人工合成柞蚕抗菌肽D基因转化沙田楠

采用根癌农杆菌介导法将柞蚕抗菌肽Ｄ基因导入沙田柚上胚轴等外植本,经卡那霉素筛选,获得了若干转基因植株。对这些植株进行胭脂碱电泳检测,点印迹杂交,ＰＣＲ扩增和Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析,结果表明：抗菌肽Ｄ基因已转入到沙田柚细胞中。     

根癌农杆菌介导柞蚕抗菌肽D基因转化柑桔的研究

 以含有双元载体（携带人工合成的柞蚕抗菌肽D基因、npt-Ⅱ基因和nos基因）的根癌农杆菌菌株SE转化锦橙、新会橙（Citrus sinenis Osbeck）、沙田柚（C.grandis）的上胚轴和子叶外植体，经共培养和预培养后在含卡那霉素（Km）的诱芽培养基中诱导并筛选Km抗性芽。探明了柑桔品种（基因型）、预培养时间和不同的芽伸长培养基对Km抗性芽诱导和伸长的影响。抗性芽经伸长培养后在含Km的生根培养基中生根或经离体微嫁接，获得了转化植株。Southern blot分析证明柞蚕抗菌肽D基因已整合到3个柑桔品种的基因组。     

农杆菌介导的沙田柚基因转化系统建立研究

本文以沙田柚上胚轴为对象,进行了农杆菌介导的基因转化系统建立影响因素研究.研究结果表明沙田柚上胚轴卡那霉素选择浓度为70mg几上胚轴与农杆菌的共培养基中加入150uM的As可提高上胚轴Gus瞬时表达阳性率;实生苗苗龄以20-25天为宜;上胚轴最适预培养时间为3天,卡那霉素起始选择浓度降为50mg几有利于转化率的提高.     

农杆菌介导的抗菌肽基因SPCEMA对马铃薯的遗传转化

为了得到马铃薯抗病材料,本研究利用根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)LBA4404转化马铃薯栽培品种“台湾红”,建立了优良的遗传转化系统:根癌农杆菌浓度以D600nm=0.5￣0.8为宜,感染时间以5min为宜;茎段和叶盘的预培养时间分别以4d和8d为宜,共培养时间皆以3d为宜。通过PCR和Sourhernblotting检测证明抗菌肽基因SPCEMA已成功导入其中。其茎段和叶片为的转化频率分别为10%和5.79%。     

农杆菌法将抗菌肽D基因导入蕉柑胚性细胞的研究

用农杆菌介导的方法成功地将抗菌肽D基因导入到蕉柑胚性悬浮细胞，再生芽经PCR、Southern杂交证明抗菌肽D基因已整合到其基因组DNA中，在农杆菌介导的蕉柑胚性悬浮细胞转化过程中，共培养介质中的乙酰丁香酮（As)能显著提高其转化效率，与对照相比，每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数从0提高到0.75，悬浮细胞与农杆菌共培养时间对转化效率也具有显著影响，共培养1、2、3d后，每克悬浮细胞转化后形成的抗卡那霉素细胞团数分别为0.20、0.75，0。     

几丁质酶基因在番茄上的转化

通过极癌农杆菌介导将水稻几丁质酶基因导入番茄中,得到转基因植株。导入的三个基因即ｎｐｔⅡ、ｂａｒ和几丁质酶基因在子一代以３：１的比较分离。     

黄瓜花叶病毒外壳蛋白基因转化番茄的研究

通过根癌农杆菌介导，采用叶盘转化法，探讨了黄瓜花叶病毒外壳蛋白（CMV－CP）基因导入番茄栽培品种‘红宝石’的适宜条件。结果表明：适宜的卡那霉素（Km)浓度，根癌农杆菌浓度，根癌农杆菌感染时间以及共培养时间分别为35mg/L,D600约0.5,10-15min和2－3d；将诱导形成的抗性愈伤组织转接到含有35mg/L Km的分化培养基和生根培养基中使其分化不定芽和生根，获得了抗Km的番茄再生植株。对再生植株进行再欠离体培养抗Km鉴定和PCR分子检测，补CMV-C基因已导入番茄再生植株的基因组中。     

