PCR-SSCP研究在羊经济性状中的应用

PCR-SSCP是单核苷酸多态性分析的一项重要技术。本文简要介绍了PCR-SSCP的原理、方法、研究进展及其近年来在绵、山羊经济性状研究中的应用。     

PCR-SSCP技术的研究与应用

聚合酶链式反应-单链构象多态性分析(PCR-SSCP)是基因突变分析中的一项重要技术.由于其具有多方面的优点,因此,近年来的应用范围越来越广.对PCR-SSCP技术的建立和发展过程、原理、操作过程以及应用等方面进行了综述,以期对PCR-SSCP技术的应用起到一定的推动作用.     

牛类胰岛素生长因子IGF-I基因研究

采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术分析了类胰岛素生长因子1（IGF-I）基因5’侧翼区、第5外显子、第2外显子在南阳牛、鲁西牛、中国西门塔尔牛3个牛品种中的遗传多态。结果表明在IGF-I基因的5’侧翼区、第5外显子上未发现PCR-SSCP或PCR-RFLP遗传多态；在第2外显子中发现PCR-SSCP多态，有3种基因型AA型、AB型、BB型。对第2外显子的多态片段测序分析表明；在35bp处有碱基A→G的突变，248bp处有碱基C→T的突变，256bp处有碱基A→G的突变；35bp、248bp的碱基突变都是无义突变，而256bp处碱基A→G的突变为有义突变，使谷氨酸变为甘氨酸。     

牛类胰岛素生长因子IGF-Ⅰ基因研究

采用PCR-SSCP和PCR-RFLP技术分析了类胰岛素生长因子1(IGF-Ⅰ)基因5′侧翼区、第5外显子、第2外显子在南阳牛、鲁西牛、中国西门塔尔牛3个牛品种中的遗传多态.结果表明在IGF-Ⅰ基因的5′侧翼区、第5外显子上未发现PCR-SSCP或PCR-RFLP遗传多态;在第2外显子中发现PCR-SSCP多态,有3种基因型AA型、AB型、BB型.对第2外显子的多态片段测序分析表明在35 bp处有碱基A→G的突变,248 bp处有碱基C→T的突变,256 bp处有碱基A→G的突变;35 bp、248 bp的碱基突变都是无义突变,而256 bp处碱基A→G的突变为有义突变,使谷氨酸变为甘氨酸.     

PCR-SSCP技术应用研究进展

聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)是基于PCR的单链构象多态性分子标记技术.PCR-SSCP作为检测基因突变的方法,自创立以来,经历了自身发展和完善的过程.刚建立时是将同位素掺入PCR扩增物中,通过放射自显影来显示结果,这给该技术的推广造成一定的困难.随着DNA银染方法与PCR-SSCP结合,尤其是直接溴乙锭染色方法的应用,使得该方法大大简化,操作更为简单,局限性较小,实验条件要求不高,适合一般临床实验室使用,具有简便、快速、灵敏的特点.不但被用于检测基因点突变和短序列的缺失和插入,而且还可用于动物育种,微生物,寄生虫研究的多个领域.由于SSCP的突出的优点,近几年被大量地应用.     

绵羊FGF5基因SNP的生物信息学分析

研究利用PCR-SSCP方法检测了FGF5基因在小尾寒羊、湖羊、藏羊、中国美利奴羊等绵羊品种单核苷酸多态性。结果表明:FGF5基因在P1引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性并引起编码氨基酸的改变。经克隆测序分析,位于P1引物扩增片段内存在G→T突变,该突变位点使编码的氨基酸发生A→S的改变对引起编码氨基酸的P1位点进一步进行了生物信息学分析,发现由于编码序列的改变引起蛋白质二级结构的变化,并引起限制性酶切位点的变化,但没有引起功能位点和三级结构的变化。     

促黄体素LHβ基因的单核苷酸多态性与牛精液品质的相关分析

采用PCR-SSCP技术分析了LHβ基因的5′UTR和3个外显子在西门塔尔、夏洛来等种公牛中的遗传多态性。结果在所扩增的LHβ基因的5′UTR 2个目的片段和外显子1、3中均未发现PCR-SSCP遗传多态;在第2外显子中发现PCR-SSCP多态,有2种等位基因A和B,有3种基因型AA型、AB型、BB型。对多态片段的测序分析表明:在LHβ基因第2外显子中1个碱基G突变为A。适合性卡方检验表明,该位点的不同基因型频率处于Hardy-Weinberg平衡。用最小二乘法分析LHβ基因第2外显子不同基因型与西门塔尔和夏洛来精液品质的相关性,发现LHβ不同基因型对冻精畸形率和射精量有显著影响,对其他性状的影响差异不显著。结果表明,西门塔尔和夏洛来牛LHβ基因应是影响精液品质的一个主效基因或与影响精液品质的主效基因紧密连锁。     

