫、雌虫或幼虫均能检测出来。该研究对于我国口岸进境木质包装中松材线虫的检测具有一定的实际意义。     

油棕猝倒病菌实时荧光PCR检测方法

油棕猝倒病菌(Pythiums plendens)是我国进境植物检疫性有害生物。本试验根据P.splendens rDNA ITS区序列,设计了实时荧光PCR引物pyspF/pyspR及荧光探针pyspT,建立了P.splendens荧光PCR检测方法,检测灵敏度为0.012pg/μL。     

超声波处理对水稻种子转基因成分荧光PCR检测的影响

以转基因水稻科丰6号含量0.1%(m/m)与0.01%(m/m)的水稻种子为样品,对影响检测结果的DNA提取过程中样品CTAB裂解缓冲液常规温育与超声波温育处理进行比较分析。结果表明,在不同样品颗粒细度的样品中,无论温育时间10 min、30 min还是1 h,CTAB缓冲液超声波温育处理与常规温育处理比较,获得的DNA质量浓度有明显提高,转基因成分NOS、Cry1Ab、Kf6(Ub-C)的荧光PCR检测Ct值差异达到极显著,超声波温育处理30 min、1 h可基本达到常规温育处理4 h或8 h的样品荧光PCR检测效果,使得水稻种子转基因成分荧光PCR检测时间至少节省3~7 h,大幅度提高了检测效率。     

实时荧光定量PCR法检测十字花科细菌性黑斑病菌

为有效防控我国的检疫性有害生物十字花科细菌性黑斑病菌Pseudomonas syringae pv.maculicola在国内的传播与蔓延,通过设计1对特异性引物3539,利用132株靶标和非靶标菌为模板进行PCR扩增,建立了实时荧光定量PCR法,并进行了模拟种子带菌试验。结果显示,引物3539为只针对十字花科细菌性黑斑病菌扩增出的特异性产物;在模拟种子带菌检测中,常规PCR对菌悬液的检测限为10~5CFU/m L,实时荧光定量PCR的检测限为10~3CFU/m L,其中10~8CFU/m L菌液的Ct值最低,为22.90,10~3CFU/m L菌液的Ct值最高,为35.73,且不同浓度菌液间的Ct值均有显著差异;不同带菌率模拟种子的检测结果表明,常规PCR和实时荧光定量PCR能检测到的带菌率分别为0.5%和0.1%。研究表明,实时荧光定量PCR法不仅可用于病种的检测,也可用于病害的早期诊断。     

苜蓿黄萎病菌实时荧光PCR检测方法

苜蓿黄萎病菌(Verticillium albo-atrum)能够危害多种重要的农艺和园艺作物,是我国重要检疫性有害生物。本研究根据V.albo-atrum的ITS基因序列,结合张正光设计的引物Vaa-1和Vaa-2,设计一条TaqMan探针Vaa-probe,研究实时荧光PCR的检测方法,以更加快速、灵敏的检测出V.albo-atrum。利用该方法可检测到含V.albo-atrumDNA浓度0.0005 ng/μL以上的样品,大大提高了检测的灵敏度。     

应用TaqMan探针进行马铃薯金线虫实时荧光PCR检测技术研究

马铃薯孢囊线虫是全球性的植物检疫性线虫,亦是我国重点关注的有害生物。针对马铃薯金线虫ITS序列,设计了引物和TaqMan 探针,使用15个马铃薯孢囊线虫群体和4个其他孢囊线虫样品进行验证,可高度灵敏地检测单个马铃薯金线虫的孢囊或幼虫,并可进行定量;最高检测灵敏度达到10fg;同时开展了混合样品和未知样品的检测,证明了引物的专化性和TaqMan探针的特异性。该检测方法可自动化检测马铃薯金线虫并进行定量,适合进行标准化的常规检测。     

应用TaqMan探针实时荧光定量PCR技术早期检测稻瘟病

 稻瘟病是一种严重危害水稻生产的真菌病害,早期监测和防治是关键。温室接种大田主栽品种合系39和感病水稻蒙古稻,定时观察发病症状。提取水稻病样总DNA,根据稻瘟菌28S rDNA基因序列,设计特异引物和TaqMan探针,进行荧光定量PCR检测。结果表明稻瘟菌在蒙古稻和大田主栽品种合系39上症状最初出现时间为接种后72 h,蒙古稻典型症状出现时间为接种后168 h,在合系39上出现典型症状的时间为接种后190 h以后。利用TaqMan探针荧光定量PCR技术,在接种12 h的蒙古稻和合系39上均能检测到稻瘟菌DNA,接种48 h,菌量拷贝数达到最高峰,接种72 h,菌量拷贝数开始下降。不同品种中病原菌拷贝数存在差别,在接种12 h的蒙古稻中稻瘟菌含量为7.2×103个拷贝数,在合系39中为4.9×103个拷贝数。本研究结果表明,应用实时荧光定量PCR技术可以在接种后12 h症状未显现之前检测到稻瘟菌,为稻瘟病流行监测和早期防治提供了科学依据。     

梨火疫病菌的实时荧光PCR检测

 根据梨火疫病菌16S~23S间的ITS保守序列,设计并合成了一对特异性引物REA/FEA,应用荧光染料SYBR Green I,对10个梨火疫的菌株和其它相关参试菌株进行了检测。结果表明,10个梨火疫菌株都产生荧光信号而其它参试菌株都不产生荧光信号,成功建立了梨火疫病菌的实时荧光PCR检测方法。整个检测过程只需3h,完全闭管,降低了污染的机会,无需PCR后处理。检测的灵敏度是4个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高了10倍。用该特异性引物对梨枝条浸泡液进行实时荧光PCR检测,结果可特异性检测到目标菌的存在,并且检测的灵敏度是24个菌体细胞,比常规PCR电泳检测提高10倍。