农杆菌介导的水稻基因转化

以水稻的两个亚种籼稻和粳稻作为受体,比较了不同外值体、vir诱导物等对根癌农杆菌转化的影响,建立了农杆菌介导的水稻高效转基因实验体系。依据该体系,以粳籼DREW的幼愈伤组织和籼稻D汕B的幼穗愈伤组织为受体,经农杆菌AGL1／pCAMBIA1301转化后,获得了超过50%的潮霉素抗性愈伤筛选率,并获得再生植株。     

抗蚜基因转化矮牵牛的初步研究

通过农杆菌介导途径,用叶盘转化法将抗蚜基因(雪花莲凝集素基因,GNA)转化到矮牵牛中,获得了具有抗蚜基因(GNA)的矮牵牛。     

柑橘和拟南芥 RIN4基因的过表达载体构建及其对沙田柚的 DNA 转化

用逆转承 cDNA 聚合酶链式扩增（RT‐PCR）方法,分别从克里曼丁橘和拟南芥中克隆出 RIN4基因,连接到表达载体 pFGC5941,构建了柑橘 CcRIN4和拟南芥 A tRIN4基因的过表达载体,并成功转入 EHA105农杆菌。通过农杆菌介导法将过表达载体转入沙田柚,获得柑橘和拟南芥 RIN4基因的转基因沙田柚植株各6株。     

长寿沙田柚Ri T-DNA转型根优化培养体系研究

 设计了长寿沙田柚不同外植体在光、暗条件下进行发根农杆菌遗传转化试验，建立了长寿沙田柚Ri T-DNA转型根优化培养体系，该体系为：用对数期的发根农杆菌A4菌株感染活化胚中单片子叶的创伤腹面，25℃±2℃暗培养25～30 d，多数子叶上发出转型根（毛状根），遗传转化率达（83±11）%。继代脱菌5代后获得无菌转型根。外植体活化采用MT培养基，继代脱菌培养采用MS培养基。采用这个体系获得了大量激素自主的长寿沙田柚Ri T-DNA转型根。获得的新鲜转型根白色，长1.14±0.07 cm，粗0.73±0.04 mm，负向地性生长。     

高效液相色谱法测定柚叶中柚皮苷的含量

建立柚叶中柚皮苷含量的高效液相色谱分析方法。采用Kromasil C18色谱柱,流动相为甲醇∶水∶醋酸(35∶61∶4),流速为1.0ml/min,检测波长为283 nm。柚皮苷进样量在0.101~2.202μg线性良好,平均回收率101.27%,RSD为1.41%,所测样品的柚皮苷含量0.84%~1.25%,且嫩叶柚皮苷含量稍高于老叶。该法简便、快速、准确,可用于柚叶中柚皮苷的含量测定。     

柞蚕抗菌肽的分离纯化及杀菌效应

大肠杆菌（E.coli K12D31)诱导的柞蚕（Antheraea pernyi)蛹血淋巴，经加热处理后，进行CM－Sepharose阳离子交换层析，FPLC Pep RPC反相柱及HPLC Hi-Pore C18反相柱层析，纯化得到一类抗菌肽。SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定其相对分子质量约为2400，氨基酸组成分析表明其富含赖氨酸、丙氨酸和甘氨酸，摩尔分数分别为18．6％、15．5％和13．6％，不含甲硫氨酸、半胱氨酸、酪氨酸和组氨酸。抗菌谱表明该肽对多种革兰氏阴性和阳性细菌均有抑制作用。     

柚耐盐性的研究

水培和沙培试验结果表明,20mmol／L和40mmol／L NaCl胁迫,不影响坪山柚种子萌发率,但萌发时间延长2—4d;60～100mmol／LNaCl胁迫,随NaCl浓度的增加,坪山柚种子萌发率、胚根及芽长度下降,种子相对盐害率升高,相对盐害率和芽长度可作为柚种子耐盐性的评价指标。40mmol／LNaCl胁迫对坪山柚幼苗生长的影响不大,80-200mmol／LNaCl胁迫,明显降低坪山柚幼苗株高、叶面积、地上部干重和根部干重。根冠比维持相对稳定,有利于提高耐盐性。坪山柚幼苗生长受抑制的主要原因是地上部及根部吸收了较多Na^ 和Cl^-,从而产生离子毒害。     