草原红牛胰岛素样生长因子Ⅰ受体基因3′UTR序列多态性分析

以58头草原红牛为试验材料,采用PCR-SSCP技术对胰岛素样生长因子Ⅰ受体(IGF-ⅠR)基因3′UTR序列多态性进行了检测。结果表明,在IGF-ⅠR基因3′UTR中发现PCR-SSCP的多态位点,有2种等位基因和3种基因型。对所得基因型与生长和胴体性状的相关性分析结果发现,在3′UTR中AB型的胴体产肉率、肉骨比显著高于AA、BB型(P0.05);AA型的脂肪覆盖率显著高于BB型(P0.05),与AB型差异不显著(P0.05)。     

绒山羊雌激素受体基因外显子1多态性及序列分析

雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因对动物的生殖功能发挥着重要的作用。根据GenBank发表ESR基因外显子1的序列设计引物,采用PCR-SSCP技术分析ESR基因外显子1在河西绒山羊中的单核苷酸多态性,研究该基因对繁殖性能的影响。结果:ESR基因外显子1在所检测河西绒山羊品种中不存在PCR-SSCP多态性,所扩增的片段核苷酸和氨基酸序列与绵羊、人、牛、猪、马、大鼠、小鼠和鸡8个物种的同源性分别为52.0%～98.1%和57.9%～98.2%,序列分析证明山羊ESR基因外显子1序列比较保守,该区域不是影响河西绒山羊繁殖力的功能结构域。     

奶山羊经济性状分子标记研究进展

本文综述了采用RAPD、微卫星、PCR-RFLP、RMAPD、PCR-SSCP等技术分析奶山羊重要经济性状分子标记的研究进展,这些研究为奶山羊经济性状的高效选育、遗传资源的改良、开发和标记辅助选择的利用提供了理论依据。     

PCR-SSCP技术在动物育种中的研究进展

PCR—SSCP技术是新近发展起来的一种分子生物学分析方法，由于其广泛和潜在的应用价值，已被广泛应用于医学和其他生命科学的研究中。本文介绍了PCR—SSCP技术的发展、特点及其在动物遗传育种研究中的应用和发展前景。     

Technical note: use of PCR-single-strand conformation polymorphism analysis for detection of bovine beta-casein variants A1, A2, A3, and B.

We have optimized the polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism (PCR-SSCP) technique to screen the most frequent variants (A1, A2, A3, and B) of the bovine beta-casein gene. Five partly overlapping PCR products (233, 234, 265, 466, and 498 bp) of Exon VII of the beta-casein gene that encompass the target point mutations were heat-denatured, separated on nondenaturing polyacrylamide gels, and silver-stained. Simultaneous detection of all variants in reference samples of known genotypes (A1A2, A2A2, A1A3, A1B, and A2B) was best achieved on 17% polyacrylamide (100:1 acrylamide:bis-acrylamide ratio) gels with the PCR product of 234 bp. These results were confirmed by sequencing the allele-specific SSCP bands directly excised from polyacrylamide gels. A population of 65 anonymous samples belonging to various breeds was then analyzed twice, without discrepancies in a blind trial. Routine beta-casein genotyping using PCR-SSCP is proposed as a cost-effective, fast, and sensitive technique.     

Rapid and accurate typing of Dichelobacter nodosus using PCR amplification and reverse dot-blot hybridisation

Here we describe an approach to genotyping D. nodosus, based on variation in the fimbrial subunit gene (fimA), which uses polymerase chain reaction (PCR) amplification and hybridisation to immobilised oligonucleotides (PCR/oligotyping).The variable region of D. nodosus fimA, amplified and labelled with digoxigenin (DIG) in a single multiplex PCR amplification, was hybridised to a panel of group- and type-specific poly-dT tailed oligonucleotides that were immobilised on a nylon membrane strip. A mixture of positive control poly-dT tailed oligonucleotides was also included on the membrane. After hybridisation the membrane was washed to a defined specificity, and DIG-labelled fragments hybridising were detected with nitroblue tetrazolium (NBT) and 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (SCIP). The specificity of the oligonucleotides was verified by the lack of cross-reactivity with D. nodosus fimA sequences that had a single base difference. DNA from 14 footrot samples previously genotyped by PCR-SSCP/sequencing [Vet. Microbiol. 71 (2000) 113], was assayed using the PCR/oligotyping technique. All types of D. nodosus which had been detected previously with a PCR-SSCP/sequencing method were detected by this procedure. However, for three of the 14 footrot samples, PCR/oligotyping detected additional types of D. nodosus. Further PCR amplification using type-specific primers, confirmed that these types of the bacterium were present in the footrot samples. These results indicate that PCR/oligotyping is a specific, accurate, and useful tool for typing footrot samples. In combination with a rapid DNA extraction protocol, D. nodosus strains present in a footrot sample can be accurately identified in less than 2 days.     