琯溪蜜柚成年态茎段无菌系建立的影响因素

以琯溪蜜柚田间成年树茎段为材料,研究外植体消毒方法和茎段不同成熟度等因素对无菌系建立的影响。试验结果表明,经70%酒精处理30 s、400 mg.L-1头孢拉定浸泡30 min的预处理后,用0.1%升汞溶液消毒5 min结合10%NaClO消毒30 min的方法,半木质化茎段的成功率最高,达83.3%;外植体切成5 cm长进行消毒以及培养基中添加活性炭有助于减轻外植体的褐变。     

不同干制方式对沙田柚果渣粉活性物质的影响

【目的】比较热风干燥和冷冻干燥这两种干制方式所得沙田柚果渣粉膳食纤维（DF）和黄酮的组成、含量及理化功能特性,为沙田柚副产物在功能食品加工中的应用提供理论依据和技术支撑。【方法】以沙田柚榨汁后的果渣为原料,通过热风干燥和冷冻干燥两种干制方式,得到沙田柚果渣粉,分别测定两种果渣粉可溶性DF（SDF）和不溶性DF（IDF）的含量,通过扫描电镜观察沙田柚果渣粉的微观结构,测定其持水力、持油力和吸水膨胀力;采用福林酚法及硼氢化钠/氯醌比色法测定沙田柚果渣粉的总酚、总黄酮含量,采用高效液相色谱（high performance liquid chromatography,HPLC）分析其单体黄酮组成,采用氧自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity,ORAC）、ABTS自由基清除能力和铁离子还原能力（ferricreducing antioxidant power,FRAP）测定其抗氧化活性。【结果】热风干燥沙田柚果渣粉总DF（TDF）含量（46.10 g/100 g DW）显著高于冷冻干燥果渣粉（P<0.05）,两种干制方式得到的沙田柚果渣粉IDF/SDF比值较为均衡,分别为1.5和1.6,热风干燥果渣粉持水力（（7.55±0.43）g·g^-1 DW）和持油力（（1.94±0.08）g·g^-1 DW）略高于冷冻干燥果渣粉,但后者的吸水膨胀力（12.25 mL·g^-1 DW）显著高于前者（P<0.05）;沙田柚果渣粉中酚类物质主要以游离态形式存在,占总酚含量的95%以上,热风干燥果渣粉总酚含量（5.54 mg GAE·g^-1 DW）显著高于冷冻干燥果渣粉（P<0.05）,但二者总黄酮含量无显著性差异（P>0.05）,分别为13.11和11.45 mg CE·g^-1 DW;与其他柑橘属水果主要单体黄酮为柚皮苷不同,沙田柚果渣粉主要单体黄酮为柚皮苷和melitidin,占其总黄酮含量的70%以上;热风干燥果渣粉较冷冻干燥果渣粉显示出更强的抗氧化活性,其ORAC、ABTS和FRAP值分别为141.28、4.63和20.98 μmol TE·g^-1 DW。【结论】沙田柚果渣粉同时富含DF和黄酮,且其DF的水合性质和黄酮的抗氧化活性均高于常见的水果副产物,是良好的DF和黄酮补充剂,适合用于功能食品的开发。     

农杆菌介导的MADS-box基因转化黄瓜初步研究

试验通过叶盘转化法,利用根癌农杆菌介导,将从黄瓜中克隆到的MADS-box同源基因—CSMADS06基因,转化到烟草和2种不同品系的黄瓜S06和S52中,经过除草剂筛选获得14株转化烟草和28株转化黄瓜。PCR检测和GFP荧光检测证实,外源的CSMADS06基因已转入这些植株中。阳性率分别为2.36%(烟草),4.1%和2.9%(黄瓜)。抗性植株已开花结果并获得子一代植株。