中国家驴生长激素基因内含子2的遗传多样性分析

为了从分子水平揭示家驴的遗传多样性,本研究以中国7个家驴品种(临县驴、关中驴、新疆驴、广灵驴、淮北驴、德州驴、晋南驴)174个个体为试验动物,利用PCR-SSCP技术研究生长激素(GH)基因第2内含子的遗传多样性并进行序列分析.结果显示:第2内含子表现多态性,174个个体检测到3个单倍型,单倍型比例为1.7%.单倍型多样度以临县驴、淮北驴较高,分别为0.678和0.542.广灵驴与关中驴的单倍型多样度(Haplotype diversity,H)比较接近,分别为0.409和0.462.其次为德州驴和晋南驴,分别为0.355和0.304,新疆驴最低为0.077.对该片段的纯合型分别测序发现,B单倍型在第735位碱基G→C.A单倍型在869位碱基G→T.上述结果首次证实驴GH基因内含子2存在多态性.     

宁夏西门塔尔杂种牛UCP2基因多态性及其与生长性状的关联性分析

本研究利用PCR-SSCP技术结合DNA测序确定UCP2基因SNP位点,检测其在宁夏西门塔尔杂种牛群体中的多态性,并分析其与生长性状的关联性。结果表明,UCP2基因第1外显子存在3个SNPs位点,分别为T632C、A655G和A689C,结合PCR-SSCP结果分析后,分为AA、BB、AB 3种基因型。不同月龄体高、体重、胸围、体斜长,总体呈AA>AB>BB。AA基因型个体在不同月龄体高、胸围显著或极显著高于BB基因型（P < 0.05;P < 0.01）,与AB基因型之间存在差异,但差异不显著（P > 0.05）。可以确定,T632C位点发生的碱基突变对宁夏西门塔尔杂种牛的体重性状选育存在显著意义,AA基因型个体可作为后期选育方向。     

中国荷斯坦牛SCD1基因多态性与泌乳性状的关联分析

本研究旨在探索中国荷斯坦牛SCD1基因多态性与产奶性状的相关性.以上海某奶牛场610头中国荷斯坦牛为试验材料,采用PCR-SSCP法对SCD1基因A293V位点遗传多态性进行分析,利用一般线性模型分析SCD1基因A293V位点突变对测定日产奶量、乳脂率、乳蛋白率、305天校正产奶量、乳脂量、乳蛋白量及体细胞评分7个泌乳性状的影响.共检测到AA、AV和VV 3种基因型,频率分别为0.634、0.323和0.043,等位基因A和V的频率分别为0.796和0.204.该位点突变对乳脂率、乳蛋白率的影响达到显著水平(P＜0.05),对测定日产奶量、305天校正产奶量、305天乳蛋白量和305天乳脂量以及体细胞评分影响不显著(P＞0.05).多重比较表明,VV基因型个体的乳蛋白率、乳脂率极显著高于AA、AV型个体(P＜0.01).SCD1基因A293V位点突变对中国荷斯坦牛泌乳性状的遗传效应有一定程度的影响,但影响机理需要进一步的研究.     

鸡Nramp1基因多态性与部分免疫指标相关性分析

随机选取同期孵化出雏的中国地方鸡种如皋鸡和引进隐性白羽鸡72只和55只,测定部分免疫性状。利用PCR-SSCP技术检测如皋鸡和隐性白羽鸡Nramp1基因第9外显子的多态性,并对不同基因型与免疫性状进行相关分析。结果表明:如皋鸡与隐性白羽鸡H/L、淋巴细胞转化率和IgM含量均差异显著(P<0.05)。如皋鸡AA型的H/L显著低于BB型和AB型(P<0.05),而AA型的淋巴细胞转化率和IgM含量显著高于BB型(P<0.05)。隐性白羽鸡各基因型对免疫指标的影响与如皋鸡的趋势相同。该研究结果初步显示,如皋鸡的综合免疫性能优于隐性白羽鸡,AA基因型的综合免疫性能优于AB型和BB型。     

Correlation Analysis between UCP2 Gene and Growth Traits in Ningxia Hibrid Simmental Cattle

To find genotype with fast growth rates in Ningxia hibrid Simmental cattle,the genetic variation of UCP2 gene were detected by PCR-SSCP method and DNA sequencing,then analyzed UCP2 gene polymorphism related with some growth traits.The results showed that there were three SNPs (T632C,A655G and A689C) in UCP2 gene exon 1,which divided into AA,BB and AB genotypes by PCR-SSCP method.Individuals with different genotypes in different months of age,body weight,body height, chest circumference and body length were AA > AB > BB.AA genotype in different age of body height and chest circumference were significantly different than BB genotype (P < 0.05;P < 0.01),and were no significant difference with AB genotype (P > 0.05).The results demonstrated that T632C locus had significant meaning for improving weight trait breeding of Ningxia hibrid Simmental cattle,AA genotype could be the breeding genotype.